Name: 생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 생체 내 고해상도 칼슘 이미징 기법으로 신경 세포 내 칼슘 동역학을 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 노화 및 신경퇴행성 질환 연구에 활용될 수 있습니다.

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이 작업은 국립 보건원 (NIH) (R01-NS115947이 F. Hoerndli에게 수여됨)의 지원을 받았습니다. 또한 pAS1 플라스미드에 대해 Attila Stetak 박사에게도 감사드립니다.

1. 형질전환 균주 생성
<ol><li>선택8,9의 클로닝 방법을 사용하여, 발현 벡터를 복제하여 Pflp-18 또는 Prig-3 프로모터(복부 신경줄의 AVA 특이적 신호에 대해), 선택의Ca2+ 지표, 그 다음 3' UTR(자세한 내용은 논의 참조)10. 플라스미드 및 그 공급원의 목록은 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>Ca 2+ 지표 이식유전자(~20ng/μL) 및 구조 DNA lin-15+(선택 마커)를 포함하는 DNA 믹스(<100ng/μL, 각 플라스미드의 농도는 보충 표 1 참조)를 통해 형질전환 균주를 생성하기 위해 확립된 프로토콜을 따르십시오. 린-15(N765TS); 표현형: 다중 외음부)10,11. 메모. lin-15(n765ts) 부모를 15°C로 유지하여 온도에 민감한 돌연변이를 억제합니다.</li>
	<li>F1 자손이 성체가 될 때까지 주입된 부모를 20°C로 유지하여 다중 외음부 표현형의 부재를 사용하여 형질전환 선택을 허용합니다.</li>
	<li>클론 계대(13 )와 같은 다외음부 표현형을 갖지 않는 성인 F1 자손은Ca2+ 지시인자를 포함하는 염색체외 배열의 발현을 나타낸다(11).</li>
	<li>섹션 3의 뒷부분에 설명된 대로 생후 1일 된 성인을 장착하고 이미징하여 다중 외음부 표현형을 갖지 않는 F2 또는 F3 자손에서 Ca2+ 지표의 발현을 평가합니다. 메모. 여기에 설명된 대로 이미지의 빠른 획득을 위해서는 상대적으로 높은 인디케이터 표현이 필요합니다(자세한 내용은 논의 참조).</li>
	<li>Ca 2+ 지표의 최적 발현으로 형질전환 균주의 후속 세대에 대한 실험을 수행하고(자세한 내용은 논의 참조), 균주를 표준 조건(NGM 플레이트에서20 °C)12 하에서 유지합니다.</li>
</ol>2. 광학 설정
<ol><li>장기간 타임랩스 이미징이 가능한 현미경을 사용하십시오. 메모. 대표적인 데이터는 488nm 및 561nm 여기 레이저가 장착된 도립 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 획득되었습니다.</li>
	<li>웜의 조잡한 위치를 파악하기 위해 저배율 대물렌즈(예: 10x/0.40)를 사용합니다.</li>
	<li>세포 내 분해능을 달성하려면 고배율 대물렌즈를 사용하여 뉴런으로 전환하고 위치를 파악합니다. 메모. 이 연구에서 대표 데이터를 얻기 위해 100x/1.40 NA 오일 대물렌즈가 사용되었습니다.</li>
	<li>빠른 이미지 획득(>50fps)이 가능한 초고감도 카메라를 사용하여 이미지를 획득합니다.</li>
	<li>선택한 Ca2+ 표시기에 대해 표준 방출 필터를 사용하십시오(즉, GCaMP6f 및 mitoGCaMP에 대해 525nm ± 50nm 방출 필터).</li>
	<li>이미징 세션 동안 한천 패드가 건조되면 신경돌기가 몇 초 이내에 초점에서 벗어날 수 있으므로 10초보다 긴 이미지 스트림을 획득하기 위해 Z-드리프트 교정기(ZDC)를 추가합니다. 메모. 현미경 설정에서 ZDC를 허용하지 않거나 긴(>20분) 이미징 기간이 필요한 경우 한천 패드 주위에 실리콘 그리스 또는 녹은 바셀린의 테두리를 적용하여 건조 속도를 늦춥니다.</li>
</ol>3. 이미징 용 웜 준비
<ol><li>한천 패드 준비<ol><li>13mm x 100mm 유리 배양 튜브에 M912 에 분자 등급 한천을 용해하고 몇 초 동안 전자레인지에 돌려 10% 한천 3mL를 만듭니다( 재료 표 참조). 메모. 용융된 한천은 최대 1시간 동안 열 블록에 보관하거나 한천 패드가 필요할 때마다 신선하게 만들 수 있습니다.</li>
		<li>각각 두 겹의 실험실 테이프가 있는 두 개의 추가 슬라이드 사이에 현미경 슬라이드를 놓습니다(그림 1A-i 참조).</li>
		<li>1,000 μL 피펫 팁의 끝 부분(필터 없음)을 잘라서 중앙 커버슬립에 작은 한천 방울을 피펫팅하는 데 사용합니다(그림 1A-i).</li>
		<li>한천 상단의 다른 슬라이드를 아래로 눌러 한천을 평평하게 합니다(그림 1A-ii).</li>
		<li>식힌 후 13mm x 100mm 유리 배양 튜브(그림 1A-iii)의 개구부를 사용하여 한천을 작은 디스크로 자른 다음 주변 한천을 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>웜롤링 솔루션 준비<ol><li>Muscimol 분말을 M9에 용해시켜 30mM 스톡을 만듭니다. 분취량 50 μL로 분리하고, 4°C에서 보관한다.</li>
		<li>3-5일마다 30mM muscimol의 새 분취량을 해동합니다(사용 중 20°C에서 보관).</li>
		<li>30mM muscimol 스톡을 폴리스티렌 비드로 1:1 비율로 희석하여 롤링 용액을 만듭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이미징을 위한 웜 위치 지정<ol><li>롤링 용액 1.6μL를 한천 패드 중앙에 놓습니다. 알림: 액체의 양은 더 어린(적은) 또는 나이든 동물(더 많이)을 이미징하기 위해 조정되어야 합니다.</li>
		<li>바람직한 웜 픽(즉, 유리 또는 백금 와이어 픽)13을 사용하여, 다외음부 표현형(11)이 없는 원하는 나이의 웜을 한천 패드의 롤링 용액으로 옮깁니다(그림 1A-iv). 메모. 대표적인 데이터는 1일 된 자웅동체(GCaMP6f 균주 = FJH185; mitoGCaMP 균주; FJH597; 보충 표 1 참조), 이는 단 한 줄의 알의 존재로 식별 할 수 있습니다. 다양한 연령대의 웜 작업에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.</li>
		<li>muscimol이 웜 움직임을 줄일 때까지 ~5분 동안 기다린 다음 한천 패드 위에 22mm x 22mm 커버슬립을 떨어뜨려 웜 움직임을 물리적으로 제한합니다.</li>
		<li>복부 신경줄의 신경돌기를 영상화하려면 커버슬립을 가볍게 밀어 그림 1B,C에 표시된 방향으로 벌레를 굴립니다. 메모. 복부 신경줄을 시각화하려면 머리가 위로 향하도록 웜을 배치하고 장이 근위 부분의 오른쪽에, 웜의 원위 부분에 왼쪽이 될 때까지 웜을 굴립니다 (시청자의 관점에서). 이 방향을 반전시킵니다(그림 1C) 등쪽 신경줄의 신경돌기를 이미징합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>현미경에 웜 장착<ol><li>현미경에 장착하기 전에 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.tage.</li>
		<li>명시야에서 저배율 대물렌즈(10x) 대물렌즈를 사용하여 웜을 찾습니다.</li>
		<li>100x 대물렌즈로 전환하고 초점을 조정합니다.</li>
		<li>488nm 이미징 레이저와 함께 GCaMP 또는 mitoGCaMP의 조명을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾습니다. 알림: 웜이 찌그러지거나 커버슬립이 당겨지지 않도록 약간의 조정을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 고해상도 이미지 스트림 획득
<ol><li>생체 내 GCaMP 이미징<ol><li>노출 시간을 20ms로 설정합니다.</li>
		<li>기본 GCaMP 형광이 카메라 다이내믹 레인지14의 중간 범위에 있을 때까지 이미징 레이저 및 획득 설정을 조정합니다. 다른 현미경 설정을 사용하여 이미징 매개변수를 최적화하는 방법에 대한 제안은 토론을 참조하십시오. 메모. 이 연구에 사용된 광학 설정의 경우 488nm 이미징 레이저를 레이저 출력 = 50% 및 감쇠 = 1 출력 설정으로 설정합니다. 추가 획득 설정을 EM 게인 = 200 및 프리앰프 게인 = 1로 수정합니다.</li>
		<li>100x 배율에서 GCaMP 형광을 사용하여 AVA 신경돌기를 찾은 후 ZDC( 재료 표 참조)를 ±30μm 범위로 설정하고 연속 자동 초점을 시작합니다. 이미징하기 전에 필요에 따라 초점면을 수동으로 수정하십시오.</li>
		<li>100x 배율로 이미지 스트림을 획득합니다. 이 연구에 사용된 설정으로 최대 10분의 지속 시간을 달성할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>생체 내 mitoGCaMP 이미징<ol><li>필요에 따라 4.1.1-4.1.2 단계에 따라 카메라의 다이내믹 레인지14에 대한 중간 범위에서 기본 mitoGCaMP 형광을 획득합니다. 메모. 이 연구에 사용된 광학 설정의 경우 488nm 이미징 레이저를 레이저 출력 = 20% 및 감쇠 = 10 출력 설정으로 설정합니다. 획득 설정을 EM 게인 = 100 및 프리앰프 게인 = 2로 수정합니다.</li>
		<li>AVA 신경돌기 내의 미토콘드리아가 mitoGCaMP 형광을 이용하여 위치하게 한 후, 단계 3.3에서 상술한 바와 같이 ZDC를 설정한다.</li>
		<li>100x 배율로 이미지 스트림을 획득합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 이미지 스트림 분석
<ol><li>이미지 계열의 픽셀 값을 분석하기 위해 적절한 이미지 소프트웨어에서 이미지 스트림을 엽니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>다각형 선택 도구를 사용하여 GCaMP 또는 mitoGCaMP를 포함하는 관심 영역(ROI)을 정의합니다.</li>
	<li>> 도구 분석 > ROI 관리자를 클릭합니다. ROI 관리자에서 Add(추가)를 클릭한 다음 More(추가)> Multi Measure(다중 측정)를 클릭합니다. 다중 측정 창에서 확인을 클릭하여 추가 분석을 위해 이미지 스트림의 각 프레임에 대해 위에서 정의한 ROI의 평균, 최소 및 최대 픽셀 강도를 자동으로 수집합니다. 메모. 평균 픽셀 강도(Favg)는 z-평면에서의 포지셔닝으로 인한 형광 차이를 설명하기 위해 비율Favg/Fmin을 사용하여 각 ROI에 대한 최소 강도(Fmin)로 정규화하는 것이 좋습니다. 이미징 중에 웜 움직임이 있는 이미지 스트림은 형광 측정에도 영향을 미치므로 폐기하십시오.</li>
</ol>

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<li>Müller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+regulation+as+basis+of+neurodegeneration+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 470(2018).</li>
<li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+in+aging+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis in aging neurons.</a> Frontiers in Genetics. 3, 200(2012).</li>
<li>Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+aging%3A+Learning+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Signaling%22%5BJournal%5D)">Neuronal aging: Learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14(2013).</li>
<li>Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+lifelong+high-resolution+and+high+throughput+imaging+of+subtle+aging+phenotypes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans.</a> Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).</li>
<li>Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+acoustic+wave+microfluidics+for+repetitive+and+reversible+temporary+immobilization+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans.</a> Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

설명된 방법을 구현할 때 첫 번째 고려 사항은 주어진 연구 질문에 대해 이상적인 특성을 가진Ca2+ 지표를 선택하는 것입니다. 세포질 Ca2+ 지표는 전형적으로 Ca2+에 대해 높은 친화도를 가지며,Ca2+에 대한 이들 지표의 민감도는 동역학(on/off rate)16,17과 반비례한다. 이는 Ca2+ 감도 또는 동역학이 관심 현상에 따라 우선 순위를 지정해야 함을 의미합니다. ER과 같이 상대적으로 높은 기저 Ca2+ 수준을 갖는 세포하 구획의 경우, 낮은Ca2+ 친화도를 갖는Ca2+ 지표가 고려되어야 한다18. Ca2+ 지표의 세포-특이적 발현을 위한 재조합 DNA를 생성하기 위해, 바람직한 클로닝 기술은...

칼슘 이온(Ca2+)은 많은 세포 유형에서 매우 다재다능한 정보 전달체입니다. 뉴런에서,Ca2+는 신경전달물질의 활성-의존적 방출, 세포골격 운동성의 조절, 대사 과정의 미세 조정, 그리고 적절한 뉴런 유지와 기능에 필요한 다른 많은 기전을 담당한다 1,2. 효과적인 세포내 신호전달을 보장하기 위해, 뉴런은 세포질에서 낮은 기저 Ca2+ 수준을 유지해야 한다3. 이것은 소포체(ER) 및 미토콘드리아와 같은 세포 기관으로의 Ca2+ 흡수를 포함하는 협력적 Ca2+ 처리 메커니즘에 의해 달성됩니다. 이러한 과정은, 원형질막에서 Ca2+-투과성 이온 채널의 배열에 더하여, 뉴런 전체에 걸쳐 이질적인 수준의 세포질Ca2+를 초래한다.
휴지기 및 뉴런 활성화 동안 Ca2+ 이질성은Ca2+-의존적 메카니즘의 다양한, 위치-특이적조절을 허용한다1. Ca2+의 농도-특이적 효과의 한 예는 이노시톨 1,4,5-삼인산(InsP3) 수용체를 통해 ER로부터Ca2+의 방출이다. InsP3와 조합된 낮은 Ca2+ 수준은 수용체의 칼슘 투과성 기공을 여는 데 필요합니다. 대안적으로, 높은Ca2+ 수준은 수용체4를 직접 및 간접적으로 억제한다. 적절한 뉴런 기능을 위한 Ca2+ 항상성의 중요성은 세포내Ca2+ 처리 및 신호전달의 중단이 신경퇴행성 장애 및 자연노화의 발병기전의 초기 단계임을 시사하는 증거에 의해 뒷받침된다 5,6. 특히, ER 및 미토콘드리아에 의한 비정상적인 Ca2+ 흡수 및 방출은 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병에서 뉴런 기능 장애의 발병과 관련이 있다 6,7.
자연 노화 또는 신경변성 동안 Ca2+ 항상성 이상에 대한 연구는 천연 세포 구조(즉, 시냅스의 배열 및 이온 채널의 분포)가 유지되는 살아 있는 온전한 유기체에서 세포하 분해능을 갖는Ca2+ 수준의 종단적 관찰을 필요로 한다. 이를 위해, 이 프로토콜은 높은 공간 및 시간 분해능으로 생체 내에서 Ca2+ 역학을 기록하기 위해 쉽게 이용가능한, 유전적으로 인코딩된 2개의 Ca2+ 센서의 사용에 대한 지침을 제공한다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)에 기술된 방법을 사용하여 얻은 대표적인 결과는 단일 뉴런의 세포질 또는 미토콘드리아 기질에서Ca2+ 지표의 발현이 단일 척추 유사 구조 및 개별 미토콘드리아 내에서 Ca2+ 수준을 식별하는 추가 능력과 함께 Ca2+ 역학을 설명하는 형광 이미지(최대 50Hz)의 신속한 획득을 허용할 수 있는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>100x/1.40 오일 목표&nbsp; &nbsp;</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp; UPlanSApo</td></tr><tr><td>10x/0.40 목표&nbsp;</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td></td><td>&nbsp; UPlanSApo</td></tr><tr><td>22mm x 22mm 커버 유리&nbsp;</td><td>폭스바겐&nbsp;</td><td>48366-227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 SFR&nbsp;</td><td>폭스바겐&nbsp;</td><td>J234-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>빔 균질화기</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>Borealis가 CSU-X1</td></tr><tr><td>CleanBench 실험실 테이블로 업그레이드되었습니다.</td><td>티엠씨&nbsp;</td><td></td><td>진동 제어 기능이 있는</td></tr><tr><td>일회용 배양 튜브</td><td>VWR&nbsp;</td><td>47729-572</td><td>&nbsp; 13 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>환경 챔버</td><td>Thermo Scientific</td><td>3940</td><td>20 &deg로 설정; C</td></tr><tr><td>필터 휠 또는 슬라이더</td><td>ASI</td><td></td><td>25mm 직경 필터용</td></tr><tr><td>FJH 185</td><td>Caenorhabditis Genetics Center&nbsp;</td><td>FJH 185</td><td>웜 균주</td></tr><tr><td>FJH 597</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>FJH 597</td><td>웜 균주</td></tr><tr><td>GFP 대역통과 방출 필터&nbsp;</td><td>크로마&nbsp;</td><td></td><td>525 > 50 nm&nbsp;( 25 mm 직경)</td></tr><tr><td>ILE 레이저 결합기&nbsp;</td><td>안도르 테크놀로지스&nbsp;</td><td></td><td>4개의 레이저 라인&nbsp;</td></tr><tr><td>ILE 솔리드 스테이트 488 nm 레이저</td><td>Andor Technologies&nbsp;</td><td></td><td>50 mW</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>버전 1.52a</td></tr><tr><td>IX83 회전 디스크 컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td></td><td>Yokogawa CSU-X1 회전 디스크</td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD 카메라 포함&nbsp;</td><td>안도르 테크놀로지스&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>낮은 자동 형광 이멀젼 오일&nbsp;</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td>Z-81226</td><td></td></tr><tr><td>메타모프&nbsp;</td><td>분자 소자&nbsp;</td><td></td><td>버전 7.10.1&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 제어 상자</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX3-CBH</td></tr><tr><td>Muscimol&nbsp;</td><td>MP 바이오메디컬&nbsp;/ 시그마</td><td>02195336-CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pAS1</td><td>AddGene</td><td>194970</td><td>플라스미드</td></tr><tr><td>pBSKS</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCT61</td><td></td><td></td><td>플라스미드는 요청 시 Hoerndli/Maricq 실험실에서 제공</td></tr><tr><td>pJM23</td><td></td><td></td><td>플라스미드는 요청 시 Hoerndli/Maricq 실험실에서 제공</td></tr><tr><td>pKK1&nbsp;</td><td>애드진&nbsp;</td><td>194969</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>Polybead 마이크로스피어&nbsp;</td><td>폴리사이언스 Inc.&nbsp;</td><td>00876-15</td><td>&nbsp; 0.094 &마이크로; m</td></tr><tr><td>안정성 챔버</td><td>Norlake Scientific</td><td>NSRI241WSW/8H</td><td>15로 설정 &deg; C</td></tr><tr><td>스테이지 컨트롤러</td><td>ASI</td><td></td><td>필터 휠 컨트롤이 있는</td></tr><tr><td>표준 현미경 슬라이드</td><td>Premiere</td><td>9108W-E</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>터치 패널 컨트롤러</td><td>Olympus</td><td></td><td>I3-TPC</td></tr><tr><td>Z-drift 교정기&nbsp;</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td></td><td>IX3-ZDC2</td></tr></tbody></table>

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

칼슘(Ca2+) 이미징은 뉴런 활동을 조사하는 데 주로 사용되어 왔지만, 세포내Ca2+ 처리가 세포내 신호전달의 중요한 구성 요소라는 것이 점점 더 분명해지고 있습니다. 생체 내에서 세포 내 Ca2+ 역학의 시각화는 뉴런이 원래의 온전한 회로에서 연구될 수 있으며, 복잡한 신경계에서 기술적으로 어려운 것으로 입증되었습니다. 선충 Caenorhabditis elegans의 투명성과 비교적 단순한 신경계는 형광 태그 및 지표의 세포 특이적 발현 및 생체 내 시각화를 가능하게 합니다. 이들 중에는 세포질뿐만 아니라 미토콘드리아와 같은 다양한 세포 내 구획에서 사용하도록 변형 된 형광 지표가 있습니다. 이 프로토콜은 개별 수지상 가시 및 미토콘드리아 수준까지 Ca 2+ 역학을 분석할 수 있는 세포 내 분해능으로 생체 내에서 비비율계량 Ca2+ 이미징을 가능하게 합니다. 여기서, 상이한 Ca2+ 친화도를 갖는 2개의 이용가능한 유전적으로 암호화된 지표가 단일 쌍의 흥분성 중간 뉴런 (AVA)에서 세포질 또는 미토콘드리아 매트릭스 내의 상대적Ca2+ 수준을 측정하기 위한 이 프로토콜의 사용을 입증하기 위해 사용된다. 예쁜꼬마선충에서 가능한 유전자 조작 및 종단 관찰과 함께 이 이미징 프로토콜은 Ca2+ 처리가 신경 기능과 가소성을 조절하는 방법에 관한 질문에 답하는 데 유용할 수 있습니다.

이 두 가지 프로토콜은 높은 공간 분해능으로 생체 내 개별 신경돌기의 세포 내 영역 및 세포 기관 내에서 차등 Ca2+ 수준을 빠르게 획득할 수 있도록 합니다. 첫 번째 프로토콜은 높은 시간적 및 공간적 분해능으로 세포질Ca2+의 측정을 허용합니다. 이것은 신경돌기가 복부 신경줄의 전체 길이를 달리는 글루타메이트성 AVA 명령 중간 뉴런15에서 GCaMP6f의 세포 특이적 발현을 사용하여 여기에서 입증됩니다. GCaMP6f 형광(50Hz)의 신속한 획득을 통해 Ca 2+ 유입의 방향 전파를 검출할 수 있었습니다(그림 2A 및 보충 비디오 1). GCaMP6f 형광의 세포내 정량화는Ca2+ 유입의 시작이 단지 10μm 떨어진 신경돌기의 일부에서 지연된다는 것을 밝혀냈습니다(그...

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

이 기술은 뉴런의 칼슘 처리에 대한 우리의 이해와 구획화된 칼슘이 생체 내에서 뉴런 기능에 중요한 다양한 메커니즘을 조절할 수 있는 방법을 향상시키는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 형광 도구와 결합할 수 있는 예쁜꼬마선충의 생리학적 조건에서 더 높은 해상도의 빠른 생체 내 이미징을 허용한다는 것입니다. 이 기술은 다양한 맥락에서 뉴런의 칼슘 신호 전달을 조절하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.예를 들어, 노화, 신경 손상 및 신경 퇴행 중. 이 절차를 시연하는 것은 연구 기술자인 Ennis Deihl이 될 것입니다. Kaz Knight, PhD 후보자, Rachel Doser, 내 연구실의 박사후 연구원.프로모터, 칼슘 지표 및 선택된 3개의 프라임 UTR을 포함하는 발현 벡터를 클로닝하는 것으로 시작합니다. 칼슘 지표 이식유전자에 구조 DNA Lin-15 plus를 포함하는 DNA 혼합물을 생후 1일 된 성인 C.elegans의 생식선에 미세주입하여 형질전환 예쁜꼬마선충 균주를 만듭니다. F1 자손이 성체가 될 때까지 주입된 부모 벌레를 섭씨 20도로 유지하십시오.다중 외음부 표현형의 부재를 스크리닝하여 형질전환 성인을 선택합니다. 이는 칼슘 지시약을 포함하는 여분의 염색체 배열의 발현을 나타낸다. 다외음부 표현형을 갖지 않는 클론 계대 성인 F1 자손.칼슘 지표의 최적 발현으로 형질전환 균주의 후속 세대에 대한 실험을 수행합니다. 장기간 타임랩스 이미징이 가능한 현미경을 사용하십시오. 저배율 대물렌즈 아래에서 웜을 찾은 다음 고배율 대물렌즈로 전환하여 뉴런의 위치를 파악합니다.50FPS 이상의 빠른 이미지 획득이 가능한 초고감도 카메라를 사용하여 이미지를 획득합니다. 다음으로 칼슘 표시기에 표준 배출 필터를 사용하십시오. 10초보다 긴 이미지 스트림을 획득하기 위해 Z-드리프트 보정기를 추가합니다.13 x 100mm 유리 배양 튜브에서 분자 등급 한천을 M9에 용해시켜 10% 한천 3밀리리터를 준비하고 전자레인지에 몇 초 동안 돌립니다. 한천 패드를 만들려면 먼저 두 겹의 실험실 테이프를 추가하여 두 개의 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 두 슬라이드 사이에 현미경 슬라이드를 놓습니다.1000마이크로리터 피펫 팁의 끝을 자르고 이를 사용하여 커버 슬립 중앙에 작은 한천 방울을 피펫팅합니다. 한천 위에 다른 슬라이드를 눌러 한천을 평평하게 합니다. 냉각 후, 10 밀리리터

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

의 연결을 네트워크를 개발 자발적인 활동은 칼슘에 민감한 지표 염료의 AM - 에스테르 양식을 사용하여 측정할 수 있습니다. 의 연결을 활성화를 나타내는 세포 내 칼슘의 변화는 하나 또는 두 개의 광자 이미징과 형광 표시기에 일시적 변화로 감지됩니다. 이 프로토콜은 발달 종속의 연결 네트워크의 범위에 대해 적용할 수...

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

장 신경계(ENS)는 장 반사를 제어하는 장 벽에 위치한 뉴런과 신경교세포의 네트워크입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 이미징을 사용하여 ENS의 실시간 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 기록하는 방법을 설명합니다.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

이 프락토콜은 성상세포와 뉴런에서 생체 외 및 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

세포 칼슘 이미징은 독특한 기능적 시그니처를 제공하는 칼슘 투과성 채널 / 수용체의 발현을 기반으로 개별 세포, 배양 또는 각성 동물의 혼합 집단에서 동적 신호 전달을 연구하는 다목적 방법론입니다.

칼슘 이미징 기술로 뉴런-글리아 회로의 변화 시각화

배우세요 Caenorhabditis elegans를 이용한 생체 내 고해상도 칼슘 이미징 기법으로 신경 세포 내 칼슘 동역학을 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 노화 및 신경퇴행성 질환 연구에 활용될 수 있습니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

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