Fluorescence-Activated Nucleus Sorting을 사용한 지방 조직을 사용한 지방 세포 특이적 ATAC-Seq

ATAC-seq는 유전자 발현 조절 메커니즘을 이해하는 강력한 기술입니다. 그러나 지방 조직은 지질 함량이 크고 미토콘드리아 오염이 높으며 세포 이질성이 높기 때문에 이 기술을 사용하기가 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 미토콘드리아 DNA 오염을 최소화하면서 고품질 데이터를 생성하는 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 지방 세포 특이적 ATAC 시퀀싱을 수행했습니다.

이 방법은 세포 유형별 Cre 마우스 라인이 핵 라벨링 형질전환 리포터 라인과 함께 제공되는 다른 조직에서도 사용할 수 있습니다. 샘플당 하나의 유리 Dounce로 얼음 위의 유리 Dounce 균질화기를 식혀 핵 분리를 시작합니다. 그런 다음 각 유리 Dounce에 7 밀리리터의 NPB 혼합물을 추가합니다.

그런 다음 50-100 밀리그램의 냉동 지방 조직을 유리 Dounce에 넣고 긴 가위를 사용하여 몇 개의 작은 조각으로 자릅니다. 모든 샘플에 대해 느슨한 유봉으로 10 번 치고 단단한 유봉으로 10 번 치십시오. 여과된 균질액을 원심분리를 위해 15밀리리터 튜브로 옮기기 전에 100마이크로미터 스트레이너를 통해 내용물을 새 50밀리리터 튜브로 여과합니다.

상청액을 제거한 후 부드럽지만 철저한 손가락 두드림으로 펠릿을 500마이크로리터의 PBS-N에 재현탁합니다. 다음으로, 40 마이크로미터 스트레이너를 통해 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 여과하고, 250 마이크로리터의 PBS-N으로 스트레이너를 헹굽니다. 마이크로피펫을 사용하여 여과된 핵 현탁액을 형광 활성화 세포 분류 또는 FACS 튜브로 옮깁니다.

새로운 1.5밀리리터 튜브에 500마이크로리터의 PBS-N을 추가하여 수집 튜브를 준비하고 버퍼로 모든 내부 표면을 적시도록 몇 번 뒤집습니다. 분류될 때까지 얼음 위에 놓기 전에 튜브를 짧게 돌려 모든 액체를 내립니다. FACS의 경우 싱글렛에는 FSC-A/FSC-H 게이팅을, 작거나 큰 이물질 제거에는 FSC-A/SSC-A를 사용합니다.

mCherry/GFP 양성 지방세포 핵 집단을 게이트하고 이전에 준비된 각 수집 튜브에서 10, 000개의 핵을 수집합니다. 분류 후 핵 준비를 위해 각 수집 튜브에 500마이크로리터의 PBS-N을 추가하고 섭씨 4도에서 10분 동안 200G에서 수집 튜브를 원심분리하기 전에 튜브를 몇 번 뒤집어 혼합합니다. 상청액을 완전히 제거하십시오.

25 마이크로리터의 Tn5 마스터 혼합물을 제조하기 위해, 12.5 마이크로리터의 2x 태그먼트 DNA 완충액 또는 TD 완충액, 1.25 마이크로리터의 Tn5 트랜스포이즈아제 또는 TDE I 효소 및 11.25 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 혼합한다. 다음으로, 25마이크로리터의 Tn5 마스터 혼합물을 각 핵 펠릿에 추가하고 부드러운 피펫팅으로 재현탁합니다. 열 혼합기를 사용하여 섭씨 37도에서 30분 동안 600RPM에서 배양합니다.

Tn5 핵 재현탁 혼합물의 25 마이크로리터에 뉴클레아제가 없는 물 25 마이크로리터를 첨가하여 최종 부피를 50 마이크로리터로 만듭니다. 이어서, pH 5.2의 완충액 PB 250 마이크로리터 및 3 M 아세트산나트륨 5 마이크로리터를 첨가한다. 상기 혼합물을 참조된 키트와 함께 제공된 컬럼으로 옮긴 후, 실온에서 1분 동안 17, 900 G에서 원심분리한다.

플로우 스루를 버린 후 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 놓습니다. 절대 에탄올을 함유하는 완충 PE 750 마이크로리터를 튜브에 첨가한다. 컬럼을 원심분리하고, 플로우 스루를 버리고, 스핀 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣습니다.

튜브를 원심분리하고 플로우스루가 있는 수집 튜브를 폐기합니다. 전치된 DNA 단편을 증폭하기 위해 고유한 Ad2를 추가하지 않고 PCR 마스터 혼합물을 준비합니다. n 바코드 프라이머.

PCR을 실행합니다. 정량적 PCR 또는 qPCR을 실행합니다. 증폭 곡선을 확인하고 최대치의 약 35%에 도달한 주기 수를 추정하여 필요한 추가 PCR 주기 수를 식별합니다.

계산을 사용하여 PCR 반응의 나머지 45마이크로리터에 대해 PCR을 실행합니다. 이전 절차를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 20마이크로리터의 완충액 EB로 용리합니다. 용출된 DNA를 새로운 PCR 튜브로 옮기고 80마이크로리터의 완충액 EB를 첨가하여 부피를 100마이크로리터로 조정합니다. 다음으로, 55 마이크로리터의 SPRI 비드를 첨가하고 피펫팅으로 혼합한다. 실온에서 5 분간 배양 한 후 미니 마그네틱 스탠드에서 5 분 동안 분리합니다.

완료되면 150 마이크로리터의 상층액을 새 PCR 튜브로 옮기고 95 마이크로리터의 SPRI 비드를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 미니 마그네틱 스탠드에서 비드를 분리하기 전에 5분 동안 반응을 배양합니다. 상청액을 조심스럽게 버리고 200 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 사용하여 1 분 동안 비드를 세척하십시오.

두 번 더 세탁을 반복하십시오. 최종 세척 후 튜브를 1000G에서 1분 동안 원심분리합니다. 남은 에탄올을 피펫으로 제거하고 뚜껑을 연 상태에서 PCR 기계에서 섭씨 37도에서 2분 동안 펠릿을 건조시킵니다.

건조되면, 피펫팅에 의해 20 마이크로리터의 완충액 EB에 펠릿을 재현탁하고 실온에서 5분 동안 튜브를 배양한다. 최종 라이브러리를 포함하는 18 마이크로리터의 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기기 전에 미니 마그네틱 스탠드에서 5분 동안 비드를 분리합니다. mCherry 표지 및 GFP 표지 지방세포 핵은 Adipoq-NuTRAP 마우스의 지방 조직에서 분리된 다른 세포 유형 핵과 구별할 수 있었습니다.

지방 저장소의 유형에 따라 지방 세포 분획에서 eWAT에서 약 50%, iWAT에서 30%, BAT에서 65%의 차이가 관찰되었습니다. 15회 이상의 PCR 주기가 필요한 샘플은 품질이 낮은 샘플을 나타냅니다. ATAC-seq 라이브러리의 크기 분포 분석은 뉴클레오솜 무함유 영역(NFR)에 해당하는 다중 피크와 평균 크기가 약 500 내지 800 염기쌍인 모노, 디 및 다중 뉴클레오솜을 입증했습니다.

품질이 좋지 않은 샘플은 일반적으로 뉴클레오솜 피크가 없거나 거의 없는 NFR을 대부분 나타내었습니다. qRT-PCR 분석에 의한 품질 검사 검사는 Adipoq, Fabp4, Plin1 및 Pnpla2와 같은 지방 세포 마커 유전자 근처에서 양성 게놈 요소로 10-20 배 농축을 보인 반면, 음성 대조군에서는 농축이 나타나지 않았다. 열 발생 유전자 Ucp1에 의한 농축은 BAT에서 특이적으로 관찰되었습니다.

미토콘드리아 판독은 2% 미만이었고 피크 아래의 분율은 약 18%에서 44%였습니다모든 지방 저장소에서 Adipoq, Fabp4 및 Plin1과 같은 지방 세포 마커 유전자 근처에서 높은 신호 대 잡음비를 갖는 다중 강력한 피크가 밝혀졌습니다. BAT 샘플의 갈색 지방세포 마커 Ucp1 유전자좌에서 강한 ATAC-seq 피크가 관찰되었습니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 요소는 핵 품질입니다.

고품질 조직 샘플을 사용하고 실험 전반에 걸쳐, 특히 원심분리 및 분류 후 재현탁 중에 핵을 부드럽게 처리하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 핵 라벨이 있는 형질전환 리포터 마우스에 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 여기서는 NuTRAP 마우스를 사용했지만 유사한 시스템을 사용할 수 있습니다.

당사의 FACS 데이터를 통해 전산 다중 분석을 수행하여 생물학적 환경에서 유전자 발현을 조절하는 주요 전사체 인자를 찾을 수 있습니다.