Name: Stub1 매개 Pexophagy 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 Stub1 매개 펙소파지 모니터링 방법을 통해 ROS 스트레스를 받은 페록시좀의 선택적 분해 과정을 실시간으로 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 산화 스트레스 반응과 세포 소기관 품질 조절 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 대만 국립 과학 기술위원회 (National Science and Technology Council)의 MOST 111-2311-B-001-019-MY3 연구 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

1. 퍼옥시좀 루멘에서 diKillerRed 또는 자가 표지 단백질(SLP)을 발현하는 세포의 제조
<ol><li>유리 바닥의 세포 배양 접시에 원하는 세포를 뿌립니다. 여기에서 실험을 위해 840μL의 배양 배지 (10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12)의 2 x 10 5 인간 SHSY5Y 세포 또는 직경 20mm 유리 마이크로웰이 있는 35mm 배양 접시에 840μL의 배양 배지(10% 소 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM)의 6 x 104 마우스 NIH3T3 세포. 주: 씨를 뿌린 세포의 수는 다른 명세의 유리제 밑바닥 접시를 사용할 경우의 유리제 마이크로웰 지역에 따라 비례적으로 조정되어야 합니다.</li>
	<li>세포를 5%CO2/37°C 하에서 24시간 동안 성장시킨다.</li>
	<li>형질주입 시약을 사용하여 원하는 플라스미드로 세포를 형질주입합니다.<ol><li>PMP34-TagBFP를 사용하여 살아있는 세포의 과산화소체를 라벨링합니다. 과산화소체 내강에서 ROS 생성을 위해 과산화소체 표적 diKillerRed-VKSKL 또는 SLP-VKSKL(+ 염료 표지 SLP 리간드)을 사용합니다(광 활성화 ROS 생산을 통해). 이 프로토콜에서는 자가 표지 단백질인 HaloTag-VKSKL21을 사용합니다. Stub1/Hsp70의 전좌, 유비퀴틴화 단백질의 축적 및 ROS 스트레스 과산화소체에 대한 자가포식소체의 형성을 모니터링하기 위해 EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub 또는 EGFP-LC3B를 각각 형질감염시킵니다. 과산화소체 내강에서 ROS 생성을 확인하기 위해 diKillerRed-VKSKL을 과산화소체 국소 형광 산화환원 프로브 roGFP2-VKSKL22와 함께 transfection합니다.</li>
		<li>SHSY5Y 세포 형질감염의 경우, 플라스미드를 55μL의 무혈청 DMEM/F-12에 희석하고 1μL의 형질주입 시약을 55μL의 무혈청 DMEM/F12에 희석합니다. 희석 된 DNA를 희석 된 시약과 결합하십시오. 부드럽게 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>항생제 없이 SHSY5Y용 배양 배지 100μL(10% 소 태아 혈청이 포함된 DMEM/F-12)로 미리 도금된 20mm 마이크로웰에 복합체를 추가합니다. 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔든다.</li>
		<li>NIH3T3 세포 형질감염의 경우, 플라스미드 및 형질주입 시약을 희석하기 위해 무혈청 DMEM/F-12를 환원 혈청 배지로 대체합니다. 도금 배양 배지를 SHSY5Y로 교체하고 항생제가 없는 NIH3T3 세포용 배양 배지(DMEM with 10% bovine serum)로 교체합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형질감염 2시간 후, 형질주입 시약 함유 배지를 제거하고, 새로운 배양 배지 1 mL를 첨가한다. NIH3T3 또는 SHSY5Y 세포를 37°C 및 5% CO2 에서 24시간 동안 배양합니다. 참고: 다른 세포주도 Stub1 매개 pexophagy(예: HeLa 세포)를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 염료 표지 SLP 리간드로 과산화소체 염색(광 활성화 ROS 생산용)
<ol><li>형질감염 후 24시간에, 배양 배지를 제거하고, 200 nM HaloTag TMR 리간드 또는 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag 리간드 100 μL를 20 mm 유리 마이크로웰 상에 첨가한다. 참고: 염료 표지된 SLP 리간드는 각 세포주에 대해 각각의 배양 배지로 희석되어야 합니다. Janelia Fluor 646 표지 리간드를 선택하면 다운스트림 형광 이미징을 위한 청색, 녹색 및 적색 채널을 확보할 수 있습니다.</li>
	<li>접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터로 옮깁니다. 1 시간 동안 얼룩. 1시간 후, 염색 배지를 완전히 제거하고, 새로운 배양 배지 1 mL를 첨가한다.</li>
</ol>3. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 과산화소체의 ROS 스트레스
<ol><li>원하는 세포가 들어 있는 유리 바닥 접시를 스테이지 탑 인큐베이터가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에 놓습니다.</li>
	<li>Tool Window(도구 창)를 클릭하고 Ocular(접안)를 선택한 다음 DIA 버튼(그림 2A)을 클릭하여 투과광을 켭니다. View 현미경 접안렌즈를 통해 접시를 보고 초점 손잡이를 돌려 세포에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>LSM을 선택하고 Dye & Detector Select 버튼을 클릭합니다(그림 2B). 팝업 창에서 원하는 염료를 두 번 클릭하여 세포 이미징을 위한 적절한 레이저 및 필터 설정을 선택합니다(그림 2C). 라이브 패널에서 Livex4를 클릭하여 빠른 레이저 스캐닝을 시작하여 세포의 형광 신호 스크리닝을 시작합니다(그림 2D).</li>
	<li>스테이지를 움직여 조이스틱 컨트롤러를 사용하여 ROS 스트레스를 가할 중간 diKillerRed-VKSKL- 또는 SLP-VKSKL 발현 세포를 찾습니다(과산화소체에). 원하는 셀의 이미지를 획득합니다.</li>
	<li>Tool Window(도구 창)를 클릭하고 LSM Stimulation(LSM 자극)을 선택합니다(그림 2E). 타원 버튼을 클릭하고 라이브 이미지 창에서 마우스를 사용하여 ROS 응력이 적용될 3.4단계에서 획득한 원하는 과산화소체를 포함하는 직경 15μm의 원형 ROI(그림 2F)를 그립니다(그림 3 참조).</li>
	<li>ROS 스트레스를 적용하려면 diKillerRed-PTS1 또는 TMR 표지 SLP 리간드가 있는 세포에 561nm를 사용하고 Janelia Fluor 646 표지 SLP 리간드로 염색된 세포에 640nm를 사용합니다.</li>
	<li>ROS 응력을 가하기 위한 레이저 파장을 선택합니다. 원하는 레이저 백분율과 지속 시간을 입력합니다(그림 2G).</li>
	<li>획득(Acquire)을 클릭하고 자극(Stimulation) 버튼(그림 2H)을 클릭하여 각각 30초 동안 ROI를 통해 561/640nm 빛으로 스캔을 시작합니다. 이는 여기에 사용된 컨포칼 현미경에서 561nm 및 640nm 모두에 대해 ~5% 레이저 출력 설정에 해당합니다. 이 작업은 과산화소체에서 ROS 생성으로 이어질 것입니다. 참고: 다양한 크기의 ROI를 선택할 수 있습니다. 면적에 따라 각 ROI에 대한 조명 시간을 비례적으로 조정해야 합니다.</li>
	<li>30초의 레이저 조명 후 ROI 내의 과산화소체는 diKillerRed-PTS1/TMR/Janelia Fluor 646 신호를 잃게 됩니다. 이 신호 손실을 통해 세포 내에서 조명된 과산화소체(손상 대 건강)와 조명되지 않은 과산화소체를 구별할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 타임랩스 이미징을 통한 살아있는 세포의 pexophagy 모니터링
<ol><li>프레임 간 1분 간격을 사용하여 타임랩스 이미징을 통해 EGFP 태그가 붙은 Stub1, Hsp70, Ub, p62 또는 LC3B를 조명/ROS 스트레스 과산화소체로 전좌를 따릅니다(예:amples, 그림 3-7 참조). 알림: EGFP-Stub1 또는 EGFP-Hsp70 신호는 조명 후 10-20분 후에 나타나기 시작하고 조명 후 ~40분 후까지 손상된 모든 과산화소체에 남아 있습니다. EGFP-Ub 신호는 조명 후 30분 동안 나타나고 2-3시간 동안 지속됩니다. EGFP-p62 전위는 조명 후 60분 후에 나타나고 EGFP-LC3B 신호는 조명 후 ~3시간 후에 볼 수 있습니다.</li>
	<li>ImageJ를 사용하여 손상된 과산화소체(Stub1, Ub, p62 또는 LC3B)의 EGFP 신호를 정량화합니다. ImageJ를 사용하여 3채널 이미지(PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL)를 정량화하려면 다음 단계를 수행합니다.<ol><li>이미지를 열고 타원형 선택 또는 자유형 선택을 적용하여 조명된 모든 과산화소체(PMP34-TagBFP 신호 양성 및 표백된 HaloTag 리간드 신호)를 포함하는 영역을 둘러쌉니다. 그림 8A).</li>
		<li>복제를 클릭하여 PMP34-TagBFP 채널을 선택합니다(그림 8A). 드롭다운 메뉴 Image > Adjust > Threshold를 사용하여 임계값을 설정하여 과산화소체를 표시합니다(그림 8B).</li>
		<li>Analyze(분석 ) > Analyze particles(입자 분석 )를 선택하여 조명된 과산화소체의 정확한 영역을 확인합니다. ImageJ는 이러한 관심 영역(ROI)을 ROI 관리자에 기록합니다(그림 8C).</li>
		<li>EGFP 결합 Ub, p62 또는 LC3B에서 형광 신호를 분석하기 위한 EGFP 채널을 선택하려면 복제를 클릭합니다(그림 8D). ROI 관리자에서 모든 ROI를 선택합니다(그림 8E).</li>
		<li>ROI Manager에서 Measure 를 적용하여 과산화소체의 EGFP 신호를 측정합니다(그림 8E). 결과 표에서 각 ROI에 대한 면적 및 적분 밀도 값(모든 픽셀 강도의 합)을 찾습니다(그림 8E).</li>
		<li>조명 후 서로 다른 시점에서 평균 EGFP 형광 강도를 얻으려면 통합 EGFP 강도를 조명된 과산화소체의 총 면적(PMP34-TagBFP 신호 양성 및 HaloTag 리간드 신호 음성 영역)으로 나눕니다. 과산화소체에 축적된 신호를 얻으려면 시점의 평균 강도에서 시간 = 0의 평균 강도를 뺀 다음 시간 = 0의 평균 강도로 정규화합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 배양 접시에 있는 모든 과산화소체(모든 세포에서)를 전체적으로 손상시킵니다.
<ol><li>1단계(과산화소체 표적 diKillerRed[diKillerRed-VKSKL] 또는 SLP[SLP-VKSKL]를 발현하는 세포의 준비) 및 2단계(SLP 리간드로 과산화소체 염색[광활성화 ROS 생산용])를 수행합니다.</li>
	<li>TMR 표지 리간드 염색 1시간 후, 염색 배지를 제거하고, 30 mM 3-AT(3-amino-1,2,4-triazole; 카탈라아제 억제제)를 함유하는 배양액 1 mL를 첨가하였다. 참고: 카탈라아제는 과산화소체 내강에서 발현되는 ROS 제거제이므로 3-AT 처리는 과산화소체의 광 유도 산화 손상을 증가시키는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>배양 접시를 LED(555-570nm) 위에 놓습니다. 인큐베이터에서 9시간 동안 1.8W/cm2 의 전력 밀도로 모든 셀을 비춥니다. 알림: 인큐베이터 외부에서 이 단계를 수행하려면 배양 접시를 37°C 가열판에 놓습니다. 3-AT 함유 배지에 20mM HEPES를 첨가하고 배양 접시를 투명 필름으로 덮어 가스 교환을 최소화합니다. HEPES는 LED 조명 중에CO2 인큐베이터 외부의 세포 배양에서 생리적 pH를 유지하는 완충제입니다.</li>
	<li>과산화소체에서 EGFP-Ub, EGFP-p62 또는 EGFP-LC3B 신호를 이미징하여 LED 유발 손상의 성공 여부를 검증합니다. 위에서 설명한 조명 조건을 사용하여 HaloTag-VKSKL을 안정적으로 발현하는 SHSY5Y 세포의 82%가 Stub1 매개 pexophagy를 나타냈습니다.</li>
	<li>다운스트림 생화학 분석을 위해 세포를 수확합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 빛으로 퍼옥시좀 ROS 수준을 높여 세포 배양 내에서 Stub1 매개 pexophagy를 유발하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 염료 보조 ROS 생성에 의존하기 때문에 관심 세포 내에서 diKillerRed-VKSKL 또는 염료 표지 SLP 리간드 염색의 충분한 발현을 보장해야 합니다. 서로 다른 세포 유형 또는 서로 다른 유전적 배경을 가진 세포가 약간 다른 특성을 가진 과산화소체를 보유할 수 있다는 점을 감안할 때, 축척의 유도를 보장하기 위해 정확한 조명 조건을 조정해야 할 수도 있습니다. Stub1 매개 pexophagy의 활성화를 스크리닝하기 위한 강력한 조치는 EGFP-Ub가 조명된 과산화소체(조명 후 1시간)로 전위되는지 여부를 모니터링하는 것입니다13. 건강한 세포에서 EGFP-Ub 신호는 일반적으로 세포질에 고르게 분포됩니다. 따라서 조명된 과산화소체로의 전위는 관찰하기 쉽습니다. 조명 조건을 최적화하기 위해 광도 또는 조명 시간을 변경할 수 ...

과산화소체는 대부분의 진핵 세포에 존재하는 단일 막 결합 소기관입니다. 과산화소체는 매우 긴 사슬 지방산의 베타 산화, 퓨린 이화 작용, 에테르 인지질 및 담즙산 합성을 수행하는 데 필수적인 대사 구획입니다1. 과산화소체 유래 아세틸-CoA는 대사에서 중추 신호 전달을 조절하여 지질 항상성을 조절합니다2. 따라서 손상된 과산화소체 기능이 신경퇴행성 장애, 노화, 암, 비만 및 당뇨병을 포함한 다양한 질병에 내포되어 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다 3,4,5. 퍼옥시솜 작동의 유지에 필수적인 과정은 pexophagy입니다. Pexophagy는 autophagy에 의한 peroxisomes의 선택적 회전율을위한 이화 작용 과정입니다. 세포는 펙소파지를 사용하여 과산화소체의 양과 질을 조절하여 적절한 과산화소체 기능을 보장합니다. 최근 연구에 따르면 PEX1 퍼옥시좀 생물 발생 인자 1 및 6의 돌연변이로 인한 과산화소체 손실은 제어되지 않은 pexophagy6의 결과입니다. 특히, 모든 과산화소체 생물발생 장애(PBD) 환자의 65%는 포유류 세포에서 PEX1, PEX6 및 PEX26으로 구성된 과산화소체 AAA ATPase 복합체의 결핍을 가지고 있다7.
pexophagy를 시작하고 연구하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 효모에서 pexophagy는 공급된 영양소가 과산화소체 의존성 탄소원에서 과산화소체 비의존성 탄소원(세포 과산화소체 수를 낮추기 위해)으로 전환될 때 촉발됩니다.8. 예를 들어, 메탄올-성장한 Pichia pastoris 세포를 메탄올 배지로부터 글루코스 배지 및 에탄올 배지로 옮기는 것은 각각 미세 펙소파지 및 마크로펙소파지를 유도한다 8,9,10. Micropexophagy 격리기는 액포를 리모델링하여 컵 모양의 액포 격리 막과 미세 포식식 특이적 막 장치(MIPA)라고 하는 뚜껑 모양의 구조를 형성함으로써 분해를 위해 클러스터링된 과산화소체를 클러스터링했습니다. macropexophagy에서, 개별 peroxisomes는 pexophagosomes로 알려진 이중 막 구조에 의해 삼켜지고, 분해를 위해 액포와 융합됩니다 8,9,10. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 Atg36p 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 Atg30p와 같은 엑소포지(pexophagy) 수용체의 인산화는 수용체가 핵심 자가포식 기계를 모집하고 자가포식소체 8,11에 대한 과산화소체 표적화를 촉진하는 데 중요합니다.
포유류 세포에서, pexophagy는 유비퀴틴화에 의해 유도 될 수있다. 퍼옥시좀 막 단백질 PMP34 또는 PEX3에 세포질 측의 유비퀴틴을 태깅하면 pexophagy가 유도됩니다12. PEX3의 과발현은 리소좀에 의한 과산화소체 유비퀴틴화 및 과산화소체 제거를 유도한다13. 또한, PEX5와 C-말단 EGFP의 융합은 모노유비퀴틴화 PEX5의 수출을 손상시키고 펙소파지14를 초래한다. 한편, pexophagy는 또한 H 2 O2처리에 의해 유발 될 수 있습니다. 과산화소체는 활성 산소 종(ROS)을 생성합니다. 특히, 매우 긴 사슬 지방산 (> 22 탄소)의 베타 산화의 초기 단계를 촉매하는 퍼 옥시 솜 효소 Acox1은 아세틸 -CoA뿐만 아니라 퍼 옥시 솜 ROS도 생성합니다. H2O2 처리 하에서 증가된 ROS수준에 반응하여, 포유동물 세포는 ROS 생산을 낮추고 스트레스를 완화하기 위해 펙소파지를 활성화시킨다. H2O2 치료는 모세혈관확장증 변이된 운동실조증(ATM)을 과산화소체로 모집하는 것으로 보고되었습니다. 그런 다음 ATM은 PEX5를 인산화하여 pexophagy15에 의한 과산화소체 회전율을 촉진합니다.
과산화소체는 ROS 생성 센터이기 때문에 ROS 손상이 발생하기 쉽습니다. ROS로 유도된 과산화소체 손상은 세포가 과산화소체 품질 관리 경로(자가포식에 의해 손상된 과산화소체 제거)를 시작하기 위해 축과를 활성화하도록 합니다. 여기에서는 ROS로 유도된 과산화소체 손상의 주문형 트리거링에 대한 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 세포 소기관 16,17,18,19,20 내에서 광 활성화 ROS 생산을 활용합니다(그림 1). 염료 표지된 과산화소체가 조명되어 과산화소체 내강 내에서 ROS 생성을 유도하며, 이는 특히 과산화소체 손상을 유발합니다. 이 프로토콜을 사용하여 ROS 스트레스 과산화소체가 유비퀴틴 의존성 분해 경로를 통해 제거되는 것으로 나타났습니다. ROS 스트레스 과산화소체는 유비퀴틴 E3 리가제 Stub1을 모집하여 엑소포지에 의한 개별 제거를 위해 자가포식소체로 삼킬 수 있도록 합니다16. 이 프로토콜을 사용하여 타임랩스 현미경으로 동일한 세포 내에서 손상되고 건강한 과산화소체의 운명을 비교할 수 있습니다. 이 방법은 또한 배양 접시의 모든 과산화소체(모든 세포에서)를 전체적으로 손상시키는 데 사용할 수 있어 축식성 경로의 생화학적 분석이 가능합니다.

<table><tbody><tr><td>20mm 직경의 유리 마이크로웰이 있는 35mm 배양 접시&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>20mm 유리 바닥</td></tr><tr><td>3-아미노-1,2,4-트리아졸(3-AT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16170060</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>Nuaire</td><td>NU-4750</td><td></td></tr><tr><td>diKillerRed-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>KillerRed 탠덤 이량체에 PTS1(VKSKL)을 추가하여 만든</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>pEGFP-C1</td><td>EGFP-C1의 골격은 EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62</td></tr>, <tr><td>EGFP-Hsp70</td><td>Academia Sinica</td><td></td> <td>클로닝에 사용되었습니다.Hsp70 유전자 (HSPA1A) HeLa cDNA에서 증폭되고 EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-LC3B</td><td>Addgene</td><td>11546</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-p62</td><td>Academia Sinica</td><td></td>로 복제됨 <td>인간 SQSTM1 유전자를 EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Stub1</td><td>Academia Sinica</td><td></td>에 <td>삽입하여 생성 (전체 마우스 신장 cDNA의 PCR 증폭을 통해) EGFP-C1</td></tr><tr><td>EGFP-Ub</td><td>Addgene</td><td>11928</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag TMR 리간드&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8252</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PTS1은 EGFP-C1 백본에 추가 및 복제</td></tr>되었습니다. <tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Confocal Microscope&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td>405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,&nbsp; TOKAI HIT 챔버 인큐베이터와 UNIV2-D35 접시 부착물이 있는 현미경</td></tr><tr><td>Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand</td><td>Promega</td><td>GA1120</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>VitaStar</td><td>PAR64</td><td>80 W, 555-570 nm</td></tr><tr><td>lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668</td><td>형질주입 시약</td></tr><tr><td>NIH3T3 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td>부착</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>319850</td><td>환원된 혈청 배지</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PMP34-TagBFP</td><td>Academia Sinica</td><td></td><td>PMP34 PCR HeLa cDNA에서 증폭 및 클로닝 intoTagBFP-C (Evrogen FP171)</td></tr><tr><td>roGFP2-PTS1</td><td>Academia Sinica</td><td></td>는 <td>eroGFP(Addgene plasmid 20131에서 가져옴)에 아미노산 서열 VKSKL을 추가하여 생성되고 EGFP-C1</td></tr><tr><td>SHSY5Y 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>준수</td></tr>에 복제됩니다.</tbody></table>

stub1 매개 pexophagy 모니터링

Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy

포유류 세포는 Stub1 매개 pexophagy를 통해 과산화소체를 뒤집을 수 있습니다. 이 경로는 잠재적으로 과산화소체의 양과 질에 대한 세포 제어를 허용합니다. 이 과정에서 열 충격 단백질 70과 유비퀴틴 E3 리가아제인 Stub1은 과산화소체로 전위되어 펙소파지를 시작합니다. Stub1 리가제 활성은 표적 과산화소체에 유비퀴틴 및 기타 자가포식 관련 모듈의 축적을 허용합니다. 퍼옥시좀 루멘 내에서 활성 산소종(ROS) 수준을 높이면 Stub1 매개 축척을 활성화할 수 있습니다. 따라서 염료 보조 ROS 생성을 사용하여 이 경로를 트리거하고 모니터링할 수 있습니다. 이 기사에서는 포유류 세포 배양 내에서 펙소파지를 시작하기 위해 형광 단백질과 합성 형광단의 두 가지 종류의 염료를 사용하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 염료 보조 ROS 생성 기반 프로토콜은 전 세계적으로 세포 집단 내의 모든 과산화소체를 표적으로 삼는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 단일 세포 내에서 개별 과산화소체의 조작을 허용할 수도 있습니다. 또한 생세포 현미경을 사용하여 Stub1 매개 pexophagy를 추적하는 방법도 설명합니다.

여기에 표시된 Stub1 매개 pexophagy 유도 방식은 퍼옥시좀 내강 내에서 염료 보조 ROS 생성을 활용합니다. 이 작업에는 최소한의 광도가 필요합니다. 따라서 형광 단백질 또는 염료를 포함하는 과산화소체는 표준 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 조명할 수 있습니다. 초점 조명은 형광 리포터 roGFP2-VKSKL에 의해 표시된 바와 같이 개별 과산화소체 내에서 즉각적이고 국부적인 ROS 생성으로 이어집니다(그림 9). 이미징 중 추가 ROS 생성을 방지하기 위해 roGFP2-VKSKL 측정에서 diKillerRed-VKSKL을 이미지화하지 않았습니다. 그림 9 의 오른쪽 하단 diKillerRed-VKSKL 이미지는 손상된 과산화소체가13인 위치를 명확하게 나타내기 위해 모든 roGFP2-VKSKL 측정을 수행한 후에 촬영되었습니다. 데이터는 또한 조명되지 않은 과산...

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 Stub1 매개 pexophagy를 트리거하고 모니터링하기 위한 지침을 제공합니다.

Stub1 매개 Pexophagy 모니터링

Mammalian cells can turn over peroxisomes through Stub1-mediated pexophagy. The pathway potentially permits cellular control of the quantity and quality ...

과산화소체는 베타 산화를 수행하고 ROS 손상을 일으키기 쉽습니다. 이 방법을 사용하면 세포가 ROS 스트레스 과산화소체를 처리하는 방법을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 집단 내의 모든 과산화소체를 전역적으로 표적화하는 데 사용될 뿐만 아니라 단일 세포 내에서 개별 과산화소체의 조작을 허용할 수도 있습니다.염료 보조 ROS 생성은 또한 세포가 세포 소기관 손상을 처리하는 방법을 조사하기 위해 과산화소체 외부의 세포 소기관을 표적으로 삼는 데 사용할 수 있습니다. 시작하기 위해, 2회 10 내지 5번째 인간 SHSY5Y 세포 또는 6회 10 내지 4번째 마우스 NIH H3T3 세포를 20 밀리미터 직경의 유리 마이크로웰을 갖는 유리 바닥 35 밀리미터 배양 접시 상에서 840 마이크로리터의 배양 배지에 시딩한다. 섭씨 37도에서 24 시간 동안 5 % 이산화탄소 아래에서 세포를 성장시킵니다.다음에, 형질주입 시약 또는 SHSY5Y 세포 형질감염을 사용하여 원하는 플라스미드로 세포를 형질감염시킨다. 플라스미드를 55마이크로리터의 무혈청 DMEM/F-12로 희석하고 1마이크로리터의 트랜스펙션 시약을 55마이크로리터의 무혈청 DMEM/F-12로 희석합니다. 희석 된 DNA를 희석 된 시약과 결합하십시오.부드럽게 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 항생제 없이 SHSY5Y 세포를 함유하는 배양 배지 100 마이크로리터로 미리 도말한 20-밀리미터 마이크로웰에 복합체를 첨가한다. 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔든다.이전에 입증된 대로 NIH 3T3 세포 형질주입을 수행하되, 플라스미드 희석 및 형질주입 시약을 무혈청 DMEM/F-12 대신 환원된 혈청 배지로 대체합니다. 형질감염 2시간 후, 형질주입 시약 함유 배지를 제거하고, 1밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가한다. NIH 3T3 또는 SHSY5Y 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다.광-활성화 ROS 생산을 위해, 형질감염 후 24시간에 배양 배지를 제거하고, 200 나노몰 HaloTag TMR 리간드 또는 200 나노몰 Janelia Fluor 646 HaloTag 리간드 10 마이크로리터를 20-밀리미터 유리 마이크로웰 상에 첨가한다. 접시를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터로 옮기고 1시간 동안 그대로 두어 세포를 염색합니다. 1시간 후, 염색 배지를 완전히 제거하고 신선한 배양 배지 1밀리리터를 첨가한다.원하는 세포가 들어 있는 유리 바닥 접시를 스테이지 탑 인큐베이터가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에 놓습니다. 소프트웨어에서 Tool Window(도구 창)를 클릭하고 Ocular(접안)를 선택한 다음 DIA 버튼을 클릭하여 투과광을 켭니다. 현미경 접안렌즈를 통해 접시를 보고 초점 손잡이를 돌려 세포에 초점을 맞춥니다.LSM을 선택하고 염료 검출기 선택 버튼을 클릭합니다. 팝업 창에서 원하는 염료를 두 번 클릭하여 세포 이미징에 적합한 레이저 및 필터 설정을 선택합니다. 라이브 패널에서 Live4x를 클릭하면 빠른 레이저 스캔을 시작하여 세포의 형광 신호 스크리닝을 시작할 수 있습니다.조이스틱 컨트롤러를 사용하여 스테이지를 이동하고 중간 diKillerRed VKSKL 또는 SLP-VKSKL 발현 세포를 찾아 과산화소체에 ROS 스트레스를 가합니다. 원하는 셀의 이미지를 획득합니다. Tool Window(도구 창)를 클릭하고 LSM Stimulation(LSM 자극)을 선택합니다.그런 다음 타원 버튼을 클릭하고 라이브 이미지 창에서 마우스를 사용하여 ROS 스트레스가 적용될 원하는 과산화소체를 포함하는 직경 15마이크로미터의 ROI를 그립니다. ROS 스트레스를 적용하려면 diKillerRed VKSKL 또는 TMR 표지 SLP 리간드가 있는 세포에는 561 나노미터를 사용하고 Janelia Fluor 646 표지 SLP 리간드로 염색된 세포에는 640 나노미터를 사용합니다. ROS 응력을 가하기 위한 레이저 파장을 선택합니다.원하는 레이저 백분율과 지속 시간을 입력합니다. 과산화소체에서 ROS를 생성하려면 Acquire(획득)를 클릭한 다음 Stimulation(자극) 버튼을 클릭하여 각각 30초 동안 ROI를 통해 561나노미터 또는 640나노미터의 빛으로 스캔을 시작합니다. 이 자극은 561 및 640 나노미터에 대한 약 5%레이저 출력 설정에 해당합니다.30초의 레이저 조명 후 ROI 내의 과산화소체는 diKillerRed VKSKL, TMR 또는 Janelia Fluor 646 신호를 잃습니다. 이 신호 손실은 세포 내에서 조명된 과산화소체와 조명되지 않은 과산화소체를 구별할 수 있게 해줍니다. 펙식파데 살아있는 세포를 모니터링하려면 프레임 사이의 10분 간격을 사용하여 타임랩스 이미징을 통해 EGFP 태그 Stub1, Hsp70, 유비퀴틴, p62 또는 LC3B를 조명 또는 ROS 스트레스 과산화소체로 전좌시킵니다.초점 조명은 형광 리포터 roGFP2-VKSKL에 의해 표시된 대로 개별 과산화소체 내에서 즉각적이고 국부적인 ROS 생성으로 이어집니다. diKillerRed VKSKL 이미지는 손상된 과산화소체의 위치를 나타내기 위해 모든 roGFP2-VKSKL 측정이 수행된 후에 촬영되었습니다. 데이터는 또한 조명되지 않은 과산화소체가 영향을 받지 않는다는 것을 보여주며, 이는 방법론의 정확성을 나타냅니다.이 방법론은 Stub1 매개 pexophagy를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 이 과정에서 Hsp70, Stub1, 유비퀴틴화 단백질, 자가포식 어댑터 p62 및 LC3B가 ROS 스트레스 과산화소체에 연속적으로 나타나 펙소파지를 구동합니다. 동일한 전략을 사용하여 Stub1 매개 pexophagy의 생화학적 특성화를 위해 배양 접시의 모든 과산화소체를 동시에 손상시킬 수 있었습니다.LED 조명 전에 EGFP-유비퀴틴 형광은 세포질에서 균질했으며 과산화소체와 공동 국소화되지 않았습니다. 9시간 동안 LED 조명을 사용한 후, EGFP-유비퀴틴 신호는 공초점 접시에서 성장한 세포의 모든 과산화소체에 축적되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 ROS 스트레스 과산화소체가 유비퀴틴 의존적 분해 경로를 통해 제거된다는 것을 발견했습니다.ROS 스트레스 과산화소체는 유비퀴틴 E3 리가제 Stub1을 모집하여 펙소파지에 의한 제거를 허용합니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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Stub1 매개 Pexophagy 모니터링

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