Name: 시상하부 키스펩틴 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 기록의 표적입니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 배우세요 뇌절편에서 키스펩틴 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록 방법을. 이 전기생리학 기술은 신경내분비학 연구와 생식 건강 이해에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 상파울루 연구 재단[FAPESP 보조금 번호: 2021/11551-4(JNS), 2015/20198-5(TTZ), 2019/21707/1(RF); 및 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES) - Finance Code 001"(HRV)의 지원을 받았습니다.

모든 동물 시술은 상파울루 대학의 생물 의학 연구소 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 브라질 동물 실험 대학에서 채택한 윤리 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 용액 준비
<ol><li>내부 용액 준비 참고: 내부 용액은 패치 클램프 마이크로피펫을 채우고 셀 내부와 접촉합니다( 그림 2의 파일 참조). 내부 용액은 측정할 활동의 종류에 따라 달라질 수 있다33.<ol><li>실험 목적과 적절한 레코드 유형을 고려하여 내부 솔루션을 선택합니다. 전류 클램프 모드에서 막 전위를 기록하려면 120mM K-글루코네이트, 1mM NaCl, 5mM EGTA, 10mM HEPES, 1mM MgCl2, 1mMCaCl2, 3mM KOH, 10mM KCl 및 4mM(Mg)-ATP로 구성된 내부 용액을 사용합니다. 표 1에 주어진 바와 같이 원하는 최종 부피에 따라 모든 염의 무게를 측정한다.</li>
		<li>용액의 최종 부피의 90%에 도달하기에 충분한 탈이온수를 사용하십시오. 이 부피는 pH와 삼투압을 조정하기에 충분한 공간을 보장합니다.</li>
		<li>모든 성분을 첨가하고 완전히 혼합한 후 pH 측정기를 사용하여 5M KOH로 pH를 7.2-7.3으로 조정합니다. 삼투압계를 사용하여 약 275-280mOsm이어야 하는 삼투압을 확인합니다(필요한 경우 아래로만 조정).</li>
		<li>내부 용액을 미리 준비하고 8°C에서 보관한다. 실험 당일에 ATP를 추가합니다. ATP 함유 내부 용액을 -20°C(1mL 분취량)에서 3-4개월 동안 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>슬라이싱 용액의 제조<ol><li>238 mM 수크로오스, 2.5 mM KCl, 26 mMNaHCO3, 1.0 mM NaH2PO4, 10 mM 글루코스, 1.0 mM CaCl2, 및 5.0 mM MgCl2를 포함하는 슬라이싱 용액을 준비한다. 표 2에 나타낸 바와 같이 원하는 최종 부피에 따라 모든 염의 무게를 측정한다. 준비할 이 용액의 정확한 부피는 절단 챔버의 크기에 따라 다릅니다.</li>
		<li>모든 염을 탈이온수에 혼합하면서 카보겐(95% O2 및 5%CO2)으로 일정하게 포화시킨다. 폴리에틸렌 튜브(외경 1.57mm [OD] x 내경 [ID] 1.14mm)를 카보겐 실린더에 부착하여 슬라이싱 용액에 카보겐을 공급합니다. 슬라이싱 용액이 들어 있는 비커 내부에서 튜브의 열린 끝을 잡습니다.</li>
		<li>모든 성분을 잘 섞은 후 pH 측정기를 이용하여 10% 질산으로 pH를 7.3으로 조절한다. 삼투압을 사용하여 290-295mOsm이어야 하는 삼투압을 확인합니다(필요한 경우 아래로만 조정). 그 후, 용액을 0-2°C로 냉각시킨다.</li>
	</ol></li>
	<li>녹음을 위한 aCSF 솔루션 준비<ol><li>124 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 26 mMNaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 1.2 mMMgSO4, 5 mM 포도당 및 2.5mM CaCl2를 함유하는 기록을 위한 인공 뇌척수액(aCSF) 용액을 준비한다. 표 3에 제시된 원하는 최종 부피에 따라 모든 염의 무게를 측정한다.</li>
		<li>모든 염을 탈이온수에서 혼합하면서, 단계 1.2.2에 기재된 바와 같이, 카르보겐(95% O2 및 5%CO2)으로 일정하게 포화시킨다.</li>
		<li>모든 성분을 첨가하고 혼합한 후 pH 측정기를 사용하여 pH를 7.3(10% 질산 사용 가능)으로 조정합니다. 삼투압을 사용하여 290-300mOsm이어야 하는 삼투압을 확인합니다. 그 후, aCSF를 비커에 붓고 30°C의 수조에서 유지한다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 뇌 해부 및 슬라이싱
참고: 다른 뇌 구조는 다른 평면(관상, 시상 또는 수평 슬라이스)에서 절단해야 할 수 있으므로 슬라이스를 얻기 위한 정확한 접근 방식은 관심 있는 뇌 영역에 따라 다릅니다. 전형적으로, AVPV/PeN 및 ARH에서 Kiss1 발현 세포를 연구하기 위해(여기서는 AVPV/PeN 키스펩틴 뉴런 및 ARH키스펩틴 뉴런으로 표시됨; 그림 2A, B), 관상 뇌 절편 (200-300 μm)은 일반적으로 17,19,20,21,34로 만들어집니다. AVPV/PeN 키스펩틴 뉴런은 브레그마에서 약 0.5 내지 -0.22 mm에 위치하는 반면, ARH키스펩틴 뉴런은 -1.22 내지 -2.70 mm에 위치한다. 핵 위치는 입체 마우스 뇌 아틀라스(35) 또는 앨런 마우스 뇌 참조 아틀라스(http://mouse.brain-map.org/)를 사용하여 결정될 수 있다. 성인 Kiss1-Cre/GFP 암컷(diestrus-stage) 및 수컷 마우스36마리가 이 연구에 사용되었습니다.
<ol><li>뇌 제거<ol><li>해부 부위와 뇌를 추출하는 데 필요한 도구(참수 가위, 홍채 가위, 카스트로비에호 곡선 가위, 절골술, 핀셋, 주걱, 여과지, 페트리 접시, 면도날, 시아노아크릴레이트 접착제)를 준비합니다.</li>
		<li>슬라이스를 만들기 전에 모든 후속 절차를 신속하게 수행해야하므로 해부가 수행 될 벤치를 준비하십시오. 비브라톰과 같은 슬라이싱 장치에 접근할 수 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>조직을 절단하기 전에 뇌 조각을 유지하기 위해 기록 챔버를 준비하십시오. 상업용 브랜드(재료 표)에서 24mm x 15mm x 2mm(L x W x H)의 수조 치수인 녹음 챔버를 구입하거나 사내에서 만드십시오. 참고: 사내 회수 챔버는 다음과 같이 제작할 수 있습니다: 9개의 웰을 사용할 수 있도록 24웰 플레이트를 절단합니다. 나일론 스크린을 아홉 개의 우물 바닥에 붙입니다. 우물 판의 나머지 부분과 함께 나일론의 하부가 자유로워지도록 받침대를 만드십시오. 이 적응된 염기는 aCSF가 들어 있는 500mL 비커 안에 넣을 수 있습니다(보충 그림 1).</li>
		<li>모든 것을 준비한 후 4 % -5 % 이소 플루 란을 사용하여 흡입 마취제로 동물을 마취시킵니다. 마취는 윤리위원회가 승인 한 프로토콜에 따라야합니다. 동물이 움직이지 않은 직후, 꼬리와 발의 꼬집음 테스트를 수행하여 동물이 심하게 마취되었는지 확인하십시오.</li>
		<li>세포 생존력을 높이기 위해 심장이 여전히 활동하는 동안 생쥐를 빠르게 참수하십시오. 참수 후 신속하게 뇌를 채취하십시오.</li>
		<li>수술 용 가위로 동물의 두개골 상단에있는 꼬리에서 주둥이까지 피부를 절개하고 동물의 머리에서 두피를 제거합니다. 다음으로, 홍채 가위로 시상 봉합사를 따라 정수리 판을 자르고 후두골을 제거하십시오. 절골술을 정수리 뼈 아래로 밀어 넣고 뇌가 노출 될 때까지 부드럽게 잡아 당깁니다.</li>
		<li>뇌를 노출시킨 후 머리를 거꾸로 뒤집어 뇌를 부드럽게 내려 양쪽의 삼차 신경을 시각화 한 다음 카스트로 비에 호 곡선 가위를 사용하여 삼차 신경을 자릅니다. 시상 하부를 시각화 한 후 시신경을 확인하고 부드럽게 자릅니다. 알림: 시신경을 절단할 때 당기면 AVPV/PeN 핵이 포함된 인접한 시상하부 영역이 찢어지므로 주의하십시오.</li>
		<li>전두엽의 가장 앞부분을 잘라내고 뇌를 완전히 제거합니다. 슬라이스를 획득 할 때까지 슬라이싱 용액에 즉시 뇌를 담그십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>뇌 샘플 슬라이싱<ol><li>뇌를 여과지 (페트리 접시에지지)에 올려 놓고 초과 용액을 건조시킵니다. 그런 다음 날카로운 절단 면도날로 뇌간과 소뇌를 나머지 조직과 분리하는 관상 절단을 수행합니다.</li>
		<li>다음으로, 뇌의 꼬리 부분을 비브라톰의 바닥에 붙이고 슬라이싱 장치의 챔버를 0-2 °C로 냉각된 슬라이싱/aCSF 용액으로 채웁니다. 시술 중에 비브라톰 챔버 주변에 드라이아이스를 포장하여 슬라이싱 용액을 차갑게 유지합니다.</li>
		<li>면도날을 진동자에 삽입하고 장치의 적절한 절단 매개변수(속도 = 3, 주파수 = 9, 이송 = 250μm)를 설정합니다. 아크릴 이송 피펫(실리콘 젖꼭지에 부착된 거꾸로 된 파스퇴르 유리 피펫)을 사용하여 조직 슬라이싱 절차 중에 슬라이스를 회수 챔버(2.1.3단계에서 설명)로 옮깁니다. 슬라이스 획득 후 조직 회복을 위해 60분 동안 기다립니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 기록을 위한 세포 밀봉
<ol><li>녹음을 시작하기 전에 모든 장비(현미경, 증폭기, 디지타이저, 마이크로 매니퓰레이터 등)가 켜져 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>상용 브랜드(Table of Materials)의 기록 챔버를 기록용 aCSF 용액으로 현미경에 부착합니다. 관류 펌프를 사용하여 2mL/min의 속도로 aCSF를 지속적으로 관류합니다.</li>
	<li>관심 있는 뇌 조각(한 번에 하나씩)을 녹음실로 옮깁니다. 아크릴 이송 피펫(실리콘 젖꼭지에 부착된 거꾸로 된 파스퇴르 유리 피펫)을 사용하여 시상하부 슬라이스를 챔버로 옮깁니다. 슬라이스 앵커(재료 표)를 사용하여 슬라이스가 aCSF 관류 중에 움직이지 않도록 고정합니다.</li>
	<li>현미경에 부착된 기록 챔버의 중앙에 슬라이스를 놓습니다. 슬라이스 위치는 현미경으로 원하는 영역을 잘 볼 수 있고 기록 마이크로피펫에 완벽하게 도달할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다.</li>
	<li>침수 현미경의 저전력 대물 렌즈(10x 또는 20x)를 사용하여 슬라이스의 위치를 지정하고 관심 영역을 찾는 데 도움을 줍니다.</li>
	<li>관심 영역을 찾은 후, 대물 렌즈를 고배율 렌즈(63x)로 전환하고 조직 수준에 초점을 맞추고, 내인성 형광 단백질과 표적 영역의 세포 모양을 관찰하여 뇌 절편(20)의 표면에서 키스펩틴 세포를 찾습니다.</li>
	<li>가능한 대상 셀을 찾으면 마우스 커서로 컴퓨터 화면에 표시하거나 관심 영역 위에 정사각형과 같은 형식을 그려 표시합니다. 컴퓨터 화면 표시는 기록 마이크로피펫의 위치를 셀로 안내하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>표적 세포의 정확한 위치를 결정한 후 대물렌즈를 들어 올리고 내부 용액으로 채워진 기록 마이크로피펫을 도입합니다. 마이크로피펫을 전극 홀더에 놓을 때 내부 용액이 은 전극과 접촉하는지 확인하십시오. 알림: 마이크로피펫 준비, 전극 홀더의 배치 및 위치 지정에 대해서는33을 참조하십시오.</li>
	<li>마이크로피펫을 aCSF 용액에 담그기 전에 폴리에틸렌 튜브(≈130cm 더 긴)를 통해 마이크로피펫 홀더에 연결된 1-3mL 공기 충전 주사기를 사용하여 마이크로피펫에 파편이 들어가는 것을 방지하기 위해 양압을 가합니다. 거의 100-200 μL의 공기를 가하십시오.</li>
	<li>마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로피펫을 대물렌즈 중앙 아래로 안내합니다. 마이크로 매니퓰레이터의 버튼을 움직여 X-Y-Z 축의 마이크로피펫을 관심 있는 셀로 안내합니다.</li>
	<li>마이크로피펫의 끝이 보이도록 초점을 조정하고 초점을 슬라이스에 너무 가까이 두지 말고 더 가까이 가져옵니다. 마이크로 매니퓰레이터의 속도를 줄이고 마이크로 피펫을 초점 평면으로 천천히 내립니다. 마이크로피펫 팁이 슬라이스를 갑자기 관통하지 않고 세포/표적 영역의 표면에 닿을 때까지 천천히 하강하는지 확인합니다.</li>
	<li>마이크로피펫 홀더에 부착된 1-3mL 공기 충전 주사기를 사용하여 가벼운 양압(≈100μL)을 적용하여 접근 경로에서 이물질을 제거합니다.</li>
	<li>표적 세포에 초점을 맞추고 X-Y-Z 축에서 미세 매니퓰레이터를 천천히 움직여 마이크로피펫을 표적 세포에 더 가깝게 만듭니다. 마이크로피펫을 셀에 접촉하면 마이크로피펫 팁을 통해 가해지는 압력으로 인한 딤플이 관찰됩니다(그림 2C).</li>
	<li>딤플을 형성한 후 마이크로피펫이 셀에 근접하기 때문에 마이크로피펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 입으로 약하고 짧은 흡입(1-2초)하여 마이크로피펫과 셀 사이의 밀봉을 생성합니다(기가옴 씰 또는 기가씰 >1GΩ; 그림 2D). 씰을 형성하려면 vol을 사용하십시오.tage-clamp 소프트웨어의 모드. 씰 형성에 대한 자세한 내용은33을 참조하십시오.</li>
	<li>씰이 안정적으로 유지되면(기가옴 씰은 기계적으로 안정적이고 노이즈 간섭이 없어야 하며 약 1분 동안 관찰하여 결정됨) 유지 전압을 관심 있는 셀의 가장 가까운 생리학적 휴지 전위로 설정합니다. 키스펩틴 시상하부 뉴런의 경우 -50mV가 권장됩니다.</li>
	<li>세포에 밀봉된 마이크로피펫으로 입으로 짧은 흡입(음압)을 적용하여 원형질막을 파괴합니다(그림 2E). 파열된 멤브레인이 마이크로피펫을 막히지 않고 멤브레인 또는 셀의 상당 부분을 끌어당기지 않도록 충분한 힘으로 흡입을 수행할 때 적절한 전체 셀 구성이 달성됩니다.</li>
	<li>사용 된 시스템 설정 설명서를 확인하십시오. 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 직렬 저항(SR)과 전체 셀 커패시턴스(wcc)를 디지털 방식으로 확인하고 계산할 수 있습니다.</li>
	<li>전압 클램프 모드에서 세포막을 파괴한 후 전체 셀 옵션을 활성화하고 전체 셀 탭을 참조하는 자동 명령을 클릭합니다. 셀의 SR 및 wcc가 자동으로 계산되어 소프트웨어에 의해 즉시 표시됩니다. 이러한 파라미터는 재료 표33에 언급된 증폭기로 멤브레인 테스트를 수행하여 확인할 수도 있습니다.</li>
	<li>세포 생존율 매개변수를 확인하십시오. 키스펩틴 뉴런의 경우 전기생리학적 측정값이 SR < 25mΩ, 입력 저항 0.3GΩ, 전류 절대값 < 30pA> 유지되는지 확인합니다(개인 관찰 및 참조21). AVPV/PeN 키스펩틴 또는 ARH키스펩틴 뉴런의 wcc의 평균값은 생식선 온전한 마우스 20에서 ≈ 10-12pF입니다.</li>
	<li>실험 동안 SR 및 셀 정상 상태 커패시턴스를 모니터링합니다. 녹음 중에 SR이 20% 이상 변경되지 않고 멤브레인 커패시턴스가 안정적인지 확인합니다.</li>
	<li>소프트웨어 설정을 확인하십시오. 실험 유형에 따라 기록에 대한 특정 프로토콜을 만듭니다. 전류 클램프 모드에서 멤브레인 전위를 기록하기 위해 재료 표에 언급된 장비를 사용하여 2-4kHz에서 전기 생리학적 신호를 저역 통과 필터링하고 소프트웨어에서 오프라인으로 결과를 분석합니다(소프트웨어 정보는 재료 표 참조).</li>
	<li>전체 셀 구성이 제대로 이루어지면 전압 클램프 모드에서 시냅스 전류를 측정합니다(그림 2G). 레시 멤브레인 전위(RMP)의 변화와 전류 클램프 모드에서 유도된 RMP 변동을 기록합니다(그림 2H). 세포막의 탈분극과 같은 RMP의 변화는 그림 3.2에 표시된 대로 알려진 약물/신경 전달 물질을 욕조에 투여하여 유도할 수 있습니다(1단계에 설명됨). 알림: 전류 클램프 모드에서 양수 또는 음극 전류를 주입하여 멤브레인 전압을 원하는 전압으로 유지할 수 있습니다. 키스펩틴 뉴런의 경우 일반적으로 막 전위의 자발적인 변화를 기록하기 위해 제로 전류 주입(I = 0)을 설정합니다.</li>
</ol>

선언할 이해 상충이 없습니다.

전체 세포 패치 클램프 기술의 개발은 과학계에 상당한 영향을 미쳤으며 과학 연구를 개발하고 여러 발견을 가능하게 하는 데 가장 중요한 것으로 간주되었습니다. 과학에 대한 그것의 영향은 1991년 노벨 의학상에서 절정에 달하기에 충분했으며, 이 발견은 생리학적 및 병리학적 조건에서 이온 채널이 어떻게 기능하는지에 대한 더 나은 이해와 치료제의 잠재적 표적 식별의 문을 열었기 때문입니다 11,39,40,41. 의학 분야에서 이 기술을 사용하여 이루어진 뛰어난 발견 중 하나는 임상적으로 사용되는 여러 물질이 이온 채널(예: 국소 마취제, 항부정맥제, 항당뇨병제 및 근육 이완제)과 직접 상호 작용한다는 것입니다42. 따라서 그 적용 가능성은 임상 연구소 및 기초 연구...

호지킨(Hodgkin)과 헉슬리(Huxley)는 여러 과학 연구에서 기술된 활동 전위에 대한 최초의 세포 내 기록을 만들었습니다. 이 기록은 직경이 큰 오징어 축삭(~500μm)에서 수행되어 미세 전극을 축삭 내부에 배치할 수 있습니다. 이 연구는 과학 연구에 큰 가능성을 제공했으며, 나중에 활동 전위 생성 1,2,3,4,5,6,7,8의 이온 기초를 연구하는 데 사용 된 전압 클램프 모드의 생성으로 절정에 달했습니다. 수년에 걸쳐이 기술은 개선되었으며 과학 연구 6,9에 널리 적용되었습니다. 1970년대 후반 Erwin Neher와 Bert Sakmann이 시작한 연구를 통해 이루어진 패치 클램프 기술의 발명으로 연구자들은 단일 전극만을 사용하여 거의 모든 유형의 세포에서 단일 이온 채널과 세포막 전위 또는 전류를 기록할 수 있었습니다 9,10,11,12. 패치 클램프 기록은 배양된 세포 또는 조직 절편과 같은 다양한 조직 제제에서 전압 클램프 모드(예: 전압 의존 전류 및 시냅스 전류를 기록할 수 있는 설정 전압에서 세포막을 유지) 또는 전류 클램프 모드(예를 들어 이온 전류에 의해 유도된 휴지막 전위의 변화를 기록할 수 있음)에서 수행할 수 있습니다. 활동 전위 및 시냅스 후 전위 주파수).
패치 클램프 기술을 사용하여 몇 가지 주목할만한 발견이 가능했습니다. 실제로, 제3뇌실의 심실 주위 영역(RP3V) 및 시상하부의 아치형 핵(ARHkisspeptin)13,14,15 특히 관심이 있습니다. 2010년 Ducret et al. 또 다른 전기생리학적 도구인 느슨한 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 생쥐에서 AVPV/PeNKisspeptin뉴런의 첫 번째 기록을 수행했습니다. 이 연구는 AVPV/PeN키스펩틴 뉴런에 대한 전기적 설명을 제공했으며 이들의 발화 패턴이 발정 주기에 의존한다는 것을 입증했습니다16. 2011년 Qiu et al.은 ARH키스펩틴 뉴런이 내인성 심박조율기 전류를 발현한다는 것을 입증하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용했다17. 그 후, Gottsch et al. 키스펩틴 뉴런이 자발적인 활동을 나타내고 h형(심박조율기)과 T형 칼슘 전류를 모두 발현한다는 것을 보여주었으며, 이는 ARH키스펩틴 뉴런이 다른 중추신경계 심박조율기 뉴런과 전기생리학적 특성을 공유함을 시사한다18. 또한, ARH 키스펩틴 뉴런은 유성 이형성 발화 속도를 나타내고 AVPV/PeN키스펩틴 뉴런은 ATP 민감성 칼륨 채널(K ATP)에 의해 영향을 받는 바이모달 휴지막 전위(RMP)를 나타낸다는 것이 입증되었습니다19,20. 또한, 생식선 스테로이드가 생쥐 19,20,21에서 키스펩틴 뉴런의 자발적인 전기적 활동에 긍정적인 영향을 미친다는 것이 확인되었습니다. 키스펩틴 뉴런의 전기생리학적 특성을 연구한 첫 번째 연구는 16,17,18,19,20에 언급되어 있습니다. 그 이후로 많은 연구에서 키스펩틴 뉴런의 전기적 활성을 조절하기에 충분한 인자/신경 조절제를 입증하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용했습니다(그림 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
여기에서 다루지 않은 다른 세포 유형 중에서 번식에 필요한 뉴런 연구에 대한 이 기술의 중요성을 감안할 때 이 기사에서는 용액 준비, 뇌 해부 및 절단, 기록을 위한 세포막 밀봉 수행과 같은 전체 세포 패치 클램프 기술 개발을 위한 기본 단계를 설명합니다. 또한 최적의 실험 성능을 위해 제어해야 하는 장점, 기술적 한계 및 중요한 변수와 같은 기술에 대한 관련 문제에 대해 논의합니다.

<table><tbody><tr><td><강>CSF, 내부 및 슬라이싱 용액용 화합물</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma 알드리치/다양한</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 Aldrich / 다양한</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>시그마 Aldrich / 다양한</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>K- 글루 콘산</td><td>시그마 Aldrich / 다양한</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>시그마 Aldrich / 다양한</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 </td> <td>시그마 Aldrich / 다양한</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MgSO 4 </td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td> <td>Aldrich/다양한</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>질산</td><td>Sigma Aldrich/다양한</td><td>225711</td><td>주의</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 알드리치/다양한</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Air table</td><td>TMC</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>분자 장치</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>다양한</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DIGIDATA 1440 저소음 데이터 수집 시스템</td><td>분자 장치</td><td>DD1440</td><td></td></tr><tr><td>디지털 연동 펌프</td><td>Ismatec</td><td>ISM833C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>패러데이 케이지</td><td>TMC</td><td>81-333-03</td><td></td></tr><tr><td>이미징 카메라</td><td>Leica</td><td>DFC 365 FX</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>Roe-200</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td>DM6000 FS</td><td></td></tr><tr><td>Osteotome</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia / various</td><td>128</td><td></td></tr><tr><td>Recovery chamber</td><td>Warner Instruments / Harvard</td> <td>apparatus-can</td> <td>be house</td></tr><tr><td>녹음 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>640277</td><td></td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Fisher Scientific / various</td><td>FISH-14-375-10; FISH-21-401-20</td><td></td></tr><tr><td>비브라톰&nbsp;</td><td>라이카</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>수조&nbsp;</td><td>Fisher Scientific /various</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td> 소프트웨어 및 시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 10 소프트웨어</td><td>Molecular</td> <td>Devices-Commander</td> <td>Software</td></tr><tr><td>LAS X wide field system</td><td>Leica-Image</td><td></td> <td>acquisition and analysis</td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>Commander Software</td></tr><tr><td>PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS</td><td>Molecular Devices</td><td>Pclamp 10 Standard</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl 전극, 펠릿, 1.0 mm</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-1309</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 지혈 집게</td><td>다양한</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제</td><td>LOCTITE/다양한</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>참수 가위</td><td>다양</td> <td>●</td><td></td></tr> <tr><td>여과지</td><td>다양</td> <td>●</td><td></td></tr> <tr><td>유리 모세관 (마이크로 피펫)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>홍채 가위</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/various</td><td>65-66</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 유리 피펫&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/다양한</td><td>CLS7095B9-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>다양한</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙&nbsp;</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0756</td><td></td></tr><tr><td>뇌 박리용 면도날</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-1</td><td></td></tr><tr><td>비브라톰용 면도날</td><td>TED PELLA</td><td>TEDP-121-9</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/various</td><td>71-72, 48,49; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 젖꼭지</td><td>다양한</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>슬라이스 앵커&nbsp;</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0246</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Merck Millipore Ltda</td><td>SLGVR13SL</td><td>Millex-GV 0.22 &mu; m</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Bonther equipamentos & Tecnologia/various</td><td>131, 1518</td><td></td></tr></tbody></table>

시상하부 키스펩틴 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 기록의 표적입니다.

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

키스펩틴은 시상하부-뇌하수체-생식선(HPG) 축의 성숙과 생식력에 필수적입니다. 시상 하부의 아치형 핵뿐만 아니라 전복부 뇌실 주위 핵과 뇌실 주위 핵에 위치한 시상 하부 키스 펩틴 뉴런은 다른 세포 중에서도 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH) 뉴런에 투영됩니다. 이전 연구에서는 키스펩틴 신호 전달이 Kiss1 수용체(Kiss1r)를 통해 발생하여 궁극적으로 GnRH 뉴런 활동을 흥분시키는 것으로 나타났습니다. 인간 및 실험 동물 모델에서 키스펩틴은 GnRH 분비를 유도하고 결과적으로 황체 형성 호르몬(LH) 및 난포 자극 호르몬(FSH) 방출에 충분합니다. 키스펩틴은 생식 기능에 필수적인 역할을 하기 때문에 연구자들은 시상하부 키스펩틴 뉴런의 내재적 활동이 생식 관련 작용에 어떻게 기여하는지 평가하고 이러한 특성을 변화시킬 수 있는 주요 신경 전달 물질/신경 조절제를 식별하기 위해 노력하고 있습니다. 전체 세포 패치 클램프 기술은 설치류 세포에서 키스펩틴 뉴런 활동을 조사하는 데 유용한 도구가 되었습니다. 이 실험 기술을 통해 연구자들은 자발적 흥분성 및 억제성 이온 전류, 휴지 막 전위, 활동 전위 발사 및 세포막의 기타 전기생리학적 특성을 기록하고 측정할 수 있습니다. 본 연구에서는 시상하부 키스펩틴 뉴런을 정의하는 전기생리학적 측정으로 알려진 전체 세포 패치 클램프 기술의 중요한 측면과 이 기술에 대한 관련 문제에 대한 논의를 검토합니다.

시상하부 키스펩틴 뉴런의 활성에 대한 인간 재조합 성장 호르몬(hGH)의 가능한 효과를 연구하기 위해 뇌 조각에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하고 이 호르몬이 AVPV/PeN 키스펩틴 및 ARH키스펩틴 뉴런의 활성에 급성 변화를 일으키는지 여부를 평가했습니다. 성인 Kiss1-Cre/GFP 암컷(diestrus-stage) 및 수컷 마우스36마리가 이 연구에 사용되었습니다. 생식선-온전한 동물들이 실험을 위해 선택되었는데, 그 이유는 그들의 시상하부 키스펩틴 뉴런의 성질이 성 스테로이드 수치에 따라 달라질 수 있기 때문이다19,20. 남녀 간의 차이를 평가하는 것은 본 연구의 범위를 벗어났지만 독자는 Croft et al. 및 Frazão et al.19,20<sup clas...

여기에서 우리는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH) 세포의 주요 조절자인 키스펩틴 뉴런을 포함하는 뇌 조각에 전체 세포 패치 클램프를 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 키스펩틴 뉴런 활동에 대한 지식을 추가함으로써 이 전기생리학적 도구는 지난 20년 동안 신경내분비학 분야에서 상당한 발전의 기초가 되었습니다.

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...

세포막의 전기생리학적 특성을 측정함으로써, 세포의 전기적 활성을 조절한다는 것을 증명하는 주요 문제가 해결될 수 있다. 전체 세포 패치 클램프 기록은 개별 세포의 이온 전류를 연구하고 다양한 자극에 대한 세포 반응을 조사하는 주변 기술입니다. 전체 셀 패치 클램프 사전 녹음에서 최고의 성능은 많은 연습과 공부를 통해 얻을 수 있습니다.뇌 해부를 시작하려면 목이 잘린 동물의 두개골 상단에있는 피부에 수술 용 가위를 사용하여 코에서 주둥이까지 절개하고 두피를 제거하십시오. 다음으로, 홍채 가위로 시상 봉합사를 따라 정수리 간 판을 자르고 후두골을 제거하십시오. 절골술을 정수리 뼈 아래로 밀어 넣고 뇌가 노출 될 때까지 부드럽게 잡아 당깁니다.뇌를 노출 한 후 머리를 거꾸로 뒤집습니다. 뇌를 부드럽게 낮추어 양쪽의 삼차 신경을 시각화합니다. 그런 다음 Castroviejo 곡선 가위를 사용하여 삼차 신경을 자릅니다.시상 하부를 시각화 한 후 시신경을 확인하고 부드럽게 자릅니다. 다음으로, 전두엽의 먼 앞쪽 부분을 자릅니다. 뇌를 제거하고 슬라이스를 얻을 때까지 슬라이싱 용액에 즉시 담그십시오.뇌 샘플을 자르려면 뇌를 여과지에 올려 놓고 초과 용액을 건조시킵니다. 그런 다음 날카로운 절단 면도날로 뇌간을 소뇌와 나머지 조직에서 분리하는 관상 절단을 수행합니다. 다음으로, 뇌의 코들 부분을 진동 자형의 바닥에 붙이고 슬라이싱 장치 챔버를 섭씨 0도에서 2도까지 냉각 된 슬라이싱 용액 또는 aCSF 용액으로 채 웁니다.비브라톰 챔버 주변에 드라이아이스를 포장하여 시술 중에 슬라이싱 용액을 차갑게 유지합니다. 면도날을 진동자에 삽입하고 장치의 절단 매개변수(예: 속도를 3, 주파수를 9, 피드를 250마이크로미터)로 설정합니다. 조직 슬라이싱 절차 동안 아크릴 전사 피펫을 사용하여 슬라이스를 회수 챔버로 옮기고 슬라이스 획득 후 조직 회복을 위해 60분 동안 기다립니다.셀 밀봉 및 기록을 시작하기 전에 현미경, 증폭기, 디지타이저 및 마이크로 매니퓰레이터를 켭니다. aCSF 용액으로 현미경에 부착된 기록 챔버를 구축합니다. 관류 펌프를 사용하여 분당 2밀리리터의 속도로 aCSF를 지속적으로 관류합니다.소프트웨어 설정을 확인하고 실험 유형에 따라 녹음에 대한 특정 프로토콜을 만듭니다. 관심 있는 뇌 조각을 아크릴 이송 피펫을 사용하여 한 번에 하나씩 기록 챔버로 옮깁니다. 슬라이스 앵커로 슬라이스를 잡고 aCSF 관류 중에 움직이지 않도록 합니다.침지 현미경의 저전력 대물 렌즈(10X 또는 20X)를 사용하여 슬라이스를 기록 챔버 중앙에 배치합니다. 슬라이스 위치는 현미경으로 원하는 영역을 잘 볼 수 있고 기록 마이크로피펫에 완벽하게 도달할 수 있도록 하는 데 매우 중요합니다. 관심 영역을 찾은 후 대물 렌즈를 고출력 렌즈로 전환하고, 63X 조직 수준에 초점을 맞추고 표적 영역에서 내인성 형광 단백질과 세포의 모양을 관찰하여 뇌 절편 표면에서 키스펩틴 세포를 찾습니다.가능한 대상 셀을 찾으면 마우스 커서로 컴퓨터 화면에 표시하거나 관심 영역 위에 사각형과 같은 형식을 그려 표시합니다. 컴퓨터 화면 표시는 기록 피펫 위치를 셀로 안내하는 데 도움이 됩니다. 표적 세포의 정확한 위치를 결정한 후 대물렌즈를 들어 올리고 내부 용액으로 채워진 기록 마이크로피펫을 전극 홀더에 도입하여 내부 용액이 은 전극과 접촉하도록 합니다.폴리에틸렌 튜브를 통해 마이크로피펫 홀더에 연결된 1 내지 3밀리리터의 공기로 채워진 주사기를 사용하여 마이크로피펫을 aCSF 용액에 담그기 전에 양압을 가하여 파편이 마이크로피펫으로 들어가는 것을 방지한다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 마이크로피펫을 대물렌즈 중앙 아래로 안내합니다. 마이크로 매니퓰레이터 버튼을 움직여 마이크로피펫의 XYZ 축을 관심 있는 셀로 안내합니다.마이크로피펫의 끝이 보이도록 초점을 조정하고 초점을 슬라이스에 너무 가까이 두지 말고 더 가까이 가져옵니다. 마이크로 매니퓰레이터의 속도를 줄이고 마이크로피펫을 초점이 맞춰진 곳으로 천천히 내려가 마이크로피펫 팁이 슬라이스를 갑자기 관통하지 않고 세포 표면이나 대상 영역에 닿을 때까지 천천히 하강하도록 합니다. 1-3 밀리리터의 공기로 채워진 주사기로 가벼운 양압을 가하여 접근 경로에서 파편을 제거합니다.XYZ 축에서 마이크로 매니퓰레이터를 천천히 움직여 마이크로피펫 팁을 더 가깝게 가져오고 적용된 압력에 의해 딤플을 유발하는 대상 셀에 닿습니다. 소프트웨어의 전압 클램프 모드를 사용하여 딤플을 설정 한 후 마이크로 피펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 1-2 초 동안 입으로 약한 짧은 흡입을 적용하여 마이크로 피펫과 셀 사이의 밀봉을 생성합니다. 씰이 약 1분 동안 노이즈 간섭 없이 기계적으로 안정된 상태를 유지하면 유지 전압을 관심 있는 셀의 가장 가까운 생리학적 휴식 전위로 설정합니다.kisspeptin 시상 하부 뉴런의 경우 마이너스 50 밀리 볼트가 권장됩니다. 다음에, 파열된 막이 마이크로피펫을 막히게 하거나 상당한 양의 막 부분 또는 세포를 끌어당기지 않도록 세포에 놓아두고, 밀봉된 마이크로피펫 팁에서 원형질막을 파괴하기 위해 입으로 짧은 흡입을 가한다. 적절한 전체 셀 구성은 충분한 힘으로 흡입을 수행하여 달성 할 수 있습니다.사용 된 시스템 설정 설명서를 확인하십시오. 세포막을 파괴한 후 전압 클램프 모드에서 전체 셀 옵션을 활성화하고 전체 셀 탭을 참조하는 자동 명령을 클릭합니다. 셀의 직렬 저항과 전체 셀 커패시턴스가 자동으로 계산되어 소프트웨어에 의해 즉시 표시됩니다.다음으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 소프트웨어에서 세포 생존율 매개변수를 확인합니다. 실험 중 직렬 저항과 셀 정상 상태 커패시턴스를 모니터링합니다. 전체 셀 구성이 제대로 달성되면 전압 클램프 모드에서 시냅스 전류를 측정합니다.현재 클램프 모드에서 휴지 막 전위의 변화와 유도된 정지 막 전위 변화를 기록합니다. 시상 하부 키스 펩틴 뉴런의 활성에 대한 인간 재조합 성장 호르몬의 가능한 효과는 전체 세포 패치 클램프 기록의 도움으로 연구되었습니다. 인간 재조합 성장 호르몬인 HGH를 그램당 20마이크로그램으로 투여하면 AVPV/PeN 키스펩틴 뉴런 12개 중 5개와 기록된 ARH 키스펩틴 뉴런 14개 중 9개에서 휴지막 전위의 상당한 과분극이 유도되었습니다.AVPV/PeN 키스펩틴 및 ARH 키스펩틴 과분극 뉴런은 반응하지 않는 세포에 비해 휴지막 전위를 유의하게 변화시켰습니다. HGH 적용 중 휴식 막 전위에 대한 영향은 AVPV / PeN 키스 펩틴 뉴런에서 약 0.9-0.7 기가 옴, ARH 키스 펩틴 뉴런에서 1.7-1.0 기가 옴의 전체 세포 입력 저항의 현저한 감소를 따랐습니다. 신중한 기가실을 통해 수행되는 완벽한 뇌 라인과 해변 매개변수를 통해 세포의 영역 동안 최상의 전체 세포 기록을 달성하는 데 필요합니다.기록된 세포의 마이크로피펫 용액을 수집하여 단일 세포 RTPCR에 사용하여 분리된 세포의 분자 특성 분석을 수행할 수 있습니다. 유전자 변형 동물의 사용과 결합된 전체 세포 패치 클램프 기술은 키스펩틴 뉴런의 정의를 허용하는 생식에 대한 이해의 돌파구를 나타내며 특성을 증가시켰으며 주요 조절자입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

이 비디오는 전체 세포 패치 전류 클램프를 사용하여 형광 단백질을 발현하는 신경 세포의 흥분성을 연구하는 방법을 보여줍니다. 전류 클램프 모드에서는 신경 흥분성을 나타내는 활동 전위가 생성됩니다.

Whole-Cell Patch Clamp를 사용한 형광 뉴런의 흥분성 연구

이 비디오는 형질주입된 쥐 해마 뇌 절편에서 시냅스 상호 작용 및 신경 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 활동 전위를 트리거하기 위해 장거리 감각 뉴런을 조명하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 기록된 뉴런에서 결과로 발생하는 흥분성 시냅스 후 전위를 기록하는 것이 포함됩니다.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

이 비디오는 transfection된 마우스 시상하부 절편에서 키스펩틴 뉴런의 반응을 측정하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스에는 전체 세포 구성을 달성하고 전류 클램프 모드를 사용하여 테스트 호르몬에 의해 유도된 막 전위 변화를 기록하는 작업이 포함됩니다.

Whole-Cell Patch Clamp를 사용하여 Kisspeptin Neurons에 대한 테스트 성장 호르몬 효과 결정

이 비디오는 뉴런 발화 패턴을 분석하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 척수 절편의 SG(substantia gelatinosa) 뉴런에서 전기생리학적 기록을 수행하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 척수의 SG 뉴런의 자극에 대한 신경 반응을 연구할 수 있습니다.

척수 절편의 실질체 젤라티노사 뉴런에서 기록하는 전체 세포 패치 클램프

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

여기, 선물이 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 기능 시 냅 스 다양성을 평가 하기 위한 프로토콜.

전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

배우세요 뇌절편에서 키스펩틴 뉴런의 전체 세포 패치 클램프 기록 방법을. 이 전기생리학 기술은 신경내분비학 연구와 생식 건강 이해에 중요한 통찰을 제공합니다.

시상하부 키스펩틴 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 기록의 표적입니다.

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