TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

이온 채널은 생물학적 막에서 고정되어 있지 않습니다. 여기에서 우리는 측면 막 확산과 이온 채널 기능 사이의 연관성을 밝히기 위한 단일 분자 광학 접근 방식을 제시합니다. 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 측면 이동 및 기능을 방해할 수 있는 단백질의 형광 표지가 필요하지 않다는 것입니다.

이 방법은 자유 또는 제한된 확산이 조직 및 기능에 중요한 모든 막 단백질 채널에 적용할 수 있습니다. 먼저 380마이크로리터의 DPhPC 원액을 유리 바이알에 옮기고 지질 원액을 아르곤 또는 질소 가스로 덮어 지질 산화를 방지합니다. 지질이 용해된 유기 용매가 증발하거나 바이알에서 용매 스프레이가 튀는 것을 방지하기 위해 가능한 가장 낮은 가스 흐름을 사용하십시오.

질소 흐름에서 지질 샘플을 건조하고 오일 프리 진공 펌프를 사용하여 진공 상태에서 지질 샘플에서 남은 유기 용매를 밤새 제거합니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 동일한 부피의 헥사데칸과 실리콘 오일을 첨가하여 헥사데칸 실리콘 오일 용액에 지질 필름을 용해시켜 밀리리터당 9.5밀리그램의 최종 지질 농도로 합니다. 유리 커버슬립을 스테인리스 스틸 커버슬립 홀더에 넣고 초음파 세척기의 아세톤으로 약 10분 동안 유리 비커에서 청소합니다.

이중 탈이온수로 커버슬립을 헹구고 질소 흐름으로 건조시킵니다. 또한, 플라즈마 클리너에서 커버 슬립을 5 분 동안 산소로 세척하고 수소화합니다. 스핀 코터에 플라즈마 처리된 커버슬립을 장착하고, 30초 동안 3, 000 RPM에서 200 마이크로리터 피펫으로 가열된 0.75% 저융점 아가로스 140마이크로리터를 서서히 첨가하여 커버슬립을 서브 마이크로미터 두께의 아가로오스 필름으로 코팅한다.

아가로스 하이드로겔의 얇은 층이 있는 스핀 코팅된 커버슬립을 PMMA 챔버의 아래쪽에 즉시 부착합니다. 아가로스 하이드로겔이 위쪽을 향하도록 합니다. 커버슬립의 가장자리를 투명 접착 테이프로 PMMA 미세 가공 장치에 고정하고 섭씨 35도로 가열된 열판에 장치를 놓습니다.

2.5%agarose 용액 200마이크로리터를 기포를 생성하지 않고 챔버의 입구에 조심스럽게 붓습니다. PMMA 챔버의 웰에서 스핀 코팅된 아가로스의 탈수를 피하기 위해 아가로스 오일 계면에서 지질 단층 형성을 시작하기 위해 약 60 마이크로리터의 지질 오일 용액으로 PMMA 챔버의 웰을 즉시 덮습니다. 장치를 섭씨 35도의 핫플레이트에 약 2시간 동안 놓습니다.

약 20 마이크로리터의 지질 헥사데칸 실리콘 오일 용액을 액적 배양 챔버의 여러 미세 가공 웰 각각에 배치합니다. 수직 또는 수평 마이크로피펫 풀러를 사용하여 팁 개구부 직경이 약 20마이크로미터인 미세모세관 유리 바늘을 준비합니다. 8.8 밀리몰 HEPES, 7 마이크로 몰의 형광 염료, Fluo-8, 400 마이크로 몰 EDTA, 1.32 몰 염화칼륨 및 30 나노 몰 TOM 코어 복합체 또는 대안적으로 20 나노 몰 OMPF를 포함하는 약 5 마이크로 리터의 수성 주입 용액으로 바늘을 채 웁니다.

피에조 구동 나노 인젝터에 수성 주입 용액으로 바늘을 장착하고 나노 인젝터를 사용하여 지질 헥사 데칸 실리콘 오일 용액으로 채워진 액적 배양 챔버의 웰에 100-200 나노 리터의 수성 방울을 주입합니다. 섭씨 35도로 가열된 핫 플레이트 상에서 PMMA 및 액적 배양 챔버를 유지함으로써 약 2시간 동안 액적 오일 계면에서 지질 단분자층의 형성을 허용한다. 10마이크로리터 일회용 폴리프로필렌 팁이 있는 단일 채널 마이크로리터 피펫을 사용하여 액적 배양 챔버의 웰에서 PMMA 챔버의 웰로 개별 수성 방울을 수동으로 옮깁니다.

액적이 하이드로겔-오일 계면에서 지질 단층 상으로 가라앉도록 하여 액적과 아가로스 하이드로겔 사이에 지질 이중층을 형성합니다. 도립 광학 현미경의 샘플 홀더에 액적 인터페이스 이중층 또는 DIB 멤브레인이 있는 PMMA 챔버를 장착하고 10x Hoffman 변조 대비 대물렌즈를 사용하여 멤브레인 형성을 평가합니다. DIB 멤브레인이 형성된 경우 EPIOORESCENCE 조명용 기존 광원, 488나노미터 레이저 및 이면조사형 전자 곱셈 CCD 카메라가 장착된 TIRF 현미경의 샘플 홀더에 PMMA 챔버를 장착하여 약 0.16마이크로미터의 픽셀 크기를 달성합니다.

GFP 필터 세트를 사용하여 고강도 광원으로 에피형광 조명 아래에서 10x 배율 대물렌즈로 DIB 멤브레인의 가장자리를 초점을 맞춥니다. 100x NA 1.49 아포크로매틱 오일 TIRF 대물렌즈를 사용하여 고배율로 DIB 멤브레인의 동일한 가장자리를 미세 초점화하고, GFP 필터 세트를 사용하여 고강도 광원으로 에피형광 조명 아래에서 다시 초점을 맞춥니다. 필터 설정을 GFP에서 쿼드 밴드 TIRF 필터 세트로 변경하고, 488나노미터 레이저를 켜고, 대물 렌즈의 레이저 강도를 설정합니다.

단일 이온 채널을 시각화하려면 DIB 멤브레인의 개방 이온 채널이 어두운 배경에 고대비 형광 반점으로 나타나고 신호 대 배경 비율이 최대에 도달하도록 TIRF 각도와 EM CCD 카메라 게인을 조정합니다. 단일 이온 채널을 통한 칼슘 이온 플럭스에 해당하는 지점이 초점을 유지하고 중앙에서 강도가 높고 주변으로 갈수록 점차 감소하는 둥근 모양을 갖도록 합니다. 이온 채널이 DIB 멤브레인으로 재구성되고 멤브레인 평면에서 측면으로 이동하는지 확인하기 위해 형광 스팟에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다.

마지막으로, 위치를 적절하게 추적하고 개별 이온 채널의 개방-폐쇄 상태를 모니터링할 수 있는 일련의 멤브레인 이미지를 기록합니다. 측면 이동성의 유형과 채널 활동 상태를 결정하려면 충분히 길고 잘 샘플링 된 궤적을 획득하십시오. Neurospora crassa TOM-CC의 Cryo EM 구조는 여기에 나와 있습니다.

미토콘드리아를 6-His 태그와 함께 TOM 22를 함유하는 N.crassa 염색으로부터 DDM에 가용화시키고, 니켈 NTA 친화성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다. 분리된 TOM-CC 결정구조의 SDS-PAGE와 비교에 사용된 정제된 대장균 OMPF의 SDS-PAGE가 여기에 나와 있습니다. TOM-CC의 해당 궤적에서 형광 진폭 트레이스는 TOM-CC의 개방 폐쇄 채널 활성이 복합체의 측면 막 이동성과 상관 관계가 있음을 나타냅니다.

진폭 추적은 이동 채널에 해당하는 완전 개방 상태, 중간 투자율 상태 및 이동하지 않는 채널에 해당하는 닫힌 채널 상태의 세 가지 투자율 상태를 표시합니다. 중간 상태의 TOM-CC는 평균 위치에서 약 플러스/마이너스 60나노미터만큼 흔들립니다. OMPF의 해당 궤적에 있는 형광 진폭 트레이스가 여기에 표시됩니다.

OMPF는 움직이거나 갇혀 있는지 여부에 관계없이 TOM-CC와 비교하여 하나의 강도 수준만 나타냅니다. 갇힌 분자의 기간에 해당하는 궤적 세그먼트는 회색으로 표시됩니다. 주목해야 할 한 가지 중요한 점은 이 방법이 손상되지 않은 막 환경에서 단일 막 단백질을 분석한다는 것입니다.

막 단백질의 역학은 가까운 장래에 과학적 연구의 지평으로 남을 것입니다. 우리는 우리의 방법이 이 분야에 크게 기여할 것으로 기대합니다.