Name: Zebrafish Radial Glia Progenitors의 비대칭 분열 동안 Notch/Delta Endocytosis 추적을 위한 항체 흡수 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 배우세요 제브라피쉬 방사성교아전구세포에서 Notch/DeltaD 내재화를 추적하는 항체 흡수 분석법을 Danio rerio를 이용하여 신경발생 연구에 적용하는 방법을. 이 기술은 세포 운명 결정 메커니즘을 명확히 밝히는 데 활용됩니다.

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이 프로젝트는 NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation 및 Chan Zuckerberg Biohub의 지원을 받았습니다.

우리는 연구를 위해 AB 야생형 계통과 형질전환 계통 Tg[ef1a:Myr-Tdtomato] 를 사용했습니다. 모든 동물 실험은 미국 샌프란시스코 캘리포니아 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(승인 번호: AN179000).
1. 제브라피쉬 배아의 준비
<ol><li>오후 5:00 이전에 오후 5:00 이전에 암컷 야생형 물고기 1마리와 수컷 Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 물고기 1마리를 칸막이를 사용하여 각 수조에서 분리하여 물고기 횡단 수조를 설치합니다.</li>
	<li>다음날 아침 11:00 이전에 모든 교차 탱크에서 칸막이를 제거하십시오. 짝짓기하는 동안 조용히하고 물고기를 방해하지 마십시오. 산란은 일반적으로 칸막이를 제거한 후 30분 이내에 발생합니다. 수정란은 탱크 바닥에 남아 있습니다.<ol><li>메쉬 필터로 탱크에서 수정란을 수집하십시오. 달걀을 씻어서 달걀 물이 가득 찬 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경으로 배아를 10x에서 20x 배율로 검사합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수정된 배아를 약 20mL의 배아 배지(1,000x 원액 100mL에는 NaCl 29.4g, KCl 1.27g, CaCl 2.2H2O 4.85g 및 MgSO 4.7H 2O8.13g이 포함되어 있음)가 들어 있는 깨끗한페트리 접시에 대구경 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 배아를 28 °C에서 보관하십시오. 28.5°C에서 30mL의 배아 배지와 함께 페트리 접시당 50개의 수정된 배아를 보관합니다. 참고: 한 쌍의 물고기는 일반적으로 100-300개의 배아를 생산하며 건강한 배아의 수정 및 생존율은 각 짝짓기에 대해 95% 이상입니다.</li>
	<li>다음날 아침, 배아가 수정 후 ~18-20시간(hpf)의 발달 단계에 도달한 오전 8:00에 인큐베이터에서 배아를 꺼냅니다. 처음에는 백색광을 사용하여 20x 배율의 epifluorescence 현미경으로 관찰합니다. 그 당시 제브라 피쉬 배아는 20 개의 체성 단계에 있습니다.<ol><li>유리 피펫을 사용하여 현미경으로 흐리거나 파열된 죽은 배아를 버립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광등을 켜고 현미경의 RFP 필터 설정을 선택합니다. 그런 다음 붉은 형광이 강한 배아를 선택하고 달걀 물이 담긴 새 접시에 옮깁니다.<ol><li>백색광 아래에서 두 개의 미세한 집게(집게의 끝은 날카롭고 손상되지 않아야 함)를 사용하여 수동으로 배아를 Dechorionate합니다(재료 표).</li>
		<li>한 쌍의 집게로 chorion을 잡고 다른 집게로 chorion을 찢습니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 눈물을 열고 다른 집게의 끝으로 배아를 부드럽게 밀어 배아가 통과할 수 있을 만큼 충분히 크게 만듭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>미세 주입 전에 빠른 헹굼을 위해 신선한 배아 배지가 있는 새로운 페트리 접시에 박초를 제거합니다.</li>
</ol>2. 미세주입제의 제조
<ol><li>풀러에서 미세 주사 바늘을 당기려면 모세관(1.2mm OD, 0.9mm ID, 필라멘트 포함)을 사용하십시오. 핸드북에 따라 당기는 프로그램을 설계하고 최적화하십시오.</li>
	<li>입체 해부 현미경으로 집게로 바늘 끝을 엽니다. 팁의 직경을 약 10μm로 만들고 테이퍼 각도를 약 30°로 만듭니다.</li>
	<li>주사 전에 마우스 단클론 항-Dld 항체를 항-Mouse-IgG-Atto647N과 접합합니다.<ol><li>각 주사 실험에서 0.5μL의 항-Dld 항체(0.5mg/mL)와 2μL의 항-Mouse-IgG-Atto647N 항체(1mg/mL)를 5-10회 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 실온에서 최소 30분 동안(또는 얼음 위에서 2-3시간 동안) 배양합니다.</li>
		<li>배양 후, 2.5 μL의 블로킹 완충액(10 mg/mL 마우스 IgG)과 0.5 μL의 0.5 μL의 0.5% 페놀 레드를 항체 혼합물에 첨가하고, 10x 피펫을 사용하여 완전히 혼합하여 혼합물에 남아 있는 비접합 항체를 차단합니다. 참고: 각 시험에 대해 항-Dld 항체가 없는 추가 혼합물 1개를 준비하고 대조군으로 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>배아 배지에서 1% 저융점 아가로스를 준비한다. 아가로오스 함유 혼합물을 70°C에서 혼합물이 투명해질 때까지 가열한다.<ol><li>아가로스 용액을 2mL 미세원심분리기 튜브에 분취합니다. 분취량을 ~40°C의 열 블록에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>1% 저융점 아가로스가 들어 있는 튜브에서 배아를 3초 동안 헹굽니다.</li>
	<li>그림 1과 같이 배아를 개별 아가로오스 방울(~30-40μL)과 함께 거꾸로 된 플라스틱 페트리 접시 뚜껑에 놓고 각 배아를 뚜껑에 별도로 장착합니다. 배아를 아가로스에 옆으로 평평하게 놓고 아가로스가 실온에서 굳을 때까지 이 위치를 유지합니다.</li>
	<li>위와 같이 12개의 배아를 3줄로 하나씩 장착합니다. agarose에 장착 된 모든 배아를 계란 배지로 덮으십시오.</li>
</ol>3. 미세주입
<ol><li>매립된 배아를 실체현미경 아래에 놓고 아가로스를 계란수로 덮습니다.</li>
	<li>공기 압력 인젝터를 마이크로 매니퓰레이터와 함께 설정하여 그림 1과 같이 현미경에 가깝게 배치합니다. 고압의 기체 질소(N2)를 함유한 강철 가스 실린더를 공기 자원으로 사용하십시오.<ol><li>배아가 용란증에 장착 된 후에 만 가스 밸브를 엽니 다. 그런 다음 마이크로 인젝터의 전면 충전 모듈을 사용할 때 그림 1과 같이 제조된 유리 바늘에 2 μL의 항체 혼합물을 미세 조작기에 전면 로드합니다.</li>
		<li>입력 압력을 ~80-90psi로 조정하고 사출 압력을 ~20psi로 조정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이전에 기술된 바와 같이 현미경 하에서 마이크로미터를 사용하여 주입 부피를 보정한다15. 바늘 구멍의 크기에 따라 튜닝 시간을 10ms에서 120ms로 설정합니다. 패들을 두드려 주입의 각 펄스를 전달하십시오. 각 전달의 주입량을 ~4-5nL로 조정합니다.</li>
	<li>미세주입 바늘 끝을 r0/r1 힌지 포인트 후방의 등쪽 지붕판에 찔러 뇌 조직에 부딪히지 않고 약 10nL(2회 또는 3회 펄스)의 항체 혼합물을 주입합니다. 뇌실에서 붉은 액체가 흐르는 것을 관찰하십시오. 참고: 후뇌 심실은 중뇌 후뇌 경계의 뒤쪽에 있습니다. 주입된 페놀 레드 함유 항체 혼합물은 뇌척수액으로 확산되어 즉시 후뇌에서 전뇌로 뇌실을 채웁니다.</li>
	<li>주사 후 미세 조작기의 손잡이를 돌려 배아에서 바늘 끝을 신속하게 제거합니다. 성공적인 주사를 위해, 주입 된 혼합물의 적색 염료는 포위 된 용설로로 누출되지 않고 안정적으로 뇌실에 남아 있습니다.</li>
	<li>마운팅 플레이트를 현미경 아래로 이동하여 반복에 적합한 위치에 장착된 다른 배아를 찾습니다.<ol><li>6 내지 8개의 배아를 주입한 후, 미세수술용 칼로 아가로스를 벗겨 내포된 아가로스로부터 배아를 방출한다. 미세 주입된 배아를 30mL의 배아 배지가 있는 신선한 접시에 옮기고 다음 단계를 위해 실온에 두십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 장착 및 타임랩스 라이브 이미징
<ol><li>30분 후, 선택된 배아를 10mL의 배아 배지로 옮깁니다. 420 μL의 트리카인 스톡(4 mg/mL)을 10 mL의 배아 배지에 첨가하여 배아를 마취시킵니다.</li>
	<li>배아를 장착하기 위해, 튜브에 동일한 농도의 트리카인을 함유하는 0.8% 저융점 아가로스를 준비한다. 분취량을 ~40°C의 열 블록에 보관하십시오.</li>
	<li>유리 피펫을 사용하여 주입 된 배아를 따뜻한 아가로스에 3 초 동안 담그십시오. 그런 다음 동일한 유리 피펫으로 아가로스에서 배아를 즉시 제거하고 튜브에서 아가로스 한 방울과 함께 35mm 유리 바닥 배양 접시의 중앙에 배아를 놓습니다. 유리에 한 방울 당 하나의 배아 만 놓습니다.</li>
	<li>배아 뇌의 등쪽을 가능한 한 유리 바닥에 가깝게 유지하기 위해 섬유 프로브 또는 로딩 팁으로 배아의 방향을 부드럽게 지정합니다. 용란이 서서히 굳어짐에 따라 말리지 않고 배아를 확장하기 위해 배아 위치를 부드럽게 조정합니다.</li>
	<li>그런 다음 유리 바닥 접시를 뒤집어 배아 위치를 확인합니다. 올바르게 장착된 배아가 있는 전체 등쪽 전뇌를 현미경으로 볼 수 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>배아를 덮기 위해 트리카인을 함유하는 28.5°C로 예열된 배아 배지 2-3mL를 추가합니다. 온도 제어 단계에 접시를 적절하게 놓습니다.tage, 그림 1과 같이 컨포칼 현미경. 이미징 챔버의 온도를 28.5°C로 조정합니다. 이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다.</li>
	<li>40x Water Immersion Objective를 사용하여 고정된 시간 간격으로 타임랩스 라이브 이미징을 수행합니다.<ol><li>이미징 및 현미경 제어 소프트웨어(μMANAGER: https://micro-manager.org/)16를 사용합니다.</li>
		<li>세포에서 MyR-Tdtomato 형질전환 제브라피쉬 및 엔도솜 항-Dld-Atto647N의 막 형광을 이미징하기 위해 564nm 및 647nm의 이미징 채널을 선택합니다(그림 1).</li>
		<li>두 채널 모두에 대해 레이저 출력을 30%로 설정합니다. 각 채널에 대해 z면당 노출 시간을 200ms로 사용합니다.</li>
		<li>장착된 각 제브라피쉬 배아에 대해 총 20개의 z-평면에 대해 1μm의 스캐닝 z-스텝과 100개의 시간 프레임의 스캐닝 주기를 사용합니다.</li>
		<li>각 스캔 주기 사이의 시간 간격을 20초로 설정하고 스캔 모드를 채널, 슬라이스로 설정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

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우리는 제브라피쉬 방사형 신경교 전구체의 엔도솜 노치/델타 트래피킹을 고효율로 표지하고 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 초파리 SOP 세포7,8에서 표지된 항-DeltaD 항체를 추적하는 데 사용된 이전 방법과 비교하여, 우리의 방법은 접합 항체에서 샘플을 배양하는 대신 미세주입을 사용했습니다. 형광 접합 항-Dld 항체를 후뇌 심실에 미세 주입했습니다. 이 기술은 주사 후 배아의 정상적인 발달과 완전한 회복에 의해 입증 된 바와 같이 부상을 일으키지 않습니다. 배아 심실은 연속적이어서 주입된 항체가 미세 주입 후 전뇌 쪽으로 자유롭게 분산될 수 있습니다. 주입된 항-Dld-atto647N은 뇌에서 지속적인 항체 흡수의 안정적인 자원으로 24시간 이상 지속됩니다. 이전 보고서10에서 소개된 신경관 주입과 비교하여 제브라피쉬 후뇌실 주입은 조직 손상을 일으키지 않으며 ...

노치 신호전달은 후생동물에서 발달하는 동안 세포의 운명 결정과 패터닝을 조절하며1, 최근 연구에 따르면 줄기세포 분열에서의 노치 신호전달은 주로 세포내 이동에 의존하는 것으로 나타났다 2,3. 엔도사이토시드 노치/델타는 핵에서 노치 신호전달을 활성화하고 노치 표적 유전자 4,5,6의 전사를 향상시킬 수 있습니다. 방향성 노치/델타 엔도솜 트래피킹은 비대칭 세포 분열(ACD) 동안 초파리 감각 기관 전구체(SOP) 세포에서 처음 관찰되었으며, 그 결과 pIIb 7,8보다 pIIa에서 더 높은 Notch 신호 전달 활성을 보였습니다. 유사분열 SOP 세포의 세포내 과정을 모니터링하기 위해 항-델타 및 항-노치 항체를 사용한 항체 흡수 분석이 적용되었습니다. Notch/DeltaD 엔도솜은 세포분열 동안 키네신 운동 단백질과 함께 중앙 방추체로 이동하고, 세포 분열의 마지막 순간에 비대칭 중심 방추의 역평행 배열로 인해 pIIa 세포로 비대칭적으로 전위됩니다 3,8. 이러한 연구는 초파리 SOP 세포에서 비대칭 분열을 조절하는 분자 메커니즘에 대해 밝혔지만 유사한 내세포 과정이 척추동물 방사형 신경교 전구체(RGP)에서 발생하는지 여부는 불분명합니다.
더욱이, 척추동물 RGP 분열 동안 비대칭 Notch/DeltaD 신호 전달을 조절하는 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 제브라피쉬에서 Notch와 Delta의 상호작용은 DeltaD 리간드9의 엔도사이토시스를 촉진하는 것으로 보고되었습니다. DeltaD 엔도사이토시스가 발달 중인 척추동물 뇌에서 딸 세포의 세포 운명 선택에 영향을 미칠 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 최근 연구에 따르면 형광 접합 항-DeltaD 항체를 신경관에 주입하면 신경상피 세포에서 Sara 엔도솜을 특이적으로 표지할 수 있으며, Sara 엔도솜을 함유한 항-DeltaD는 증식하는 딸 세포로 우선적으로 분리된다10. 엔도솜의 Notch 신호 전달이 딸 세포의 운명을 조절할 수 있다고 제안되었습니다. 이전 결과는 발달 중인 전뇌에서 대부분의 제브라피쉬 RGP 세포가 ACD를 겪고, 딸 세포의 운명 결정은 혈통 내 Notch/DeltaD 신호11에 의존한다는 것을 보여주었다. 제브라피쉬 RGP에서 intralineage Notch/DeltaD 신호 전달의 특성을 설명하기 위해 우리는 제브라피쉬 발달 뇌에서 항-DeltaD 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 유사분열 RGP에서 DeltaD 내세포 트래피킹의 실시간 라벨링 및 이미징을 성공적으로 수행했습니다.
형광 표지된 항-DeltaD 항체는 전뇌 심실을 따라 RGP에 효율적으로 내재화됩니다. 그것은 비대칭적으로 분열하는 RGP12,13에서 DeltaD 엔도솜의 방향성 트래피킹의 발견을 크게 촉진했습니다. 초파리 노텀 배양 및 제브라피쉬 척수10을 위해 개발된 이전 항체 흡수 프로토콜과 비교하여 이 프로토콜은 특히 10nL 미만의 미세 주입된 항체 혼합물로 뇌실 세포층에서 오래 지속되고 매우 효율적인 항-DeltaD 라벨링을 달성했습니다. 후뇌 심실 주사는 제브라 피쉬 배아에서 후뇌 심실이 잘 확장되고 초기 발달 단계14에서 뇌척수액으로 채워지기 때문에 발달중인 뇌에 항체 흡수 분석을 적용하는 데 매우 편리합니다. 중요한 발달 조직을 손상시키지 않고 항체 혼합물을 후뇌 심실에 주입함으로써 프로토콜은 전뇌의 이미징 영역에 대한 가능한 손상을 최대한 최소화했습니다. 주입된 1차 항체의 감소된 용량은 또한 생체 내에서 내인성 Delta-Notch 신호 전달을 방해하는 잠재적인 부작용을 피했습니다. 이 프로토콜은 다른 약리학적 또는 유전적 섭동과 쉽게 결합할 수 있고, 다양한 발달 단계에서 활용될 수 있으며, 성인 뇌와 인간 만능 줄기 세포 유래 2D/3D 뇌 오가노이드에 적용될 수 있습니다. 종합하면, 이 프로토콜을 통해 ACD 동안 Notch 신호 비대칭이 언제 어떻게 설정되는지 이해할 수 있습니다. 이 프로토콜의 성공적인 구현을 위한 주요 과제는 특정 실험 조건에 따라 적절한 농도의 항체를 정확하게 전달하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>35mm 유리 바닥 문화 접시&nbsp;</td><td>MatTek corporation</td><td>P35GC-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>공기 압력 분사기&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>안티-마우스-IgG-Atto647N&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>50185</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>캐필러리, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, 필라멘트 포함</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-6</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 회전 디스크/고속 광시야</td><td>Nikin</td><td>N/A</td><td>Nikon&nbsp; CSU-W1 큰 시야 컨포칼을 가진 Ti 반전 형광 현미경.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont Medical 핀셋 스타일 5</td><td>Thomas Scientific</td><td>72877-D</td><td></td></tr><tr><td>Flaming-Brown P897 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>N/A</td><td>https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI M3301R</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-DLD&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>AB_1268496</td><td></td></tr><tr>Zenon <td>Thermofisher Scientific</td><td>Z25008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000&nbsp에서 마우스 IgG 차단 버퍼 &nbsp;</td><td>자이스&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>UltraPureTM 저융점 아가로스&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish radial glia progenitors의 비대칭 분열 동안 notch/delta endocytosis 추적을 위한 항체 흡수 분석

Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors

서로 다른 운명의 두 딸 세포를 생성하는 비대칭 세포 분열(ACD)은 세포 다양성을 생성하는 데 기본이 됩니다. 무척추 동물과 척추 동물의 발달 기관에서 비대칭으로 분열하는 선조는 Notchhi 자가 재생 및 Notchlo 차별화 딸을 생성합니다. 배아 제브라피쉬 뇌에서 주요 척추동물 신경 줄기 세포인 방사형 신경교 전구세포(RGP)는 대부분 ACD를 거쳐 하나의 RGP와 하나의 분화 뉴런을 낳습니다. 제브라피쉬 배아의 광학적 선명도와 쉬운 접근성은 ACD 동안 Notch 신호의 비대칭성이 언제 어떻게 설정되는지 직접 시각화하기 위한 생체 내 타임랩스 이미징에 이상적입니다. 최근 연구에 따르면 Notch 리간드 DeltaD의 동적 엔도사이토시스는 ACD 동안 세포 운명 결정에 중요한 역할을 하며, 이 과정은 진화적으로 보존된 극성 조절자 Par-3(Pard3라고도 함)과 다인 운동 복합체에 의해 조절됩니다. 유사분열 RGP에서 Notch 신호 엔도솜의 생체 내 트래피킹 패턴을 시각화하기 위해 우리는 이 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 분석을 사용하여 RGP 분열 동안 DeltaD 함유 엔도솜의 역학을 밝혀냈습니다.

도 2A에서, 1차 항체와 결합하지 않고 Atto647N을 주입한 배아는 뇌심실에서 배경 형광을 보였다. 세포에서 삼켜진 형광 입자는 거의 관찰되지 않습니다. 항-Dld-Atto647N 주사된 제브라피쉬 배아는 발달 중인 전뇌의 대부분의 세포에서 많은 양의 내재화된 형광 입자를 보여주었습니다(그림 2A, 오른쪽 패널). 그림 2B와 같이 유사분열 RGP에 초점을 맞추기 위해 확대한 후 세포 분열 동안 세포 내 항-Dld-Atto647N 엔도솜의 동적 움직임을 기록할 수 있었습니다(비디오 1). 대부분의 유사분열 RGP는 항-Dld-Atto647N 엔도솜이 두 개의 딸 세포로 전방 또는 후방 비대칭 분리를 보였다12. 우리는 또한 비대칭이 아나페이즈가 끝날 무렵 안정화되어 나중에 딸 세포에 의한 No...

이 작업은 배아 제브라피쉬 뇌의 방사형 신경교 전구체를 분할할 때 계통 내 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 개발합니다.

Zebrafish Radial Glia Progenitors의 비대칭 분열 동안 Notch/Delta Endocytosis 추적을 위한 항체 흡수 분석

Asymmetric cell division (ACD), which produces two daughter cells of different fates, is fundamental for generating cellular diversity. In the developing ...

노치 신호전달은 후생동물에서 발달하는 동안 황산염 결정 및 패터닝을 제어합니다. 우리는 노치 리간드 델타-D를 표지하고 발달 중인 얼룩말 물고기 전뇌의 방사형 신경교 전구체에서 세포내 이동을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 제브라피쉬 숨겨진 뇌실 주입은 높은 효율성과 오래 지속되는 효과로 발달 중인 뇌실을 감싸는 근토성 방사형 신경교 전구체에 의한 선택적 Anti-DLD-Atto-647N 흡수를 가능하게 합니다.이 프로토콜은 다양한 발달 단계에서 활용되는 다른 약리학적 또는 유전적 섭동과 쉽게 결합할 수 있으며 성인 뇌뿐만 아니라 인간 만능 줄기 세포 유래 2D 또는 3D 뇌 오가노이드에 적용될 수 있습니다. 수정 된 배아를 생성하고 18-20 시간 동안 배양 한 후 인큐베이터에서 제거합니다. 먼저 백색광을 사용하여 20배 배율로 에피형광 현미경으로 관찰합니다.유리 피펫을 사용하여 현미경으로 흐리거나 파열된 것처럼 보이는 죽은 배아는 폐기합니다. 그런 다음 형광등을 켭니다.amp 현미경의 RFP 필터 설정을 선택합니다. 강한 적색 형광을 가진 배아를 선택하고 달걀 물로 새 접시에 옮깁니다.이제 백색광 아래에서 두 개의 미세한 집게로 배아를 수동으로 dechorionate하십시오. 한 쌍의 집게로 chorion을 잡고 다른 집게로 chorion을 찢습니다. 집게를 사용하여 조심스럽게 눈물을 열고 다른 집게의 끝으로 배아를 부드럽게 밀어 배아가 통과할 수 있을 만큼 충분히 크게 만듭니다.미세 주입 전에 빠른 헹굼을 위해 신선한 배아 배지가 있는 새로운 페트리 접시에 박초를 제거합니다. 풀러에서 미세한 주사 바늘을 당긴 후 입체 해부 현미경으로 집게로 바늘 끝을 엽니다. 팁의 직경을 약 10마이크로미터로 만들고 테이퍼 각도를 약 30도로 만듭니다.이제 0.5 마이크로리터의 항-Dld 항체와 2 마이크로리터의 항 마우스 L G Atto-647N 항체를 5-10회 피펫팅하여 접합하고 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 2.5 마이크로리터의 블로킹 완충액과 0.5 마이크로리터의 0.5%페놀 레드를 항체 혼합물에 첨가하고 피펫팅으로 혼합하여 혼합물에 남아 있는 비접합 항체를 차단합니다. 다음으로, 배아 배지에서 1%의 저융점 아가로스를 준비합니다.혼합물이 투명해질 때까지 아가로오스 함유 혼합물을 섭씨 70도에서 가열합니다. 아가로스 용액을 분취한 후 섭씨 40도의 열 블록에 보관하십시오. 1%의 낮은 융점 아가로스가 들어 있는 튜브에서 배아를 3초 동안 헹굽니다.개별 아가로스 방울이 있는 거꾸로 된 플라스틱 페트리 접시 뚜껑에 배아를 놓고 각 배아를 개별적으로 장착합니다. 배아를 아가로스에 옆으로 평평하게 놓고 아가로스가 실온에서 굳을 때까지 이 위치를 유지합니다. agarose에 장착 된 모든 배아를 계란 배지로 덮으십시오.매립된 배아를 실체 현미경 아래에 놓고 아가로스를 계란수로 덮습니다. 마이크로 매니퓰레이터로 공기압 인젝터를 설정하고 현미경 가까이에 배치합니다. 고압의 기체 질소를 함유한 강철 가스 실린더를 공기 자원으로 사용하십시오.배아가 아가로스에 장착되면 가스 밸브를 엽니다. 마이크로 인젝터의 전면 충전 모듈을 사용하는 동안 준비된 유리 바늘에 2마이크로리터의 항체 혼합물을 마이크로 매니퓰레이터에 프런트로드합니다. 이제 입력 압력을 제곱인치당 80-90파운드로 조정하고 사출 압력을 제곱인치당 20파운드로 조정합니다.현미경으로 마이크로미터를 사용하여 주입량을 보정합니다. 바늘 구멍의 크기에 따라 튜닝 시간을 10밀리초에서 120밀리초로 설정합니다. 패들을 두드려 각 주입 펄스를 전달하고 각 주입의 주입량을 4-5 나노 리터로 조정합니다.그런 다음 마이크로 주사 바늘의 끝을 뒷뇌의 등쪽 지붕판을 통해 론디미어 제로원 힌지 포인트 뒤쪽에 찔러 뇌 조직에 부딪히지 않고 약 10나노리터의 항체 혼합물을 주입합니다. 뇌실에서 붉은 액체의 흐름을 관찰했습니다. 주사 후 미세 매니퓰레이터의 손잡이를 돌려 배아에서 바늘 끝을 신속하게 제거합니다.성공적인 주사를 위해, 주입 된 혼합물의 적색 염료는 포위 된 용설로로 누출되지 않고 안정적으로 뇌실에 남아 있습니다. 마운팅 플레이트를 현미경 아래로 이동하여 반복에 적합한 위치에 장착된 다른 배아를 찾습니다. 6 내지 8개의 배아를 주입한 후, 미세수술용 칼로 아가로스를 벗겨 내포된 아가로스로부터 배아를 방출한다.미세 주입된 배아를 30밀리리터의 배아 배지가 있는 신선한 접시에 옮기고 다음 단계를 위해 실온에 두십시오. 30 분 후, 선택된 배아를 10 밀리리터의 배아 배지로 옮긴다. 배아를 장착하려면 튜브에 동일한 농도의 트리칸을 함유한 0.8% 저융점 아가로스를 준비합니다.유리 피펫을 사용하여 주입 된 배아를 따뜻한 아가로스에 3 초 동안 담그십시오. 그런 다음 즉시 동일한 유리 피펫으로 아가로스에서 배아를 제거하고 튜브에서 아가로스 한 방울과 함께 35mm 유리 바닥 배양 접시의 중앙에 배아를 놓습니다. 배아 뇌의 등쪽을 가능한 한 유리 바닥에 가깝게 유지하기 위해 섬유 프로브 또는 로딩 팁으로 배아의 방향을 부드럽게 지정합니다.배아 위치를 부드럽게 돌려 아가로스가 서서히 굳어짐에 따라 말리지 않고 배아를 확장합니다. 그런 다음 유리 바닥 접시를 뒤집어 배아 위치를 확인합니다. 올바르게 장착된 배아가 있는 전체 등쪽 전뇌를 현미경으로 볼 수 있는지 확인하십시오.배아를 덮기 위해 트리칸을 함유 한 섭씨 28.5 도의 예열 된 배아 배지 2-3 밀리리터를 첨가하십시오. 컨포칼 현미경의 온도 제어 단계에 접시를 적절하게 놓고 이미징 챔버의 온도를 섭씨 28.5도로 조정합니다. 이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다.Atto-647N 주입된 배아는 뇌실에서 배경 형광을 보였다. 항-Dld-Atto-647N 주사된 제브라피쉬 배아는 발달 중인 전뇌의 대부분의 세포에서 다량의 내재화된 형광 입자를 보여주었습니다. 시간 경과 이미징은 세포 분열 동안 세포 내 Anti-Dld-Atto-647N 엔도솜의 움직임을 보여주었습니다.대부분의 유사분열 방사상 아교세포 전구체는 항-Dld-Atto-647N 엔도솜이 두 개의 딸 세포로 전방 또는 후방 비대칭 분리를 보였습니다. 비대칭은 아나페이즈가 끝날 무렵 안정화되었고, 그 결과 나중에 딸 세포에 의한 노치 신호 엔도솜의 비대칭 유전이 발생했습니다. 바늘이 올바른 위치에 숨겨진 브랜드 심실에 삽입되었는지 확인하고 미세 주입 후 누출이 있는지 확인하십시오.노치 델타 신호 전달을 라벨링하는 것 외에도, 이 프로토콜은 세포외 도메인에 대한 우수한 항체를 사용할 수 있는 경우 유사한 전략을 사용하여 다른 막 단백질 또는 세포외 단백질을 라벨링하는 데 적용할 수 있습니다.

antibody-uptake-assay-for-tracking-notchdelta-endocytosis-during

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

이 비디오는 제브라피시 방사상 신경교세포에서 Notch/DeltaD 신호를 이미지화하기 위한 항체 흡수 분석을 보여줍니다. 여기에는 아가로스가 박힌 탈이온화된 제브라피시 배아를 장착하고, 망막 신경절 세포에 DeltaD 리간드를 표적으로 하는 염료 용액을 주입하고, 비대칭 세포 분열을 위해 형광 현미경으로 이미징하여 Notch/DeltaD 신호 활성화를 확인하는 작업이 포함됩니다.

제브라피시 방사상 신경교세포(Radial Glia progenitor)에서 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

제브라피시 배아에 존재하는 저농도 내인성 수용체를 검출하기 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 우리는 이를 AFLIP이라고 명명했는데, 이는 면역침전과 연결된 리간드에 의한 수용체의 친화성 표지로 구성되어 있기 때문입니다.

Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

Immunolabeling 방법 개발 zebrafish 두뇌에 microtubules의 명료한 인구를 분석 하는 다른 조직에 광범위 하 게 적용 되는 여기에, 설명 됩니다. 첫 번째 프로토콜 immunolabeling 안정적이 고 동적 microtubules에 대 한 최적화 된 방법을 설명합니다. 두 번째 프로토콜 이미지와 초기 microtubules 구체적으로 정량화 하는 방법을 제공 합니다.

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

반응성 친전자필 및 산화제(Z-REX)를 표적으로 하는 제브라피쉬는 반응성 소분자 신호 조사를 위한 화학 생물학 기반 방법입니다. 이 기술은 다양한 발달 단계의 활어에 적용 할 수 있습니다. 여기에서는 신호 전달 경로 분석을 위해 제브라피쉬의 표준 분석과 Z-REX를 결합합니다.

유충 제브라피쉬의 표적 신호 반응 모니터링 - Z-REX는 친전자성 약물 및 대사 산물의 정확한 메커니즘을 밝힙니다.

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

배우세요 제브라피쉬 방사성교아전구세포에서 Notch/DeltaD 내재화를 추적하는 항체 흡수 분석법을 Danio rerio를 이용하여 신경발생 연구에 적용하는 방법을. 이 기술은 세포 운명 결정 메커니즘을 명확히 밝히는 데 활용됩니다.

Zebrafish Radial Glia Progenitors의 비대칭 분열 동안 Notch/Delta Endocytosis 추적을 위한 항체 흡수 분석

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