Name: zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 배우세요 zSpRY-ABE8e를 이용한 PAM 제한 없는 아데닌 염기 편집으로 Danio rerio에서 인간 유전 질환을 정밀 모델링하는 방법입니다. Diamond-Blackfan Anemia 모델 구축과 표현형 분석을 통해 단일염기 변이 관련 질병 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 원고 초안의 영어 텍스트를 편집해 주신 Liwen Bianji(Edanz)의 Barbara Garbers 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 광둥성 핵심 지역 연구 개발 프로그램(2019B030335001), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2019YFE0106700), 중국 국립 자연 과학 재단(32070819, 31970782), 광둥성 수생 경제 동물을 위한 병원성 생물학 및 역학 핵심 연구소의 연구 기금 프로그램(PBEA2020YB05).

본 연구는 화남사범대학 관리이용위원회의 지침을 엄격히 준수하여 수행되었다.
1. 합성 변형 gRNA 및 zSpRY-ABE8e mRNA 제조
<ol><li>이전 간행물37,38에 따라 gRNA를 설계합니다.<ol><li>zSpRY-ABE8e가 NYN PAM보다 NRN PAM에 대해 더 높은 선호도를 나타내므로(여기서, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임)18, PAM 서열로서 NRN을 우선적으로 선택한다. 타겟 아데닌 뉴클레오티드가 고활성 편집 창(protospacer를 따라 세 번째에서 아홉 번째 뉴클레오티드)에 있는지 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>양쪽 끝에서 2′-O-메틸-3′-포스포로티오에이트(MS)로 변형된 EasyEdit sgRNA(EE gRNA)를 주문합니다(그림 1). 참고: EE gRNA는 RNase가 없는 물에 용해되어 -80°C에서 보관해야 합니다.</li>
	<li>zSpRY-ABE8e 플라스미드18을 선형화합니다.<ol><li>6 μg의 플라스미드를 XbaI 효소(재료 표)로 37°C의 금속 수조에서 3시간 동안 선형화합니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 DNA 정제 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 선형화된 플라스미드를 정제합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시험관 전사 키트(Table of Materials)를 사용하여 mRNA를 전사합니다.<ol><li>제조업체의 지침에 따라 선형화된 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 zSpRY-ABE8e mRNA를 전사합니다. 참고: mRNA 및 gRNA와 관련된 모든 작업에는 RNase가 없는 실험실 용품을 사용해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA 정제 키트(표 재료)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 mRNA를 정제합니다. 참고: 용리하기 전에 에탄올은 세포 독성을 피하기 위해 건조되어야 하며 mRNA는 즉시 사용하지 않을 경우 -80°C에서 보관해야 합니다.</li>
</ol>2. 미세주입 유리 모세관 준비
<ol><li>마이크로피펫 풀러 시스템을 설정하고 최소 30분 동안 예열합니다.</li>
	<li>램프 테스트를 실행하여 제조업체의 지침에 따라 붕규산 유리 모세관(외경 1mm, 내경 0.58mm)을 녹이는 데 필요한 열량을 결정합니다.</li>
	<li>프로그램을 선택하고 키보드의 숫자를 클릭하여 매개 변수 값을 입력하십시오. 다음 매개변수를 설정하여 유리 모세관을 당깁니다: 열 = ramp 테스트 값, 당김 = 50, 속도 = 100, 시간 = 50 및 압력 = 30.</li>
	<li>모세관을 설치하고 홈에 있는지 확인합니다. PULL START/STOP 을 눌러 프로그램을 실행합니다.</li>
	<li>당겨진 모세관을 틈이 있는 폼에 삽입하여 보존하고 바늘을 매달린 상태로 유지합니다.</li>
</ol>3. zSpRY-ABE8e mRNA 및 EE gRNA 혼합물을 제브라피쉬 배아에 미세주입
<ol><li>주사 전날 밤에 번식 탱크를 설치하십시오. 칸막이를 삽입하고 암컷 2마리와 수컷 AB 균주 제브라피쉬(3-18개월령) 1마리를 각 수조에 넣고 뚜껑으로 덮습니다. 성별 구분에 대해서는 이전 간행물을 참조하십시오39. 참고: 더 많은 배아를 얻으려면 최소 1주일 동안 번식하지 않은 물고기를 선택하십시오.</li>
	<li>주사 다음날 아침, zSpRY-ABE8e mRNA 및 EE gRNA를 얼음 위에서 해동한다. mRNA와 gRNA를 각각 400ng/μL 및 200ng/μL의 최종 농도로 혼합합니다.<ol><li>RNase가 없는 팁과 튜브를 사용하여 얼음 위에서 전체 절차를 수행하고 장갑으로 다루십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>공압 마이크로 인젝터를 구성합니다. 에어 펌프의 분압 밸브를 닫고 메인 밸브를 먼저 열고 가스 실린더의 나사를 풀고 분압 밸브의 압력을 0.2MPa/29psi로 조정합니다.<ol><li>공압 마이크로 인젝터를 켜고 모드를 TIMER로 설정하고 초기 매개변수 압력 값을 20.0psi로, TIMER 값을 0.040초로 조정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>미세 집게를 사용하여 당겨진 유리 모세관의 바늘을 실체 현미경으로 조심스럽게 부수고 바늘이 융모막과 알의 피어싱을 용이하게 하기 위해 비스듬히 절단되었는지 확인합니다. 알림: 바늘의 절단점은 올바른 위치에 있어야 하며 계란을 뚫을 수 있을 만큼 강하면서도 계란 손상을 최소화할 수 있을 만큼 얇아야 합니다.</li>
	<li>마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 zSpRY-ABE8e mRNA와 gRNA의 혼합물을 유리 모세관의 끝에 추가하여 모세관에 기포가 생기지 않도록 합니다. 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 부착하고 마이크로 캡을 사용하여 주입 당 2nL의 혼합물이 생성되도록 인젝터의 압력과 TIMER 값을 구성합니다.</li>
	<li>번식 탱크의 칸막이를 뽑고 물고기가 10-15 분 동안 번식하도록하십시오. 여과기를 사용하여 알을 수집하고 실체 현미경으로 알의 세포 단계와 품질을 검사합니다. 편집 효율을 높이기 위해 주입 할 단일 세포 상태의 난자를 선택하십시오.</li>
	<li>1.5% 아가로스 주입 플레이트에 난자를 정렬하고 현미경으로 배아의 난황이 아닌 세포에 혼합물 2nL를 주입하여 편집 효율을 향상시킵니다. 대조군으로 최소 15개의 알을 유지합니다.</li>
	<li>1x E3 버퍼를 사용하여 페트리 접시에 계란을 모으고 28°C의 인큐베이터에 넣습니다. 죽은 난자를 제거하고 수정 후 48시간까지 12시간마다 배양 완충액을 교체합니다(hpf).</li>
</ol>4. EditR을 이용한 베이스 편집의 효율성 분석
<ol><li>48hpf에서 무작위로 선택된 6개의 주입된 배아와 무작위로 선택된 6개의 대조군 배아로 구성된 3개의 풀을 각각 PCR 튜브에 수집합니다. 피펫을 사용하여 잔류 E3 완충액을 흡인합니다.</li>
	<li>PCR 튜브에 50mM NaOH 40μL를 추가합니다. 튜브를 95°C의 금속 수조에 20분 동안 넣은 다음 15초 동안 소용돌이칩니다.</li>
	<li>4 μL의 1 M 트리스· HCl(pH 8.0)을 각 튜브에 넣고 NaOH를 중화시킨다. 실온에서 2,000 x g 에서 10초 동안 잠시 원심분리하여 튜브 벽에서 물방울을 제거합니다. 상층액을 새 PCR 튜브에 모아 -20°C에서 보관합니다.</li>
	<li>gRNA 표적 부위의 업스트림 및 다운스트림에 적절한 프라이머를 설계합니다. 50 μL 부피의 PCR 반응을 위한 주형으로 상기 상청액 1 μL를 사용한다. 본 연구에서 PCR에 사용된 프라이머는 보충 표 1에 열거되어 있다.</li>
	<li>정확하고 특이적인 밴드를 보장하기 위해 DNA 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 이어서 이전에 기술된 바와 같이 Sanger 시퀀싱을 수행한다40.</li>
	<li>EditR (1.0.10) 프로그램41을 사용하여 Sanger 시퀀싱 데이터를 분석한다.<ol><li>시퀀싱 파일(ab1 형식)을 ".ab1 파일 업로드" 상자에 업로드합니다.</li>
		<li>"Enter gRNA sequence" 상자에 5′-3′ 방향의 20bp gRNA 서열을 입력합니다.</li>
		<li>염기서열 분석 파일(ab1 형식)을 열고 20bp gRNA 염기서열이 시작되고 끝나는 염기 위치를 확인합니다. "5′ 시작" 및 "3′ 끝" 상자에 해당 기본 위치를 입력합니다.</li>
		<li>Predicted Editing(예측 편집)을 클릭하여 기본 편집 효율성을 얻습니다. 무질서한 피크 또는 인델을 피하기 위해 gRNA 표적 서열 근처의 염기서열 분석 데이터의 품질을 확인하십시오. 참고: 일반적으로, 무질서한 피크는 PCR 어닐링 온도를 조정함으로써 효과적으로 제거될 수 있다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 기본 편집기 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬 질병 모델을 구성하는 방법을 설명합니다. 염기 치환을 위한 기존 HDR 경로와 비교할 때 이 프로토콜은 보다 효율적인 염기 편집을 달성하고 인델 발생을 줄일 수 있습니다. 동시에, 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 최근에 제안된 i-Silence 유전자 녹아웃 전략을 구현하는 것을 포함합니다. 종합하면, zSpRY-ABE8e는 질병 연구에서 제브라피쉬 모델의 적용을 향상시킬 것입니다.
타겟 이탈 효과는 CRISPR/Cas9 시스템에서 흔히 발생하는 문제입니다. PAM이 없는 제한을 고려할 때, tsr2 표적18을 포함한 이전 연구에서 유의미한 off-target이 발견되지 않았더라도 zSpRY-ABE8e의 off-target 효과는 더 높을 수 있습니다. 다행스럽게도 이 문제는 엄격한 gRNA 설계 표준으로 피할 수 있으며, 이는 하나의 게놈 서열만 gRNA...

미스센스 또는 넌센스 돌연변이를 유발하는 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)는 인간 게놈1에서 가장 흔한 돌연변이 원인입니다. 특정 SNV가 병원성인지 여부를 확인하고 발병기전을 밝히기 위해서는 정확한 동물모델이 필요하다2. 제브라피쉬는 인간과 높은 수준의 생리적, 유전적 상동성, 짧은 발달 주기, 강력한 생식 능력을 나타내는 우수한 인간 질병 모델로, 병원성 특성 및 메커니즘에 대한 연구와 약물 스크리닝에 유리합니다3.
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템은 제브라피시4를 포함한 다양한 종의 게놈 편집에 널리 적용되었습니다. gRNA 유도를 통해 CRISPR/Cas9 시스템은 표적 부위에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있으며, 이는 상동성 지향 복구(HDR) 경로를 통해 표적 부위와 기증자 DNA 템플릿의 재조합을 통해 단일 염기 치환을 가능하게 합니다. 그러나, 이 염기 치환 방법의 효율은 매우 낮은데, 이는 세포 DNA 복구 과정이 주로 삽입 및 결실(indel) 돌연변이를 동반하는 비상동 말단 결합(non-homologous end-joining, NHEJ) 경로에 의해 수행되기 때문이다5. 다행스럽게도 CRISPR/Cas9 기반 단일 염기 편집 기술은 DSB를 유도하지 않고도 보다 효율적인 단일 염기 편집이 가능한 염기 편집기를 사용하여 이 문제를 크게 완화합니다. 염기 편집기의 두 가지 주요 클래스인 아데닌 염기 편집자(ABE)와 시토신 염기 편집자(CBE)는 A· T에서 G· C와 C·G에서 T· A는 각각 6,7,8,9,10,11이다. 이 4가지 유형의 염기 치환은 인간 병원성 변이체의 30%를 차지한다12. PmCDA1, BE 시스템, CBE4max, ABE7.10 및 ABE8e를 포함한 두 종류의 기본 편집기는 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 특히 BE4max 및 ABE8e는 높은 편집 활동 13,14,15,16,17,18,19를 달성하는 것으로 보고되었습니다.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 큰개자리 개(S. canis)를 포함한 다양한 종의 Cas9 단백질이 제브라피쉬 유전자 편집에 구현되었으며, Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)가 가장 널리 사용되고 있습니다 20,21,22,23. 그러나, SpCas9는 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 있는 표적 부위만 인식할 수 있으며, 이는 편집 가능한 범위를 제한하고 병원성 관심 부위 근처에서 적절한 서열을 발견하지 못하게 할 수 있다24. 목표 범위를 확장하기 위해 다양한 SpCas9 변형이 유도 진화 및 구조 유도 설계를 통해 다양한 PAM을 인식하도록 설계되었습니다. 그러나 동물, 특히 제브라피쉬에서 효과적인 변종은 거의 없으며, 이는 SNV 관련 질병 연구에서 제브라피쉬의 적용을 제한합니다25,26,27,28. 최근에, 덜 엄격한 PAM 제한(NYN보다 NRN에 대한 선호도가 더 높은 SpG에 대한 NGN 및 SpRY에 대한 NNN)을 갖는 SpCas9, SpG 및 SpRY의 두 가지 변이체가 인간 세포 및 식물에서 높은 편집 활성을 나타내는 것으로 보고되었습니다 29,30,31,32. 그 후, SpG 및 SpRY뿐만 아니라 SpRY 매개 CBE 및 SpRY 매개 ABE와 같은 다수의 중재 기본 편집기도 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 이는 SNV 관련 질병의 기계론적 연구 및 약물 스크리닝에서 제브라피쉬 모델의 적용을 향상시킬 것입니다 18,33,34,35. 또한, i-Silence는 ATG에서 GTG 또는 ACG36으로의 ABE 매개 시작 코돈 전환을 통해 효과적이고 정확한 유전자 녹아웃 전략으로 제안되었습니다. i-Silence 전략과 SpRY 매개 베이스 편집기 zSpRY-ABE8e의 조합은 질병 모델링을 위한 새로운 방법을 제공한다(18). 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 zSpRY-ABE8e를 사용하여 유전자 편집을 수행하여 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 모델을 구성하는 방법을 보여줍니다. 제브라피쉬 모델에 나타나는 편집 효율성과 표현형을 평가하고 분석했습니다.

<table><tbody><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9539</td><td>1.5% 아가로스는 주입판</td></tr><tr><td>보로실리케이트 유리 캐필러리를 만드는 데 사용됩니다&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 30-0016</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress Ultra One Step 클로닝 키트</td><td>Vazyme</td><td>C115</td><td>키트 주입 클론용&nbsp;</td></tr><tr><td>코돈 최적화 서비스</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond Microcaps</td><td>P1299-1PAK</td><td>길이:32 mm, 용량:0.5 &mu; L</td></tr><tr><td>EasyEdit gRNA 서비스</td><td>GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Scientific Instrument</td><td>11254-20</td> Meedle <td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>를 분해하는 데 사용됨&nbsp;<td>더듬기 기구</td><td>P-97</td>은 <td>유리 모세혈관을 당기는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>HotStart Taq PCR StarMix</td><td>Genstar</td><td>A033-101</td>은 <td>PCR 반응에 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>지능형 인공 기후 상자</td><td>TENLIN</td><td>PRX-1000A</td>는 <td>제브라피쉬 배아를 배양하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 메틸셀룰로오스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td>는 <td>제브라피쉬를 촬영할 때</td></tr><tr><td>Microloader 피펫 팁과 사진을 찍을 때 사용합니다. 주의;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>mMACHINE 키트&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mut Express II 빠른 돌연변이 유발 키트 V2</td><td>Vazyme</td><td>C214-01</td><td>현장 지시 돌연변이 유발</td></tr><tr><td>공압 마이크로인젝터</td><td>ZGene Biotech</td><td>ZGPCP-1500 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>pT3TS-zSpCas9</td><td>Addgene</td><td>46757</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE 키트&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td>RNA 정제용</td></tr><tr><td>키트 Sanger 시퀀싱 서비스</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨, 과립</td><td>Sangon</td><td>A100173-0500</td><td>NaOH 게놈 추출에 사용됨</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX10</td><td>표현형</td></tr><tr><td>SZ 시리즈 줌 스테레오 현미경</td><td>CNOPTEC</td><td>SZ650</td><td></td></tr><tr><td>T3 mMESSAGE</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td>키트의 사진에 사용되며, 시험관 전사를 위한 키트;</td></tr><tr><td>TIANprep 미니 플라스미드 키트</td><td>TIANGEN</td><td>DP103-03</td><td>플라스미드 추출 키트</td></tr><tr><td>TIANquick 미니 정제 키트</td><td>TIANGEN</td><td>DP203-02</td><td>선형 플라스미드 정제 키트</td></tr><tr><td>트리카인</td><td>시그마-알드리치</td><td>E10521</td><td>제브라피쉬 Tris</td></tr><tr><td>(하이드록시메틸) 아미노메탄</td><td>Sangon</td><td>A600194-0500</td><td>Tris&middot의 구성 요소; 게놈 추출에 사용되는 HCl</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td>플라스미드 선형화에 사용되는 제한 엔도뉴클레아제</td></tr></tbody></table>

zspry-abe8e를 사용한 인간 유전 질환의 zebrafish 모델링을 위한 효율적인 pam 없는 염기 편집

Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e

CRISPR/Cas9 기술은 인간 유전 질환 모델링, 질병 발병기전 연구 및 약물 스크리닝을 위한 제브라피쉬의 가치를 높였지만, 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)로 인한 인간 유전 질환의 정확한 동물 모델을 만드는 데 있어 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 한계가 주요 장애물입니다. 지금까지 광범위한 PAM 호환성을 가진 일부 SpCas9 변종은 제브라피쉬에서 효율성을 보여주었습니다. 최적화된 SpRY 매개 아데닌 염기 편집기(ABE), zSpRY-ABE8e 및 합성 변형 gRNA를 제브라피쉬에 적용하면 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌-구아닌 염기 전환이 가능해졌습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬에서 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 위한 프로토콜입니다. zSpRY-ABE8e mRNA와 합성 변형 gRNA의 혼합물을 제브라피쉬 배아에 주입하여 TSR2 리보솜 성숙 인자(tsr2)의 병원성 부위를 시뮬레이션하는 정확한 돌연변이로 제브라피쉬 질병 모델을 구성했습니다. 이 방법은 질병 메커니즘 및 치료법을 연구하기 위한 정확한 질병 모델을 확립하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

TSR2의 돌연변이는 다이아몬드 블랙팬 빈혈(DBA)을 유발하는 것으로 보고되었습니다42. 여기에서 DBA 제브라피쉬 모델은 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 돌연변이로 구성되었습니다. 제브라피쉬 tsr2의 시작 코돈의 아데닌은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 성공적으로 구아닌으로 전환되었습니다(그림 3).
Sanger 염기서열 분석 결과의 EditR 분석은 tsr2 시작 코돈의 아데닌 염기에서 A/G 중첩이 있음을 보여주었습니다(그림 4).
F0 창시자가 이전에 생성된 tsr2 이형접합체 돌연변이 성인과 교배된 후, 수정 후 2일(dpf)에 현미경으로 배아 표현형을 관찰했습니다. 몇몇...

이 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구성하기 위해 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 수행하는 방법을 설명합니다.

zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

CRISPR/Cas9 technology has increased the value of zebrafish for modeling human genetic diseases, studying disease pathogenesis, and drug screening, but ...

이 프로토콜을 통해 연구자들은 질병 관련 단일 뉴클레오티드 변이체에 대해 이전에는 사용할 수 없었던 여러 제브라피쉬 모델을 구축할 수 있습니다. PAM 제한은 정확한 동물 모델을 만드는 데 주요 장애물이며, zSpRY-ABE8e는 낮은 순열과 완화된 PAN 제한으로 효율적인 아데닌 염기 전환을 가능하게 합니다. 이 도구는 단일 뉴클레오티드 마린과 관련된 병원성 특성 질병 메커니즘을 연구하기 위한 정확한 제브라피쉬 모델을 구성하고 이 질병에 대한 약물 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.시작하려면 마이크로피펫 풀러 시스템을 설정하고 최소 30분 동안 예열하십시오. 유리 모세관을 당기려면 프로그램을 선택하고 r을 설정하십시오.amp 테스트 값을 열로, 50을 당김으로, 속도를 100으로, 시간을 50으로, 압력을 30으로 설정합니다. 그런 다음 모세관이 홈에 있는지 확인합니다.pull start/stop"을 눌러 프로그램을 실행합니다. 당겨진 모세관을 보존하려면 바늘을 매달아 놓은 틈이 있는 폼에 삽입하십시오. 실험을 위해 원고에 설명된 zSpRY-ABE8e mRNA를 사용하고 양쪽 끝에서 2'O-메틸 포스포로티오에이트로 변형된 sgRNA를 쉽게 편집할 수 있습니다.gRNA 설계의 경우, zSpRY-ABE8e가 NYN PAM보다 NRN PAM에 대해 더 높은 선호도를 나타내므로 NRN을 PAM 서열로 우선적으로 선택합니다. 타겟 아데닌 뉴클레오티드는 프로토스페이서를 따라 세 번째부터 아홉 번째 뉴클레오티드까지 고활성 편집 창에 들어간다. 주사 전날 밤에 번식 탱크를 설치하십시오.칸막이를 삽입하고 각 탱크에 암컷 제브라 피쉬 2 마리와 수컷 제브라 피쉬 1 마리를 놓습니다. 각 탱크 위에 뚜껑을 덮습니다. 다음날 아침, RNase가 없는 팁, 튜브 및 장갑을 사용하여 해동된 mRNA와 EEgRNA를 얼음 위에서 각각 마이크로리터당 400 및 200 나노그램의 최종 농도로 혼합합니다.공압 마이크로 인젝터를 구성하려면 먼저 공기 펌프의 분압 밸브를 닫습니다. 그런 다음 메인 밸브를 열고 가스 실린더의 나사를 풀고 분압 밸브의 압력을 0.2메가파스칼로 조정합니다. 이제 마이크로 인젝터를 켜고 모드를 타이머로 설정합니다.매개변수 압력 밸브를 제곱인치당 20파운드로 조정하고 타이머 값을 0.040초로 조정합니다. 미세 집게를 사용하여 실체 현미경으로 당겨진 유리 모세관의 바늘을 각도로 부러뜨립니다. 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 mRNA/gRNA 혼합물을 유리 모세관 끝에 추가하고 바늘을 미세 매니퓰레이터에 부착합니다.마이크로캡을 사용하여 주입당 2나노리터 혼합물을 생성하도록 압력 및 타이머 값을 구성합니다. 10-15 분 동안 물고기를 사육 한 후 여과기에 알을 모으십시오. 실체 현미경으로 세포 단계와 난자의 질을 검사합니다.편집 효율성을 높이기 위해 주입용 단세포 계란을 선택하십시오. 1.5% 아가로스 주입 플레이트에 난자를 정렬하고 현미경을 사용하여 2나노리터의 RNA 혼합물을 배아 세포에 주입합니다. E3 버퍼가 있는 페트리 접시에 계란을 모아 섭씨 28도에서 배양합니다.죽은 난자를 제거하고 수정 후 48시간 동안 12시간마다 배양 완충액을 교체합니다. 수정 후 48시간 후, 무작위로 선택된 6개의 주입된 배아로 구성된 3개의 풀을 PCR 튜브에 수집합니다. 무작위로 선택된 6개의 대조군 배아가 수집되면 피펫을 사용하여 잔류 E3 완충액을 흡인합니다.배아에 40 밀리 몰의 수산화 나트륨 50 마이크로 리터를 첨가하십시오. 튜브를 섭씨 95도의 금속 욕조에 20분 동안 넣은 다음 15초 동안 소용돌이칩니다. pH 8에서 1몰 트리스 염산염 4마이크로리터를 각 튜브에 추가합니다.튜브를 2000g에서 실온에서 10초 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 PCR 튜브로 옮깁니다. PCR 튜브에서 1마이크로리터의 상층액을 제거하고 Sanger 염기서열 분석에 사용합니다.그런 다음 남은 상청액을 섭씨 20도에서 보관하십시오. Sanger 염기서열 분석 데이터를 분석하려면 먼저 염기서열 분석 파일을 ab1 파일 업로드 상자에 업로드합니다. 20개의 염기쌍 gRNA 염기서열을 5'에서 3' 방향으로 gRNA 염기서열 입력 상자에 입력합니다.5' 시작 및 3' 끝 상자에 해당 베이스 위치를 입력합니다. 예측 편집"을 클릭하고 시퀀싱 데이터의 품질을 확인하여 기본 편집 효율성을 얻으십시오. 다이아몬드 블랙팬 빈혈 제브라피쉬 모델은 Tsr2의 시작 코돈의 아데닌을 구아닌으로 전환하여 구성되었습니다.서열 데이터의 EditR 분석은 Tsr2 시작 코돈의 아데닌 염기에서 AG 중첩을 입증했습니다. 생후 2일 된 Tsr2 배아의 표현형은 대조군 배아에 비해 눈이 더 작은 것으로 나타났습니다. 부어오른 심낭도 돌연변이 배아에서 관찰되었습니다.효율적인 기본 편집을 위해서는 실험의 성공을 위한 전제 조건인 앞서 언급한 지침 설계 원칙을 엄격히 준수하십시오. 정확한 모델은 단일 뉴클레오티드 변이체 관련 질병 연구에 필수적입니다. SprY-ABE8e의 개발은 정확한 모델링을 위한 효과적인 도구를 제공하여 질병 메커니즘 및 치료법 연구를 촉진하는 데 도움이 됩니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 우리는 개발을위한 체계적인 접근 방법을 제시 생리 학적 관련성이 민감하고...

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

제브라피쉬는 유전 및 발달 연구를 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 비드 이식은 국소 세포 환경에 변화를 일으켜 발달 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 귀중한 조직 조작 기술입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 마이크로비드 이식을 수행하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.

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Zebrafish는 유전자 편집 기술의 출현으로 특히 생물 의학 연구에서 안정적인 유전자 모델 생물으로 사용 되었습니다. 애벌레 고기 예상 되는, DNA 추출 및 유전자 식별 전하실 수 있습니다. 여기, 꼬리 자르기, 빠르면 72 h 후 수정 하 여, zebrafish 애벌레에 대 한 효율적인 유전형 절차를 설명 합니다.

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진화 모델 시스템 Astyanax mexicanus유전자의 조작 방법을 설명합니다. 세 가지 다른 기술 설명: 중재 하는 Tol2 transgenesis, CRISPR/Cas9, 및 morpholinos를 사용 하 여 식의 최저 사용 하 여 게놈의 타겟된 조작. 이 도구는 기본 표면 및 동굴 주거 형태 사이의 변형 유전자의 직접 조사를 용이 해야.

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이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 제브라피쉬 배아에서 정밀한 녹인 편집을 용이하게 하는 접근 방식을 설명합니다. 표현형 파이프라인은 Long QT 증후군 관련 유전자 변이체를 모델링하기 위한 이러한 기술의 적용 가능성을 입증하기 위해 제시됩니다.

CRISPR-Cas9 매개 제브라피쉬 하트의 정확한 녹인 편집

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

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여기에서는 제브라피시 유충에서 형광 단백질 태그로 단백질을 라벨링하는 프로토콜을 제시하며, 이는 새로 개발 및 수정된 생체 내 시스템으로, 제브라피시의 저농도 단백질을 시각화하는 데 특히 유용합니다.

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RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

배우세요 zSpRY-ABE8e를 이용한 PAM 제한 없는 아데닌 염기 편집으로 Danio rerio에서 인간 유전 질환을 정밀 모델링하는 방법입니다. Diamond-Blackfan Anemia 모델 구축과 표현형 분석을 통해 단일염기 변이 관련 질병 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

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