Name: TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 학습하세요 TIRF 현미경을 이용한 지질 이중층에서 이온 채널의 측면 이동성과 활성을 단일 분자 수준에서 추적하는 방법을. 형광 표지 없이 생리적 환경에서 막 단백질 역학을 연구할 수 있습니다.

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단백질 준비에 도움을 준 Beate Nitschke와 통찰력 있는 토론을 해준 Robin Ghosh, Michael Schweikert(슈투트가르트), Maximilan Ulbrich(프라이부르크)에게 감사드립니다. 이 연구는 슈투트가르트 연구 센터 시스템 생물학 (SRCSB)과 바덴 뷔 르템 베르크 재단 (BiofMO-6 to SN)의 보조금으로 지원되었습니다.

우리는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 단일 분자 TIRF 현미경을 사용하여 측면 이온 채널 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 연구하기 위해 DIB 멤브레인을 사용하는 방법을 소개합니다. 최상의 데이터를 얻기 위해서는 가능한 한 많은 잘 분리된 채널이 있는 안정적인 DIB 멤브레인을 준비하는 것이 만족스럽게 분석할 수 있는 개별 입자의 시계열을 얻는 데 중요합니다.
최적화해야 할 중요한 파라미터에는 지질 선택, 유상의 지질 농도, 수성 방울의 단백질 및 세제 농도가 포함됩니다. 사용된 지질은 저온에서 명확한 상전이를 나타내지 않는다는 점에서 특이합니다. DPhPC는 안정한 멤브레인 시스템(40)을 생산하기 위해 통상적으로 사용되는 지질이다. 원칙적으로, 저온에서 그의 유체 환경을 유지하는 임의의 지질이 이러한 적용에 적합할 수 있다. 또한, 지질은 산화에 민감하지 않아야 한다. 액적의 세제 농도는 막 파열을 방지하기 위해 가능한 한 낮아야 합니다. 안정적인 멤브레인 및 양호한 단백질 혼입률은 일반적으로 멤브레인 단백질이 침전되지 않는다는 점을 감안할 때 임계 미셀 농도(cmc) 미만의 세제 농도에서 달성됩니다.
DIB 막이 특정 세제를 견디지 못하는 경우21,41, 또는 단백질이 낮은 세제 용액에서 DIB 막으로 통합되지 않는 경우, 단백질 채널은 먼저 작은 단층 지질 소포 (SUV)로 재구성 될 수 있으며, 이는 E. coli MscL 42에 대해 성공적으로 나타난 바와 같이 액적 측면에서 DIB 막으로 융합됩니다 . 때때로 DIB 멤브레인은 유상의 지질 농도가 너무 낮기 때문에 형성되지 않습니다. DIB 멤브레인이 파열되는 것을 방지하기 위해 하이드로겔과 액적 사이의 삼투압은 시스에서 트랜스로의 Ca2+-플럭스에 과도하게 영향을 미치지 않으면서 정확하게 균형을 이루어야 한다는 점도 알고 있어야 합니다. 최적화된 아가로스 두께 및 메쉬 크기는 막 단백질의 확산을 관찰하는 데 중요한 것으로 보인다. 아가로스 층의 건조는 피해야 한다. 두께는 원자력 현미경(17)을 사용하여 결정할 수 있다. 스핀 코팅 동안 아가로스 농도, 부피 및 회전 속도를 변화시킴으로써, 히드로겔의 메쉬 크기 및 두께가 최적화될 수 있다. 그러나 수화겔 층 두께는 이미지 대비에 영향을 미칩니다. DIB에서 막 단백질을 포획하기 위해, 아가로스 하이드로겔은 맞춤형 합성, 비가교결합, Ni-NTA 변형, 저융점 아가로스로 대체되어 His-tag17을 통해 이들을 포획할 수 있습니다. 지나치게 높은 형광 배경은 종종 DIB 막의 파열로 인해 발생합니다. 이것은 Ca2+-민감성 염료가 하이드로겔로 확산되기 때문에 멀티웰 챔버에서 특히 문제가 됩니다. 이 경우 인접한 우물은 피해야합니다. 멤브레인 위의 Ca2+ 민감성 염료의 형광 표백은 TIRF 소멸장 외부의 액적 벌크(그림 3A)에서 여기되지 않은 염료로 교환되기 때문에 중요한 제한 요소가 되어서는 안 됩니다. 단백질의 국소화 정밀도는 스폿과 픽셀 크기를 맞추는 정확도에 의해 주어집니다.
약한 형광 신호는 채널을 통한 낮은Ca2+-플럭스로 인해 발생할 수 있습니다. 가능한 이유는 다음과 같습니다 : (i) 부정확 한 TIRF 설정 (예 : 레이저 강도), (ii) 멤브레인을 가로 지르는 삼투압 Ca 2+ 압력 또는 (iii) 채널의 고유 Ca2+ 투과성이 너무 낮습니다. 첫 번째 문제에 대처하려면 레이저 강도, TIRF 각도 및 카메라 게인을 최적화해야 합니다. 후자의 두 가지 문제는 멤브레인(2,43)을 가로지르는 전위의 인가에 의해 극복될 수 있다. 그러나 전기적 효과가 실제로 전압으로 제어되지 않는 리간드 개폐 또는 기계에 민감한 이온 채널의 채널 개방에 영향을 미칠 수 있기 때문에 외부 전압을 적용하면 결과가 왜곡될 수 있습니다. 이러한 채널의 예는 미토콘드리아 단백질 트랜스로카제 TOM-CC27 및 그의 채널 형성 서브유닛 Tom40 26,44,45,46입니다. 마지막으로, 원하는 기능을 달성하기 위해 특정 방향으로 DIB 막에 막 단백질을 삽입하는 것은 까다롭고 정량적 연구는 드뭅니다47,48. 일부 경우에, 통합된 단백질의 배향은 랜덤하다. 이것은 특정 막 단백질이 막의 한쪽에서만 활성화되기 때문에 막 단백질을 연구하는 데 심각한 문제입니다.
TIRF 현미경은 평면 지지 멤브레인49에서 단일 분자 이벤트를 해결하기 위한 강력한 방법입니다. 예를 들면 α-헤몰리신50, 퍼프린골리신 O 51 및 OmpG52와 같은 채널 단백질의 조립 및 폴딩 경로 설명이 있습니다. 이 연구에는 추가 기술로 FRET가 포함되었습니다. 또한, 기계감응성 이온 채널 MscL의 활성화는 전류 측정치를 사용하여 지지된 DIB 이중층(42)의 기계적 자극에 의해 이전에 연구되었다. 이 작업을 기반으로 향후 연구에서는 여기에 설명된 플랫폼을 단일 분자 FRET 실험과 결합하여 광학 방식으로 단일 분자 수준에서 기계 민감성 채널을 처리할 수 있습니다17. 액적에 완충액을 주입하거나, 내부 DIB 단층을 늘리거나, 개별 채널을 기본 하이드로겔에 표적으로 결합하는 것은 MscL 및 MscS, 2-공극 도메인 K+-채널, TREK-1, TREK-2, 및 TRAAK, 및 PIEZO (검토를 위해,53 참조)는 또한 터치 민감성 이온 채널 NOMPC54,55에 대해 나타낸 바와 같이 세포 세포골격에 대한 국소 결합이다.

본 프로토콜은 고분자 지지 액적 계면 이중층(DIB) 막 1,2,3에서 막 이동성과 막 단백질의 이온 채널 투과성 사이의 상관관계를 연구하는 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다.
본 기술은 단일 입자 추적4,5, 형광 상관 분광법 6,7 및 고속 원자력 현미경 8,9,10과 같은 고급 광학 및 표면 분석 도구의 인상적인 배열을 보완합니다. 이는 막 기반 반응에 영향을 미치는 막의 동적 구성과 구조에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다11,12,13. 단백질의 이동과 측면 확산은 막에 있는 단백질의 국소 밀도에 따라 달라지지만, 개별 단백질 분자는 지질 뗏목(14)과 단백질-단백질 상호작용(15,16)에 의해 갇힐 수도 있다. 막에서 세포외 환경 또는 세포질로 돌출된 단백질 도메인에 따라 단백질 이동성은 이동성이 높은 것부터 완전히 움직이지 않는 것까지 다양할 수 있습니다. 그러나, 멤브레인과 그 주변 구조의 복잡성으로 인해, 측면 이동성의 특성과 단백질 기능 사이의 상호작용을 해독하는 것은 종종 어렵다17.
DIB 멤브레인은 멤브레인 단백질 18,19,20,21,22의 생물물리학적 단일 분자 분석을 위한 효율적인 플랫폼임이 입증되었습니다. 이들은 지질/유상에서 수성 방울과 하이드로겔 지지 기질의 접촉을 통한 지질 자가 조립에 의해 형성됩니다. 일반적으로 사용되는 지지된 지질 이중층(SLB)1,23,24,25과 유사하게, DIB는 적절한 리간드로 기능화될 때 단백질을 중합체 매트릭스에 일시적 또는 영구적으로 결합시킴으로써 측면 이동성의 국소 조정을 허용한다(17). 후자는 이질적인 단백질 분포를 갖는 세포막에서 생화학적 과정을 위한 모델 시스템 역할을 할 수 있다10.
여기에 기술된 실험적 접근법은 TIRF 현미경을 사용하여 멤브레인(2,22)에 근접한 개별 채널을 통한 Ca2+ 이온 플럭스를 측정하기 위해Ca2+-민감성 염료의 형광에 의존한다. 이 광학적 접근 방식은 샘플의 조명을 멤브레인에 가까운 거리로 제한하며, 이는 소멸 여기 광의 물리적 특성으로 인해 형광 배경을 크게 감소시킵니다. 후자는 단일 분자의 검출을 위해 높은 공간 및 시간 분해능이 필요한 경우 전제 조건입니다. 고전적인 전기생리학적 방법(26,27)과 달리, 개별 채널을 통한 이온 플럭스를 연구하기 위해 멤브레인 전압이 필요하지 않습니다. 또한, 이 방법은 멤브레인에서 채널의 측면 이동을 방해할 수 있는 형광 염료 또는 분자로 표지할 필요가 없습니다.
이 방법은 고전적인 전기 생리학을 사용하지 않고 단일 분자 수준에서 멤브레인에 내장된 단백질 채널을 연구하는 데 특히 유용합니다. Neurospora crassa28,29,30의 미토콘드리아 단백질 전도 채널 TOM-CC와 대장균17,31의 외막을 가로질러 작은 친수성 분자의 확산을 지원하는 OmpF를 사용하여 두 단백질의 막 이동성과 채널 활성을 연구하고 상관시킬 수 있는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 TOM-CC 및 OmpF에 최적화되어 있지만 다른 단백질 채널에 쉽게 적용될 수 있음을 시사합니다.

<table><tbody><tr><td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C</td><td></td></tr><tr><td>100x 오일 목적 Apochromat N.A. 1.49</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>TIRF 현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>10x Hoffmann 모듈레이션 콘트라스트 대물렌즈 NA 0.25&nbsp;</td>DIB 멤브레인 형성을 평가하기 위한 <td>Nikon</td><td></td><td>현미경&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>10x 대물렌즈 N.A. 0.25</td><td>Nikon</td><td>MRL00102</td><td>TIRF 현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>40x Hoffmann 모듈레이션 콘트라스트 대물렌즈 NA 0.55</td><td>Nikon</td><td></td><td>현미경으로 DIB 막 형성을 평가합니다&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>488 nm 레이저, 100 mW&nbsp; &nbsp;</td><td>Visitron</td><td></td><td>TIRF 현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>접착 테이프</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&Auml; KTA 퓨어&nbsp; &nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td>단백질 정제 시스템</td></tr><tr><td>Bradford 분석 키트, Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>Chelax 100 수지</td><td>Biorad</td><td>143-2832</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MC1024452500</td><td></td></tr><tr><td>투석 카세트 Slide-A-Lyzer 20 k MWCO</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>87735</td><td></td></tr><tr><td>DIB 챔버&nbsp;</td><td></td><td></td><td>DIB 멤브레인용 맞춤형 PMMA 챔버</td></tr><tr><td>디지털 파워 미터 및 에너지 콘솔</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>레이저 파워 미터&nbsp;</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>로스&nbsp;</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>이중 증류 H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TS 100 Hoffmann 변조 대비 현미경&nbsp;</td>DIB 멤브레인 형성을 평가하기 위한 <td>Nikon</td><td></td><td>현미경&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8042.2</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 카메라 iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>TIRF 현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-M</td><td></td></tr><tr><td>고정 각도 로터 Ti70</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8, CalciFluorTM</td><td>Santa Cruz 생명공학</td><td>SC-362561</td><td>Ca2+-sensitive 염료</td></tr><tr><td>프렌치 프레스 세포 파괴 균질화</td><td>Igneus</td><td>Igneus 40000 psi</td><td></td></tr><tr><td>GFP 필터</td><td>AHF</td><td></td><td>백색 광원을 사용한 epifluorescence에 의한 DIB 멤브레인의 excitation에 사용되는 필터 seeting&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 40 mm x 24 mm x 0.13 mm</td><td>Roth</td><td>1870.2</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Roth</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기 10 mL</td><td>Roth</td><td>X033.1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기 100 mL</td><td>Roth</td><td>X049.1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기 500 mL</td><td>Roth</td><td>EY49.1</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer 컴포트</td><td></td></tr><tr><td>히팅 플레이트</td><td>Minitube&nbsp;</td><td>HT200</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>로스&nbsp;</td><td>9205.3</td><td></td></tr><tr><td>Hexadcane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296317</td><td></td></tr><tr><td>그의 함정 HP 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>29051021</td><td>Ni-NTA 컬럼</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.04716.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>10314243</td><td></td></tr><tr><td>KLM 스핀 코터&nbsp;</td><td>Schaefer Tec</td><td>SCV-10</td><td></td></tr><tr><td>목록 의료 L/M-3P-A 수직 피펫 풀러</td><td>Artisan Technology Group</td><td>57761-1</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>M8 스테레오현미경</td><td>와일드</td><td></td><td>스테레오마이크로소프&nbsp;</td></tr><tr><td>매트랩&nbsp;</td><td>MathWorks</td><td>R2022a</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil 피펫 팁</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>N2 가스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoliter 2010 인젝터&nbsp;</td><td>세계 정밀 기기</td><td>나노 리터 2010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl-b-D-maltoside</td><td>Glycon Biochemicals</td><td>D97002-C</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA 아가로스, 비가교</td><td>큐브 생명 공학</td><td>124115393</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930</td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>n-octyl-polyoxyethylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40530</td><td></td></tr><tr><td>O2 가스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Roth&nbsp;</td><td>6367.3</td><td></td></tr><tr><td>포토다이오드 센서&nbsp; Si, 400 - 1100 nm, 500 mW</td><td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>레이저 파워 미터용 센서&nbsp;</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Diener Electronics</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Preparative 초원심분리기 Optima</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>쿼드-밴드 TIRF-filter 446/523/600/677 HC</td><td>AHF</td><td></td><td>필터 설정은 488 nm 레이저로 DIB-membranes의 excitation에 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>리소스 Q 1 mL</td><td>Cytiva</td><td>17117701</td><td>음이온 교환 컬럼</td></tr><tr><td>실리콘 오일 AR 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10836</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>Super LoLux 카메라</td><td>JVC</td><td></td><td>Stereomicrosope&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>Gerhardt</td><td>THL 500/1</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E 형광 현미경&nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9090.3</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Roth</td><td>8952.2</td><td></td></tr><tr><td>초음파 욕조&nbsp;</td><td>Bandelin Sonorex</td><td>RK 100</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Vacuubrand</td><td>MD 4C NT</td><td></td></tr><tr><td>백색광 광원 (100 W)</td><td>Nikon</td><td>MBF72655</td><td>TIRF 현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Roth</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

tirf(total internal reflection fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

고해상도 이미징 기술은 많은 이온 채널이 정적이지 않고 기공 형성 및 보조 서브유닛의 일시적인 결합, 측면 확산 및 다른 단백질과의 클러스터링을 포함하여 매우 역동적인 과정을 겪는다는 것을 보여주었습니다. 그러나 측면 확산과 기능 사이의 관계는 잘 알려져 있지 않습니다. 이 문제에 접근하기 위해 우리는 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 지지된 지질막에서 개별 채널의 측면 이동성과 활동을 모니터링하고 상호 연관시킬 수 있는 방법을 설명합니다. 멤브레인은 DIB(droplet interface bilayer) 기술을 사용하여 초박형 하이드로겔 기판에 제조됩니다. 다른 유형의 모델 멤브레인과 비교할 때 이러한 멤브레인은 기계적으로 견고하고 고감도 분석 기술에 적합하다는 장점이 있습니다. 이 프로토콜은 멤브레인에 근접한 Ca 2+ 민감성 염료의 형광 방출을 관찰하여 단일 채널을 통한 Ca2+ 이온 플럭스를 측정합니다. 기존의 단일 분자 추적 접근법과 달리, 멤브레인의 측면 이동 및 기능을 방해할 수 있는 형광 융합 단백질 또는 표지가 필요하지 않습니다. 단백질의 구조적 변화와 관련된 이온 플럭스의 가능한 변화는 막의 단백질 측면 운동으로 인한 것입니다. 대표적인 결과는 미토콘드리아 단백질 전위 채널 TOM-CC 및 박테리아 채널 OmpF를 사용하여 나타내었다. OmpF와 달리 TOM-CC의 게이팅은 분자 구속 및 측면 확산의 특성에 매우 민감합니다. 따라서 지원되는 액적 계면 이중층은 측면 확산과 이온 채널 기능 간의 연결을 특성화하는 강력한 도구입니다.

실시간 무전극 광학 단일 채널 기록은 측면 단백질 이동과 DIB 멤브레인에서 개별 이온 채널의 기능 간의 상호 작용을 보여줍니다. 미토콘드리아 TOM 코어 복합체(도 1A)를 DIB 막(도 4D)으로 재구성한 것은 측면 이동성과 이온 투과성 사이의 강한 시간적 상관관계를 보여줍니다(도 5A). TOM-CC 게이팅은 횡방향 이동 모드(17)에 민감한 것으로 보인다. 움직이는 채널은 기공을 통해 Ca2+ 플럭스와 높은 형광점 강도를 보여줍니다. 갇힌 움직이지 않는 분자는 낮은 형광 강도와 중간 형광 강도를 나타냅니다. 미토콘드리아 TOM-CC의 일반적인 단백질 수입 공극의 경우, 이 단일 분자 접근법은 측면 이동성과 이온 투과성 사이에 강한 시간적 상관관계를 나타냈으며, 이는 TOM-CC 채널이 기계감응성을 가지고 있음을 시사한다17. 자유롭게 움직이는 TOM-CC 분자의 측면 정지는 TOM-CC 채널의 부분적 또는 완전한 폐쇄를 동반합니다. 멤브레인에 거의 완전히 내장된 OmpF(그림 1E 및 그림 4F)를 사용하여 DIB 멤브레인을 이미징하면 스톱 앤 고 효과가 나타나지 않습니다(그림 5B). OmpF의 무작위 정지는 강도의 변화와 관련이 없으므로 모공이 닫히는 것과 관련이 없습니다. 형광 신호들(38)에 기초하여, 개별 채널들의 위치 정확도는 5 내지 10 nm 사이의 범위에서 추정될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 120 nm의 평균 변위를 갖는 중간 상태의 TOM-CC 분자에 대해 도시된 바와 같이, 아가로스 하이드로겔을 사용한 이동 앵커링으로 인해 채널이 약간 흔들리는 경우에는 이러한 정확도를 달성할 수 없다는 점에 유의해야 한다(도 5A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig01.jpg"> 그림 1: TOM-CC의 분리. (A) N. crassa TOM-CC30,39의 Cryo EM 구조. 6xHis 태그가 있는 Tom22를 함유하는 N. crassa 균주의 미토콘드리아를 DDM에 가용화하고 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(B) 및 음이온 교환 크로마토그래피(C)를 실시했습니다. (D) 분리된 TOM-CC의 SDS-PAGE. (E) 정제된 대장균 OmpF의 결정구조(PDB, 1OPF) 및 (F) SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig02.jpg"> 그림 2: PMMA 챔버 어셈블리의 흐름도. 1단계: 유리 커버슬립을 아가로스 하이드로겔로 스핀 코팅합니다. 2단계: 스핀 코팅된 커버슬립을 맞춤형 PMMA 현미경 챔버에 장착합니다. 단계 3: 추가적인 저용융 아가로스를 35°C 열판 상의 PMMA 챔버의 입구 포트에 첨가한다. 4단계: 완충액/오일 계면(왼쪽)과 아가로스 하이드로겔/오일 계면(오른쪽)에서 수성 방울 주위에 지질 단층이 형성됩니다. 5단계: 개별 수성 방울을 PMMA 챔버의 웰에 피펫팅하여 두 개의 지질 단층이 접촉할 때 지질 이중층을 형성합니다. 6단계: DIB 멤브레인의 형성은 Hofmann 변조 조영 현미경으로 검증됩니다. 7단계: 이온 채널이 삽입된 DIB 멤브레인의 선택된 영역의 이미지를 TIRF 현미경으로 획득합니다. 녹색: 0.75% 아가로스; 황색:Ca2+ 이온을 함유하는 2.5% 아가로스; 마젠타: 지질/유상; 진한 파란색: Ca2+ 민감성 염료 및 단백질을 함유한 수성 액적 완충액. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig03.jpg"> 그림 3: 실험 설정. (A) PMMA 웰에 있는 DIB 멤브레인의 개략도. 이중층은 트랜스에서Ca2+-민감성 형광 염료(Fluo-8)를 사용하여 시간 경과에 따라 이온 채널을 통해 Ca2+-플럭스의 TIRF 이미징을 허용하기 위해 초박형 0.75% 아가로스 필름 위에 놓여 있습니다. (B) Ca2+-플럭스는 cis에서 trans까지의 삼투압에 의해서만 제어됩니다. 이를 통해 멤브레인의 위치와 채널의 개방 폐쇄 상태를 모두 결정할 수 있습니다. 여기에 표시된 채널은 N. crassa 미토콘드리아30의 단백질 전도성 채널 TOM-CC입니다. (C) 단일 TOM-CC 채널의 궤적. 녹색: 움직이는 채널; 노란색: 움직이지 않는 채널. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig04.jpg"> 그림 4: DIB 멤브레인에서 TOM-CC 및 OmpF 이미징. (A) 하이드로겔과 액적 사이의 이중층 접촉 면적을 보여주는 Hoffmann 변조 대조 현미경으로 이미지화된 DIB 멤브레인. (B) (A)와 같이 이미징된 파손된 DIB 멤브레인. 화살표, PMMA 챔버의 가장자리. (C) 단백질 채널 없이 TIRF 현미경으로 이미지화한 DIB 멤브레인. (D) TIRF 현미경으로 이미지화한 재구성 TOM-CC가 있는 DIB 멤브레인. 흰색 사각형은 높음(SH), 중간(S I) 및 낮음(SL) 강도의 반점을 표시합니다. (E) (A)에 표시된 3개 지점의 형광 강도 프로파일을 2차원 가우스 함수에 맞추면 개별 TOM-CC의 위치와 채널을 통한Ca2+ 플럭스가 나타납니다. (F) 재구성된 OmpF가 있는 DIB 멤브레인. (G) (F)에 표시된 형광 스폿의 가우스 피팅. 2 기공 β 배럴 단백질 복합체 TOM-CC와 달리 3 기공 β 배럴 OmpF는 단 하나의 투과성 상태를 나타냅니다. 픽셀 크기, 0.16μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64970/64970fig05.jpg"> 그림 5: 채널 활동은 TOM-CC의 측면 이동도와 상관관계가 있습니다. (A) TOM-CC의 형광 진폭 트레이스(위)와 해당 궤적(아래)은 TOM-CC의 개방-폐쇄 채널 활성이 복합체의 측면 막 이동도와 상관관계가 있음을 나타냅니다. 궤적에는 세 가지 투과성 상태가 표시됩니다. 녹색: 완전히 열린 상태; 노란색 : 중간 투과성 상태; 빨간색: 닫힌 채널 상태; 붉은 별: 중간 상태의 TOM-CC는 평균 위치에서 약 ±60nm 정도 흔들립니다. 완전 개방 및 중간 상태에서의 형광 신호에 기초한 위치 정확도(37)는 5 nm 내지 10 nm 사이의 범위이다. (B) OmpF의 형광 진폭 트레이스(위) 및 해당 궤적(아래). OmpF는 이동 중인지 갇혀 있는지에 관계없이 하나의 강도 수준만 나타냅니다. 갇힌 분자의 기간에 해당하는 궤적 세그먼트는 회색으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64970/64970fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>완충기 </td>
			<td colspan="3">시약 농도</td>
			<td>음량</td>
		</tr><tr><td>대답 1*</td>
			<td colspan="3">20mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1%(w/v) n-도데실-β-D-말토사이드(DDM), 10%(v/v) 글리세롤, 300mM NaCl 및 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)</td>
			<td>100 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>대답 2*</td>
			<td colspan="3">20mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1%(w/v) DDM, 10%(v/v) 글리세롤, 1M 이미다졸 및 1mM PMSF</td>
			<td>100 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>나1*</td>
			<td colspan="3">20mM HEPES pH 7.2, 0.1%(w/v) DDM, 2%(v/v) 디메틸 설폭사이드(DMSO)</td>
			<td>100 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>B2*</td>
			<td colspan="3">20mM HEPES pH 7.2, 0.1%(w/v) DDM, 1M KCl, 2%(v/v) 디메틸 설폭사이드(DMSO)</td>
			<td>100 밀리리터</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* 사용하기 전에 가스를 제거하고 0.22μm 필터를 통과시킵니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: TOM-CC 분리를 위한 버퍼 솔루션.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>완충기 </td>
			<td colspan="3">시약 농도</td>
			<td>음량</td>
		</tr><tr><td>파운드*</td>
			<td colspan="3">1%(w/v) 트립톤, 1%(w/v) NaCl 및 0.5%(w/v) 효모 추출물</td>
			<td>1100 mL의</td>
		</tr><tr><td>씨1</td>
			<td colspan="3">2 mM MgCl2 및 ~750 단위 DNAse 및 50 mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>20 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>씨2</td>
			<td colspan="3">50mM 트리스-HCl, pH 7.5</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>씨3</td>
			<td colspan="3">4%(w/v) 소듐 도데실 설페이트(SDS), 2mM β-메르캅토에탄올 및 50mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>씨4</td>
			<td colspan="3">2%(w/v) SDS, 500mM NaCl 및 50mM Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>씨5</td>
			<td colspan="3">0.5%(w/v) 옥틸 폴리옥시에틸렌(옥틸 POE), 1mM EDTA 및 20mM 트리스 pH 8.5</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="5">* 사용하기 전에 소독하십시오.</td>
		</tr></tbody></table>표 2: OmpF 분리를 위한 버퍼 용액.

이 프로토콜은 TIRF 현미경을 사용하여 개별 이온 채널을 추적하고 지지된 지질막에서 그 활성을 결정하여 측면 막 이동과 채널 기능 간의 상호 작용을 정의하는 방법을 설명합니다. 멤브레인을 준비하고, 데이터를 기록하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.

TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용한 지질 이중층의 측면 이동성 및 이온 채널 활성에 대한 단일 분자 이미징

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

이온 채널은 생물학적 막에서 고정되어 있지 않습니다. 여기에서 우리는 측면 막 확산과 이온 채널 기능 사이의 연관성을 밝히기 위한 단일 분자 광학 접근 방식을 제시합니다. 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 측면 이동 및 기능을 방해할 수 있는 단백질의 형광 표지가 필요하지 않다는 것입니다.이 방법은 자유 또는 제한된 확산이 조직 및 기능에 중요한 모든 막 단백질 채널에 적용할 수 있습니다. 먼저 380마이크로리터의 DPhPC 원액을 유리 바이알에 옮기고 지질 원액을 아르곤 또는 질소 가스로 덮어 지질 산화를 방지합니다. 지질이 용해된 유기 용매가 증발하거나 바이알에서 용매 스프레이가 튀는 것을 방지하기 위해 가능한 가장 낮은 가스 흐름을 사용하십시오.질소 흐름에서 지질 샘플을 건조하고 오일 프리 진공 펌프를 사용하여 진공 상태에서 지질 샘플에서 남은 유기 용매를 밤새 제거합니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 동일한 부피의 헥사데칸과 실리콘 오일을 첨가하여 헥사데칸 실리콘 오일 용액에 지질 필름을 용해시켜 밀리리터당 9.5밀리그램의 최종 지질 농도로 합니다. 유리 커버슬립을 스테인리스 스틸 커버슬립 홀더에 넣고 초음파 세척기의 아세톤으로 약 10분 동안 유리 비커에서 청소합니다.이중 탈이온수로 커버슬립을 헹구고 질소 흐름으로 건조시킵니다. 또한, 플라즈마 클리너에서 커버 슬립을 5 분 동안 산소로 세척하고 수소화합니다. 스핀 코터에 플라즈마 처리된 커버슬립을 장착하고, 30초 동안 3, 000 RPM에서 200 마이크로리터 피펫으로 가열된 0.75% 저융점 아가로스 140마이크로리터를 서서히 첨가하여 커버슬립을 서브 마이크로미터 두께의 아가로오스 필름으로 코팅한다.아가로스 하이드로겔의 얇은 층이 있는 스핀 코팅된 커버슬립을 PMMA 챔버의 아래쪽에 즉시 부착합니다. 아가로스 하이드로겔이 위쪽을 향하도록 합니다. 커버슬립의 가장자리를 투명 접착 테이프로 PMMA 미세 가공 장치에 고정하고 섭씨 35도로 가열된 열판에 장치를 놓습니다.2.5%agarose 용액 200마이크로리터를 기포를 생성하지 않고 챔버의 입구에 조심스럽게 붓습니다. PMMA 챔버의 웰에서 스핀 코팅된 아가로스의 탈수를 피하기 위해 아가로스 오일 계면에서 지질 단층 형성을 시작하기 위해 약 60 마이크로리터의 지질 오일 용액으로 PMMA 챔버의 웰을 즉시 덮습니다. 장치를 섭씨 35도의 핫플레이트에 약 2시간 동안 놓습니다.약 20 마이크로리터의 지질 헥사데칸 실리콘 오일 용액을 액적 배양 챔버의 여러 미세 가공 웰 각각에 배치합니다. 수직 또는 수평 마이크로피펫 풀러를 사용하여 팁 개구부 직경이 약 20마이크로미터인 미세모세관 유리 바늘을 준비합니다. 8.8 밀리몰 HEPES, 7 마이크로 몰의 형광 염료, Fluo-8, 400 마이크로 몰 EDTA, 1.32 몰 염화칼륨 및 30 나노 몰 TOM 코어 복합체 또는 대안적으로 20 나노 몰 OMPF를 포함하는 약 5 마이크로 리터의 수성 주입 용액으로 바늘을 채 웁니다.피에조 구동 나노 인젝터에 수성 주입 용액으로 바늘을 장착하고 나노 인젝터를 사용하여 지질 헥사 데칸 실리콘 오일 용액으로 채워진 액적 배양 챔버의 웰에 100-200 나노 리터의 수성 방울을 주입합니다. 섭씨 35도로 가열된 핫 플레이트 상에서 PMMA 및 액적 배양 챔버를 유지함으로써 약 2시간 동안 액적 오일 계면에서 지질 단분자층의 형성을 허용한다. 10마이크로리터 일회용 폴리프로필렌 팁이 있는 단일 채널 마이크로리터 피펫을 사용하여 액적 배양 챔버의 웰에서 PMMA 챔버의 웰로 개별 수성 방울을 수동으로 옮깁니다.액적이 하이드로겔-오일 계면에서 지질 단층 상으로 가라앉도록 하여 액적과 아가로스 하이드로겔 사이에 지질 이중층을 형성합니다. 도립 광학 현미경의 샘플 홀더에 액적 인터페이스 이중층 또는 DIB 멤브레인이 있는 PMMA 챔버를 장착하고 10x Hoffman 변조 대비 대물렌즈를 사용하여 멤브레인 형성을 평가합니다. DIB 멤브레인이 형성된 경우 EPIOORESCENCE 조명용 기존 광원, 488나노미터 레이저 및 이면조사형 전자 곱셈 CCD 카메라가 장착된 TIRF 현미경의 샘플 홀더에 PMMA 챔버를 장착하여 약 0.16마이크로미터의 픽셀 크기를 달성합니다.GFP 필터 세트를 사용하여 고강도 광원으로 에피형광 조명 아래에서 10x 배율 대물렌즈로 DIB 멤브레인의 가장자리를 초점을 맞춥니다. 100x NA 1.49 아포크로매틱 오일 TIRF 대물렌즈를 사용하여 고배율로 DIB 멤브레인의 동일한 가장자리를 미세 초점화하고, GFP 필터 세트를 사용하여 고강도 광원으로 에피형광 조명 아래에서 다시 초점을 맞춥니다. 필터 설정을 GFP에서 쿼드 밴드 TIRF 필터 세트로 변경하고, 488나노미터 레이저를 켜고, 대물 렌즈의 레이저 강도를 설정합니다.단일 이온 채널을 시각화하려면 DIB 멤브레인의 개방 이온 채널이 어두운 배경에 고대비 형광 반점으로 나타나고 신호 대 배경 비율이 최대에 도달하도록 TIRF 각도와 EM CCD 카메라 게인을 조정합니다. 단일 이온 채널을 통한 칼슘 이온 플럭스에 해당하는 지점이 초점을 유지하고 중앙에서 강도가 높고 주변으로 갈수록 점차 감소하는 둥근 모양을 갖도록 합니다. 이온 채널이 DIB 멤브레인으로 재구성되고 멤브레인 평면에서 측면으로 이동하는지 확인하기 위해 형광 스팟에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다.마지막으로, 위치를 적절하게 추적하고 개별 이온 채널의 개방-폐쇄 상태를 모니터링할 수 있는 일련의 멤브레인 이미지를 기록합니다. 측면 이동성의 유형과 채널 활동 상태를 결정하려면 충분히 길고 잘 샘플링 된 궤적을 획득하십시오. Neurospora crassa TOM-CC의 Cryo EM 구조는 여기에 나와 있습니다.미토콘드리아를 6-His 태그와 함께 TOM 22를 함유하는 N.crassa 염색으로부터 DDM에 가용화시키고, 니켈 NTA 친화성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 실시하였다. 분리된 TOM-CC 결정구조의 SDS-PAGE와 비교에 사용된 정제된 대장균 OMPF의 SDS-PAGE가 여기에 나와 있습니다. TOM-CC의 해당 궤적에서 형광 진폭 트레이스는 TOM-CC의 개방 폐쇄 채널 활성이 복합체의 측면 막 이동성과 상관 관계가 있음을 나타냅니다.진폭 추적은 이동 채널에 해당하는 완전 개방 상태, 중간 투자율 상태 및 이동하지 않는 채널에 해당하는 닫힌 채널 상태의 세 가지 투자율 상태를 표시합니다. 중간 상태의 TOM-CC는 평균 위치에서 약 플러스/마이너스 60나노미터만큼 흔들립니다. OMPF의 해당 궤적에 있는 형광 진폭 트레이스가 여기에 표시됩니다.OMPF는 움직이거나 갇혀 있는지 여부에 관계없이 TOM-CC와 비교하여 하나의 강도 수준만 나타냅니다. 갇힌 분자의 기간에 해당하는 궤적 세그먼트는 회색으로 표시됩니다. 주목해야 할 한 가지 중요한 점은 이 방법이 손상되지 않은 막 환경에서 단일 막 단백질을 분석한다는 것입니다.막 단백질의 역학은 가까운 장래에 과학적 연구의 지평으로 남을 것입니다. 우리는 우리의 방법이 이 분야에 크게 기여할 것으로 기대합니다.

single-molecule-imaging-lateral-mobility-ion-channel-activity-lipid

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

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