Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

TEM의 분산된 분포와 제한된 시야 범위는 인프라 분석에 어려움을 초래합니다. 이 프로토콜은 기존 접근 방식을 능가하는 혁신적이고 효율적인 시료 전처리 방법을 제시합니다. 이 고급 TEM 시료 전처리 방법은 후속 탈수 중에 시료가 평평하게 유지되도록 하여 기존 방법에 비해 시료의 말림을 방지하는 데 더 효과적입니다.

시약의 선택과 투여량 조정은 시료 유형에 따라 필요해야 합니다. 시료 전처리 공정에는 많은 독성 화학 시약이 사용됩니다. 이 절차를 시연하는 것은 Dr.Gan Guangming 실험실의 석사 학생인 Sheng Qingyuan입니다.

먼저, 1월 용액에서 방황하는 후기 3번째 인스타 초파리 유충을 해부하고 표준 절차에 따라 전신 벽을 얻습니다. 섭씨 4도에서 밤새 해부실에서 정착액으로 유충 체벽을 고정합니다. 다음 날, 해부실에서 유충 체벽을 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 카코딜산나트륨 완충액으로 여러 번 헹굽니다.

유충 몸체 벽을 1% 오스뮴 테트라옥사이드로 2시간 동안 고정합니다. 고정 후 샘플을 증류수로 여러 번 세척하십시오. 2%의 포화 소변 아세테이트 용액을 튜브에 추가하여 PHI 신경근 접합부를 염색합니다.

그리고 2시간 후 탈이온수로 샘플을 헹굽니다. 다음으로 가위를 사용하여 기공 크기가 270 미크론인 두 개의 둥근 금속 메쉬 조각을 자릅니다. 바닥이 평평한 병의 바닥에 금속 메쉬를 놓습니다.

그런 다음 고정 된 유충을 메쉬에 놓은 다음 다른 메쉬를 놓습니다. 섭씨 4도에서 각각 20분 동안 증가하는 에탄올 농도로 샘플을 탈수합니다. 그런 다음 샘플을 프로필렌 옥사이드로 실온에서 각각 5분 동안 두 번 헹굽니다.

다음으로, 샘플을 프로필렌 옥사이드와 에폭시 수지 용액에 넣은 다음 순수한 에폭시 수지를 실온에서 2시간 동안 넣습니다. 임베딩을 위해 폴리에틸렌 필름을 큰 정사각형과 작고 속이 빈 직사각형 지지대로 자릅니다. 작은 사각형을 큰 사각형에 붙입니다.

큰 사각형의 중앙에 충분한 에폭시 수지를 추가합니다. 그런 다음 스테레오스코프를 켜고 근육 쪽이 위쪽을 향하도록 하여 미리 배치된 에폭시 수지에 샘플을 놓습니다. 샘플에 에폭시 수지를 몇 방울 떨어뜨리고 폴리에틸렌 필름으로 덮습니다.

중합을 위해 샘플을 각각 24시간 동안 증가된 온도에 놓습니다. 중합 후 날카로운 칼날을 사용하여 A2 및 A3 세그먼트를 포함한 사다리꼴을 유지하면서 유충 몸체의 초과 부분을 제거합니다. 남은 유충 몸체 벽에서 사다리꼴을 제거하고 AB 접착제로 수지가 채워진 캡슐에 부착합니다.

광학 현미경으로 A2 및 A3 세그먼트의 여섯 번째 및 일곱 번째 근육의 위치를 확인하고 접선 평면을 여섯 번째 근육과 평행하게 유지합니다. 그런 다음 A3 세그먼트의 양면을 따라 샘플의 1/5을 잘라냅니다. 마이크로톰을 사용하여 여섯 번째 근육에서 시작하여 샘플의 매우 얇은 부분을 준비합니다.

절단 후 각 구리 메쉬에 가능한 한 많은 슬라이스를 부착합니다. 투과 전자 현미경을 사용하여 샘플을 관찰하십시오. Lowicryl K4M 수지와 에폭시 수지 중에서, Lowicryl K4M 수지는 초파리 신체 근육의 더 선명하고 쉽게 관찰할 수 있는 결과를 제공하였다.

공초점 이미징은 여섯 번째 근육과 일곱 번째 근육 사이의 신경근 접합부의 향상된 시각화를 보여주었습니다. 투과 전자 현미경은 구슬 모양의 신경근 접합부를 밝혀 향상된 시냅스 구조 정보를 제공했습니다. 샘플은 금속 메쉬의 제한으로 인해 탈수 과정 내내 평평하게 유지되었습니다.

게다가, 샘플은 플라스틱 제품 사이에서 중합되어 샘플이 접히는 것을 방지했습니다. 앞으로 TEM 시료 전처리 방법은 뇌 및 복부 신경삭 신경에 적용될 수 있어 초구조적 연구의 잠재력을 높일 수 있습니다.