Name: 마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드의 확립, 유지, 분화, 유전자 조작 및 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 학습하세요 마우스와 인간 눈물샘 오가노이드 확립 및 유지 방법을 통해 재생의학 연구를 수행하세요. 이 기술은 건성안 질환 치료와 눈물샘 항상성 유전자 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

프로토콜의 초기 개발에 대해 Yorick Post에 감사드립니다. 이 연구는 Cancer Research UK Grand Challenge(C6307/A29058)와 Mark Foundation for Cancer Research에서 SPECIFICANCER 팀에 수여하는 상으로 부분적으로 지원되었습니다.

<ol><li>Garg, A., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+development%3A+From+signaling+interactions+to+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland development: From signaling interactions to regenerative medicine.</a> Developmental Dynamics. 246 (12), 970-980 (2017).</li>
<li>Selinger, D. S., Selinger, R. C., Reed, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+infection+of+the+external+eye%3A+The+role+of+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Resistance to infection of the external eye: The role of tears.</a> Survey of Ophthalmology. 24 (1), 33-38 (1979).</li>
<li>Messmer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+treatment+of+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Deutsches+Arzteblatt+International%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease.</a> Deutsches Arzteblatt International. 112 (5), 71-81 (2015).</li>
<li>Massie, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+lacrimal+gland+spheroids+for+lacrimal+gland+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of lacrimal gland spheroids for lacrimal gland tissue regeneration.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2001-2009 (2018).</li>
<li>Tiwari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+human+lacrimal+gland+cultures+with+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function.</a> PloS One. 7 (1), 29458(2012).</li>
<li>Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Halbert, C. L., Ma, Q., Sun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immortalized+rabbit+lacrimal+gland+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of immortalized rabbit lacrimal gland epithelial cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (4), 198-204 (1999).</li>
<li>Bannier-Hélaouët, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+human+lacrimal+gland+using+organoids+and+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing.</a> Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232 (2021).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
<li>Jeong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+functional+epithelial+organoids+from+human+lacrimal+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of functional epithelial organoids from human lacrimal glands.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 247(2021).</li>
<li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineering organoids.</a> Nature Reviews Materials. 6 (5), 402-420 (2021).</li>
<li>Meyenberg, M., Ferreira da Silva, J., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+DNA+repair+outcomes+shape+the+landscape+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific DNA repair outcomes shape the landscape of genome editing.</a> Frontiers in Genetics. 12, 728520(2021).</li>
<li>Geurts, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+adenine+editors+correct+nonsense+mutations+in+a+cystic+fibrosis+organoid+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank.</a> Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).</li>
<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+Studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: Studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PLoS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+organoids+as+a+potential+platform+for+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy.</a> Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Lian, J., Meng, X., Zhang, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genetic+manipulation+of+murine+hepatocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62438(2022).</li>
<li>Lõhmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+cervical+tissue+dynamics+and+viral+oncogenesis+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.</a> Cell Stem Cell. 28 (8), 1380-1396 (2021).</li>
<li>Bloh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+complex+DNA+repair+%28DECODR%29%3A+Establishing+a+novel+deconvolution+algorithm+for+comprehensive+analysis+of+CRISPR-edited+Sanger+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of complex DNA repair (DECODR): Establishing a novel deconvolution algorithm for comprehensive analysis of CRISPR-edited Sanger sequencing data.</a> The CRISPR Journal. 4 (1), 120-131 (2021).</li>
<li>Latta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+aniridia-associated+keratopathy%3A+Developmental+aspects+and+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of aniridia-associated keratopathy: Developmental aspects and unanswered questions.</a> The Ocular Surface. 22, 245-266 (2021).</li>
<li>Veernala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lacrimal+gland+regeneration%3A+The+unmet+challenges+and+promise+for+dry+eye+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Lacrimal gland regeneration: The unmet challenges and promise for dry eye therapy.</a> The Ocular Surface. 25, 129-141 (2022).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+lacrimal+gland+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D lacrimal gland organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 605 (7908), 126-131 (2022).</li>
</ol>

Hans Clevers는 바젤 로슈의 제약 연구 및 초기 개발 책임자이며 오가노이드 기술과 관련된 여러 특허를 보유하고 있습니다.

이 프로토콜은 기능 분석, 돌연변이 모델링 및 이식을 위한 눈물샘 오가노이드의 설정 및 사용을 설명합니다. 마우스와 인간 눈물샘 오가노이드를 확립할 때 조직 해리가 중요합니다. 조직이 충분히 소화되지 않으면 오가노이드 수율이 낮아집니다. 조직이 과도하게 소화되면 세포가 죽고 오가노이드로 자라지 않습니다. 각 조직은 최적의 오가노이드 성장을 보장하기 위해 특정 시간 동안 특정 효소로 소화되어야 합니다14,17,18. 눈물샘은 피펫팅 기반의 기계적 해리와 결합된 5-10분의 콜라게나제 소화가 작은 조직 조각을 분리하기에 충분한 다소 부드러운 조직입니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 응용 분야를 위해 단일 세포를 얻어야 하는 경우, 단일 세포 단계에 도달할 때까지 해리를 더 오래 수행할 수 있지만, 생존력 감소를 제한하기 위해 단일 세포를 얻는 즉시 해리를 중지해야 합니다. 조직 해리가 매우 중요하기 때문에 과소화는 눈물샘 오가노이드 형성 실패의 가장 큰 원인입니다.
눈물샘 오가노이드의 적절한 유지는 사용에 중요합니다. 장기 유지는 유도만능줄기세포 유래 오가노이드와 비교하여 성체줄기세포 유래 눈물샘 오가노이드의 특징입니다 7,17. 장기적인 유지 관리를 위해서는 정기적인 오가노이드 분할 및 중간 교체를 수행해야 합니다. 이것이 없으면 오가노이드는 분화하기 시작하고 줄기 세포 잠재력이 감소하여 장기적인 유지를 방해합니다7. 이 단계에서 다시 말하지만, 과소화는 줄기 세포를 죽이고 오가노이드 유지를 손상시킬 수 있습니다. 정기적인 유지 관리를 위해 단일 세포로의 오가노이드 해리가 필요하지 않습니다. 그러나 클론 녹아웃 오가노이드 라인을 생성하려면 단일 세포로 시작하는 것이 중요합니다. 그렇지 않은 경우 오가노이드는 서로 다른 유전적 배경을 가진 세포의 모자이크로 구성되어 정의된 단일 돌연변이의 효과를 분석하는 것이 불가능합니다. 여기에서는 정지 코돈을 생성하기 위해 C > T 베이스 편집기를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 게놈 편집기는 NGG PAM의 12-18개 염기 내에서 아르기닌, 글루타민 또는 트립토판 코돈의 존재에 의존합니다. gRNA 설계에서 이러한 조건이 충족되지 않는 경우, 대체 PAM이 있는 기존 Cas9 또는 C>T base editor를 사용할 수 있습니다 7,18. 그러나 기존의 Cas9는 수리 시 인델을 초래하는 이중 가닥 파손을 도입합니다(11). 두 대립 유전자 모두 서로 다른 인델을 가질 수 있으므로 클론 유전형 분석에는 추가적인 주의가 필요합니다. 도입된 변형의 디콘볼루션은 두 대립 유전자 모두 프레임 밖 인델을 포함하도록 수행되어야 하며, 따라서 오가노이드 클론이 표적 유전자에 대해 녹아웃되도록 해야 합니다19. C > T 염기 편집기의 장점은 반드시 정지 코돈을 초래하지 않는 점 돌연변이를 모델링하는 데 사용할 수 있다는 사실에 있습니다. 예를 들어, 홍채증 환자에서 발견되는 특정 Pax6 돌연변이를 모델링하여 눈물샘 생리학에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있다20.
눈물샘은 눈물막1의 수성 부분을 분비합니다. 눈물 분비는 성장 인자 철회 및 NOTCH 억제에 의해 매개되는 분화 후 인간 오가노이드에서 요약될 수 있습니다. 이러한 조건에서 오가노이드는 말단 분화를 거쳐 더 이상 유지될 수 없습니다. 그러나 차별화된 눈물샘 오가노이드는 잠재적으로 고처리량 스크리닝에서 안구 건조증의 맥락에서 눈물을 유발하는 약물의 개발을 안내할 수 있습니다. 이 프로토콜에 제시된 찢어짐 분석은 현재 짧은 시간 내에 오가노이드 크기의 가장 큰 변화를 제공하는 분석법으로, 약물 스크리닝 7,9,17의 맥락에서 더 쉽게 정량화할 수 있습니다.
줄기세포 치료는 안구건조증에서 눈물샘 재생에 큰 가능성을 가지고 있다21. 성체 줄기 세포 유래 눈물샘 오가노이드는 이러한 응용 분야의 원료가 될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 대부분 낭종으로 인간 눈물샘 오가노이드 생착을 초래합니다. 낮은 오가노이드 생착은 잘못된 부위에 오가노이드가 주입되어 발생할 수 있습니다. 염료로 주입 절차를 훈련하면 주입 부위를 추적할 수 있으며 궁극적으로 주입 정확도가 향상됩니다. 대안적으로, 마우스 표피는22세 이전의 쥐에서와 같이 눈물샘에 직접 접근할 수 있도록 절개될 수 있다. 이 방법은 시간이 더 오래 걸리지만 더 정확할 수 있습니다. 반면에, 본 프로토콜에서는 오가노이드가 마우스 눈물샘에 기능적으로 통합되지 않았습니다. iPSC 유래 눈물샘 생착에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다22. 이식 방법은 눈물샘을 미리 상처를 입히거나, 안구건조증 마우스 모델을 사용하거나, 오가노이드를 단세포 또는 작은 덩어리로 주입함으로써 더욱 개선될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 성체 줄기 세포 유래 눈물샘 오가노이드 및 관련 툴킷은 눈물샘 연구 및 재생 의학에서 향후 응용 분야의 기초가 될 수 있습니다.

눈물샘은 눈물막1의 수성층의 대부분을 생성하는 선 상피이다. 눈물막의 수층에는 안구 표면을 윤활하는 물뿐만 아니라 감염으로부터 안구 표면을 보호하는 다양한 항균 성분이 포함되어 있다2. 눈물샘이 손상되거나 염증이 생기면 안구건조증이 발생하여 환자에게 불편함을 주고 결국 시력 상실로 이어질 수 있다3. 수년에 걸쳐, 눈물샘, 특히 인간의 샘을 연구하는 모델 시스템은 제한적이었다 4,5,6. 이것은 생리학적 및 병리학적 조건에서 눈물샘 기능에 관한 지식 격차에 기여했습니다.
최근에, 시험관 내 모델은 접시 7,8,9에서 눈물샘을 연구하기 위해 개발되었다. 이 눈물샘 오가노이드는 세포외 기질에서 3차원 구조로 성장한 성체 줄기 세포에서 유래하며, 시험관 내에서 재생 능력을 유지하는 성장 인자 칵테일이 보충됩니다 7. 성체줄기세포(ASC) 유래 오가노이드의 장점은 건강한 조직 특징을 재현하면서 매우 오랫동안 유지될 수 있다는 것입니다. 이러한 유형의 오가노이드는 예를 들어 기질 세포를 포함할 수 있는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 오가노이드와 달리 상피 세포로만 구성됩니다. 만능줄기세포(PSC) 유래 오가노이드와 달리 ASC 오가노이드는 성체 조직에서 직접 형성되며 확장하기 위해 유전자 변형이 필요하지 않습니다. ASC 오가노이드는 성인의 특성을 나타낸다10.
이 프로토콜에는 마우스 및 인간 일차 조직에서 눈물샘 오가노이드를 추출하기 위한 도구 상자가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 간단한 성장 인자 회수를 통해 오가노이드의 기능을 더욱 향상시키는 방법과 팽창 분석을 수행하여 오가노이드가 누액을 분비하도록 자극하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에는 CRISPR 유래 염기 편집기를 사용하여 마우스 오가노이드를 유전적으로 조작하기 위한 전기천공 기반 형질주입 방법이 추가로 포함되어 있습니다. 기존의 Cas9와 달리 염기 편집기를 사용하면 이중 가닥 절단을 생성하지 않고 게놈의 단일 염기를 수정할 수 있습니다11,12. 마지막으로, 인간 눈물샘 오가노이드를 면역결핍 마우스에 이식하고 생착에 대한 후속 조직학적 평가를 설명합니다. 이 눈물샘 오가노이드 툴킷은 눈물샘 재생 및 기능에 대한 연구와 유전 및 염증성 질환 모델링에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 안전 잠금 원심 분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td>CAS : 868272-85-9,주의, 6g / L 용액은 -20 °deg에서 분취하여 저장할 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>5x 녹색 GoTaq Flexi 버퍼</td><td>Promega</td><td>M891A</td><td>-20도에서 저장; C</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>-20 &deg에 저장; C, 30 mM의 재고, 10000x</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>4°C의 재고; </td></tr><tr><td>C 한천 플레이트 Ampicillin</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 VAPOUR-Line lite</td><td>VWR 화학 물질</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>-20 &deg에 저장; C, 50x</td></tr><tr><td>BD 마이크로 파인 인슐린 바늘 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 현미경 DMI1</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>MP 생물 의학</td><td>160069</td><td>4 &deg에서 저장; C</td></tr><tr><td>BTXpress</td><td>BTX</td><td>MDS450805</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카세트</td><td>Klinipath</td><td>410-02S</td><td></td></tr><tr><td>CellBanker 1</td><td>amsbio</td><td>11910</td><td>냉동 보존 매체, 지침 준수</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>J.T. Baker</td><td>0088</td><td>CAS : 5949-29-1</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 I</td><td>시그마 알드리치</td><td>C9407</td><td>분취량은 20 mg / mL, 20x, -20 °C에서 보관; C</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 50 mL</td><td>Corning</td><td>CLS430828-500EA</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 24 mm x 50 mm</td><td>Menzel-Gl&auml; zer</td><td>BB024050S1</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 기저막 추출물(BME), 성장 인자 감소, 유형 2 - 세포외 기질</td><td>R& D Systems, Bio-Techne</td><td>3533-001-02</td><td>-20 &deg에 보관; C, 4 &deg로 유지하십시오. 최대 1개월 동안 C</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td>-20 &deg에서 저장; C, 10 mM의 재고, 1000x</td></tr><tr><td>인산 수소 수소 나트륨 무수</td><td>VWR 화학 물질</td><td>28026.292</td><td>CAS : 7558-79-4</td></tr><tr><td>디 나트륨 수소 인산염 이수화물</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>71643</td><td>CAS : 10028-24-7</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td>50 U / mL의 분취량, -20 °C에서 보관; C 사용 전까지, 400x</td></tr><tr><td>일회용 메스 멸균 N&deg; 10</td><td>Swann Morton</td><td>3033838</td><td></td></tr><tr><td>DM4000 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP 25 mM</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td>모든 4 뉴클레오티드를 함께 섞고, -20 &deg에서 보관; C</td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>Easy strainers 70 &micro; m</td><td>Greiner</td><td>542170</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td><td>Nepagene</td><td>EC002S</td><td></td></tr><tr><td>EnVision+/HRP 마우스</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 100%</td><td>BOOM</td><td>84045206; 5000</td><td>주의, 다른 에탄올 희석액을 준비하는 데 사용</td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>BOOM</td><td>84010059.5000</td><td>주의</td></tr><tr><td>에탄올 96%</td><td>BOOM</td><td>84050065.5000</td><td>주의</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 2 세포 이미징 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>라이브 이미징 명시야 마이크로스크로프</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>-20 &deg에 저장; C, 기본 매체, 100x</td></tr><tr><td>피지</td><td>NIH, 피지 개발자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드 용액 4 %</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>1.00496</td><td>CAS : 50-00-0,주의</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris</td><td>1099</td><td>-20 &deg; C, 10 mM의 재고, 10000x</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA 중합효소</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td>-20 &deg에서 저장; C</td></tr><tr><td>Haematoxylin</td><td>VWR 화학 물질</td><td>10047105</td><td>실온에서 보관</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>4 &deg에서 보관; C, 100x</td></tr><tr><td>Histocore H 및 C, 조직 임베딩 기계</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>Meidax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 핵 항원 항체</td><td>Abcam</td><td>ab-190710</td><td></td></tr><tr><td>염산 5 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10605882</td><td>CAS : 7647-01-0,주의</td></tr><tr><td>수소 퍼 옥사이드 30 %</td> <td>Chem-lab</td><td>CL00.2308.1000</td><td>CAS : 7722-84-1, 주의</td></tr><tr><td>Hygromycin B-gold</td><td>InvivoGen</td><td>ant-hg</td><td>100 mg/&micro 재고; L, 1000x</td></tr><tr><td>하이그로마이신 내성 카세트 함유 플라스미드</td><td></td><td></td><td>Andersson-Rolf 외, Nature Methods, 2017.doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>IsoFlo 100%</td><td>Mecan</td><td>5960501</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Hubrecht Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 25 mM</td><td>Promega</td><td>A351H</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Microtome RM2235</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midiprep DNA 분리 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210005</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep DNA 분리 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K210003</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>-20 &deg에서 저장; C, 500 mM의 재고, 400x</td></tr><tr><td>NEPA21 electroporator</td><td>Nepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>-20 &deg에 저장; C, 1M의 재고, 100x</td></tr><tr><td>NOD Scid Gamma (NSG) 마우스</td><td>Hubrecht Institute colony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Noggin 컨디셔닝 매체</td><td>U-Protein Express</td><td>맞춤 주문</td><td>상점 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>노르아드레날린</td><td>시그마 알드리치</td><td>A7257</td><td>-20 &deg에 저장; C, 100 mM</td></tr><tr><td>오븐</td><td>Memmert</td><td></td><td>58 &deg에 놓인 주식; C</td></tr><tr><td>P20, P200 및 P1000 피펫</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>VWR 화학 물질</td><td>10048502</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫, 유리 플러그</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1150-6973</td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV_ABEmax_P2A_GFP</td><td>Addgene</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>인비트로겐</td><td>15140-122</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>퍼텍스</td><td>클리니패스</td><td>AM-08010</td><td></td></tr><tr><td>pFYF1320&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>47511</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1000X, -20 &deg에서 저장; C</td></tr><tr><td>프로스타글란딘 E2 (PGE2)</td><td>Tocris</td><td>2296</td><td>-20 &deg에 저장; C, 10 mM, 10000x</td></tr><tr><td>페트리 접시, 10 cm</td><td>Greiner</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Q5 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 고충실도 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 추출 솔루션</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td>Store 부분 표본 -20 &deg에서; C</td></tr><tr><td>R-spondin 3 컨디셔닝 미디엄</td><td>U-Protein Express</td><td>맞춤 주문</td><td>스토어 -20 &deg; C</td></tr><tr><td>sgRNA 리버스 프라이머 : TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드</td><td>StarFrost</td><td>MBB-0302-55A</td><td>접착제, 그라운드</td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>Merck</td><td>8.22335.1000</td><td>CAS : 26628-22-8,주의</td></tr><tr><td>시트 나트륨 이수화물</td><td>J.T. 베이커</td><td>0280</td><td>CAS : 6132-04-3</td></tr><tr><td>표준 포워드 프라이머: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>서브클로닝 효율 역량 세포 DH5alpha</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>현탁 세포 배양 플레이트(24웰)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24웰</td></tr><tr><td>현탁 세포 배양 플레이트(12웰)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665102</td><td>12웰</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TAE 완충액</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B49</td><td>Stock at 50x, 초순수</td></tr><tr><td>Transposase 함유 플라스미드</td><td></td><td></td>로 1x로 희석 <td>Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017.doi: 10.1038/nmeth.4156</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td>4°C에 저장; C</td></tr><tr><td>U6_Forward 프라이머 : GGGCAGGAAGAGGGCCTAT</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose 1000</td><td>Invitrogen</td><td>16550</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Tulabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Klinipath</td><td>4055-9005</td><td>CAS : 1330-20-7,주의</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>-20 &deg에 보관하십시오. C, 10mM, 1000x에서 스톡</td></tr></tbody></table>

마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드의 확립, 유지, 분화, 유전자 조작 및 이식

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

눈물샘은 안구 표면 항상성에 필수적인 기관입니다. 눈물막의 수성 부분을 생성함으로써 건조 스트레스와 외부 손상으로부터 눈을 보호합니다. 적절한 시험관 내 모델이 없기 때문에 눈물샘(병리) 생리학에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 오가노이드 기술은 여러 장기에 유용한 실험 플랫폼으로 입증되었습니다. 여기에서 우리는 눈물샘 생검에서 시작하여 마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드를 확립하고 유지하기 위한 프로토콜을 공유합니다. 배양 조건을 수정하여 눈물샘 오가노이드 기능을 향상시킵니다. 오가노이드 기능은 눈물샘 오가노이드를 선택된 신경 전달 물질에 노출시켜 내강에서 눈물 방출을 유발하는 "울음" 분석을 통해 조사할 수 있습니다. 이 현상을 이미지화하고 정량화하는 방법을 설명합니다. 눈물샘 항상성에서 관심 유전자의 역할을 조사하기 위해 유전자 변형이 가능합니다. 우리는 가이드 RNA 설계에서 오가노이드 클론 유전형 분석에 이르기까지 기본 편집기를 사용하여 눈물샘 오가노이드를 유전적으로 변형하는 방법을 철저히 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스에 동소 이식을 통해 인간 눈물샘 오가노이드의 재생 가능성을 조사하는 방법을 보여줍니다. 이 포괄적인 도구 세트는 마우스와 인간 눈물샘 오가노이드를 사용하여 눈물샘(병리) 생리학을 연구할 수 있는 리소스를 제공합니다.

마우스 눈물샘을 해부한 후(그림 2A), 효소 및 기계적 소화는 작은 조직 조각을 생성했으며, 그 중 아시니와 덕트를 구별할 수 있었습니다(그림 2B). 나머지 큰 조직 조각은 ECM을 불안정하게 만들어 초기 오가노이드 성장을 감소시킵니다. 마우스 눈물샘 오가노이드 유도는 오가노이드가 분리될 준비가 된 단계인 ~7일 후에 ~500μm 직경의 낭성 오가노이드가 발견되었을 때 성공적이었습니다(그림 2C). 전체 오가노이드 유도가 성공적이더라도 일부 오가노이드는 결국 중단되기 전에 성장하기 시작할 수 있습니다. 인간 눈물샘 오가노이드는 3-4일 이내에 낭종으로 성장했고 조직 분리 후 10-14일 이내에 완전히 자란 크기에 도달했습니다(그림 2D). 생쥐와 인간 모두에서 오가노이드 유도가 실패하는 경우가 있었으며 오가노이드가 자라지 않거나 거의 자라지 않았습니다. 이것은 일반적으로 조직의 과소화로 인해 발생했습니다. 마우스 눈물샘 오가노이드는 최소 40배, 인간 오가노이드는 최소 20배 계대할 수 있습니다. 계대배양은 오가노이드 성장에 따라 평균 7-10일마다 수행되었습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig02.jpg"> 그림 2: 마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드의 확립. (A) 쥐 눈물샘 절제의 여러 단계 사진. 화살표는 보호막 아래의 눈물샘을 가리킵니다. (B) 조직 소화 직후 마우스 눈물샘 세포의 명시야 이미지, 삽입물은 acinus와 duct를 보여줍니다. (C) 성공적인 마우스 눈물샘 오가노이드 유도의 명시야 이미지. (D) 14일 동안 인간 오가노이드 성장의 명시야 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
눈물샘 오가노이드는 확장 배지에서 배양할 때 많은 비율의 줄기 세포를 포함합니다. 그들의 분화 수준을 높이기 위해, 우리는 성장 인자 함량이 감소된 마우스와 인간 분화 배지를 설정했습니다. 분화 배지에서 각각 5일 및 7일 후, 마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드는 더 조밀해졌다(도 3A-B). 이러한 형태학적 변화는 기능적 특성의 증가와 상관관계가 있습니다. 순환 AMP 활성제인 포스콜린 또는 신경전달물질인 노르에피네프린을 적용하면 3시간 이내에 오가노이드 부종(즉, 정단 수분 분비)이 발생했습니다(그림 3C). 부종이 3-4시간 이상 걸렸을 때, 이는 오가노이드가 충분히 분화되지 않았거나 신경전달물질에 대한 수용체와 같은 기능적 마커를 발현하지 않았음을 시사했습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig03.jpg"> 그림 3: 마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드의 분화 및 인간 오가노이드의 기능적 부종 분석. (A) 팽창 배지에서 7일, 분화 배지에서 5일 동안 배양한 마우스 눈물샘 오가노이드의 명시야 이미지, 확장 배지에서 2일 후. (B) 팽창 배지에서 11일 동안 배양하고 확장 배지에서 2일 후 분화 배지에서 9일 동안 배양한 인간 눈물샘 오가노이드의 명시야 이미지. (C) 3시간 동안 신선한 분화 배지(대조군), 1μM 포스콜린 및 100μM 노르에피네프린에 노출된 분화된 인간 눈물샘 오가노이드의 명시야 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마우스 눈물샘 오가노이드에서 Pax6를 녹아웃하기 위해 선택한 Pax6 표적 gRNA를 포함하는 플라스미드를 PCR 및 결찰에 의해 생성했습니다(그림 4A). 이 gRNA 함유 플라스미드는 단일 세포로 해리된 마우스 눈물샘 오가노이드에서 Piggy-Bac 플라스미드(하이그로마이신 내성 트랜스포존 함유 및 트랜스포사제 함유 플라스미드) 및 C&gt; T 염기 편집기 Cas9와 함께 전기천공되었습니다. 3일 후, 오가노이드가 회복되었을 때, 그들은 하이그로마이신 내성 카세트를 통합한 클론을 선택하기 위해 하이그로마이신에 노출되었습니다. 성공적인 전기천공법에서 하이그로마이신에 내성이 있는 오가노이드가 성장했습니다(그림 4B). ~300μm보다 큰 성장하는 오가노이드 클론은 이상적으로는 자발적으로 분화되기 전에 선택되었습니다(그림 4C). DNA는 오가노이드의 일부에서 추출하고 나머지는 배양에 유지하였다. gRNA에 의해 표적화된 Pax6 유전자좌의 PCR 증폭은 선택된 각 클론에 대해 367bp 밴드를 생성했습니다(그림 4D). 증폭된 유전자좌를 시퀀싱한 후, 동형접합적으로 C &gt; T 편집된(n = 1) 클론을 유지하였다. 반면에, 편집되지 않았거나(n=4), 이형접합적으로 편집되었거나, 잘못 편집된(n=1) 클론은 폐기되었다(도 4E). 전반적으로, Pax6를 표적으로 하는 이 gRNA를 사용하여 6개의 염기서열 중 하나의 동형접합 녹아웃 마우스 눈물샘 클론을 얻었습니다. 일부 클론은 잘 자랐지만 일부 오가노이드 클론은 채취 후 손실되거나 분화되기 시작했습니다(그림 4F). 선별된 10개의 오가노이드 클론 중 7개가 잘 자랐습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig04.jpg"> 그림 4: 마우스 눈물샘 오가노이드에서 Pax6의 염기 편집 매개 녹아웃. (A) Pax6 유전자좌를 표적으로 하는 gRNA의 올바른 통합 후 pFYF1320의 Sanger 시퀀싱 추적. (B) 전기천공 후 하이그로마이신에 노출된 지 5일 후 마우스 눈물샘 오가노이드의 명시야 이미지. 오가노이드는 마우스 확장 배지에서 배양하였다. 왼쪽은 하이그로마이신에 내성이 있는 클론이 자라지 않는 실패한 전기천공의 예입니다. 오른쪽은 여러 개의 하이그로마이신 내성 오가노이드 클론이 살아남은 성공적인 전기천공의 예입니다. (C) 선택해야 하는 클론과 선택하지 말아야 하는 클론의 명시야 이미지. (D) gRNA로 표적화된 Pax6 유전자좌의 증폭을 보여주는 아가로스 겔. 녹색에서는 예상 크기인 367bp의 밴드가 강조 표시됩니다. (E) 하이그로마이신에 내성이 있는 3개의 오가노이드 클론의 Sanger 시퀀싱 추적. 최상위 클론은 편집되지 않습니다. 중간 클론은 동형 접합 C &gt; T 에디션이므로 동형 접합 녹아웃입니다. 하단 클론은 두 개의 이형 접합 점 돌연변이를 나타내며 이형 접합 녹아웃 또는 혼합 클론이며 잘못 편집되었습니다. (F) 다양한 수준의 성장을 가진 선별된 오가노이드 클론의 명시야 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마지막으로, 마우스에 인간 눈물샘 오가노이드 오가노이드 동소 이식술을 시행하기 위하여, 3일 전에 분할된 오가노이드(직경 100μm &lt;)를 사용하였다. 오가노이드 생착은 마우스 눈물샘에 오가노이드를 주입한 지 1개월 후에 인간 특이적 마커인 인간 뉴클레오라 항원에 대한 염색을 통해 확인되었다(도 5). 마우스 눈물샘의 모든 부분에서 점상 염색이 없다는 것은 인간 오가노이드 생착이 부족함을 의미했습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65040/65040fig05.jpg"> 그림 5: 인간 눈물샘 오가노이드를 마우스 눈물샘에 이식. 이식 1개월 후 생착을 모니터링하기 위해 인간 핵핵 마커에 대한 이식된 마우스 눈물샘의 염색. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/65040fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 배지 및 완충액의 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65040/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 일차 마우스 및 인간 조직에서 유래한 눈물샘 오가노이드를 확립, 유지, 유전적으로 변형, 분화, 기능적으로 특성화 및 이식하는 방법을 설명합니다.

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

눈물샘 오가노이드를 사용하면 특정 유전자가 눈물샘 항상성을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있습니다. 또한 오가노이드는 재생 의학에 사용할 수 있습니다. 성체 줄기 세포 유래 눈물샘 오가노이드 기술의 주요 장점은 건강하고 변형되지 않은 눈물샘 상피 세포의 성장과 연구를 가능하게 한다는 것입니다.이 오가노이드는 결국 안구건조증 환자를 치료하는 데 사용될 수 있습니다. 실험에 필요한 배지와 재료를 준비한 다음 실험 전에 소화 배지의 모든 구성 요소를 결합합니다. 티슈 조각이 메스에 달라붙지 않도록 이 매체에 메스를 미리 적십니다.배지에서 마우스 눈물샘 조직을 꺼내 페트리 접시에 넣고 미리 적신 메스를 사용하여 다집니다. 티슈 조각이 0.5 입방 밀리미터 미만이되면 메스로 페트리 접시에서 긁어 내고 소화 매체가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 아주 작은 인간 생검의 경우, 다지지 않고 소화 배지에 직접 넣으십시오.조직 조각이 있는 15밀리리터 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 최대 15분 동안 배양합니다. 그 동안 파스퇴르 피펫 팁을 화염에 좁히고 기본 배지에 미리 적십니다. 해리 과정을 용이하게 하기 위해 미리 적시고 좁아진 파스퇴르 피펫으로 다진 혼합물을 5분마다 위아래로 피펫팅합니다.현미경으로 많은 단일 세포와 작은 덩어리가 보이면 기본 배지 10ml를 추가하여 해리를 중지합니다. 400g에서 5분 동안 회전시킨 후, 상청액을 제거하고, 펠릿을 10 밀리리터의 기본 배지에 재현탁하여 세척을 반복하고 세포를 펠릿 아래로 내린다. 다진 혼합물을 70마이크로미터 여과기로 여과하여 소화되지 않은 큰 조직 조각과 남아 있는 콜라겐 섬유를 제거합니다.용리액을 400g에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 제거한 후, 기포를 생성하지 않고 단일 마우스 눈물샘의 경우 100 마이크로 리터의 차가운 세포 외 기질 (ECM)과 인간 생검의 경우 50 마이크로 리터의 차가운 ECM에 세포 펠릿을 재현탁합니다. P200을 사용하여 12-웰 현탁액 플레이트의 웰 당 최대 100 마이크로리터의 세포를 시딩하여 웰 내에 약 20 마이크로리터의 액적을 만든다.ECM이 응고될 수 있도록 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 20-30분 동안 플레이트를 거꾸로 놓습니다. ECM이 고형화되면, 12-웰 플레이트의 웰 당 약 1 밀리리터의 실온 마우스 팽창 배지를 첨가한다. 눈물샘 오가노이드에 의한 분비를 유도하는 개별 성분을 함유하는 인간 분화 배지 1밀리리터를 새로 준비한다.자동 명시야 타임랩스 현미경에서 플레이트에서 이미지화할 위치, 5분의 시간 간격 및 4시간의 지속 시간을 설정합니다. 각 위치에서 전체 ECM 방울이 보이는지 확인합니다. 이미징을 시작하기 전에 현미경에서 플레이트를 이동하지 않고 이미징할 웰에서 배양 배지를 제거하고 포스콜린 및 노르아드레날린을 포함한 화합물을 함유한 새로 준비되고 잘 재현탁된 인간 분화 배지로 교체합니다.음성 대조군으로, 분화 배지를 새로 고친 웰을 포함하십시오. 현미경의 실행 버튼을 클릭하고 4시간 후에 결과를 분석합니다. 본문에 언급된 대로 오가노이드를 해리한 후 상층액을 버립니다.80 마이크로리터의 전기천공 완충액에 세포를 재현탁합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 실험에 필요한 플라스미드를 준비합니다. 플라스미드를 세포에 넣고 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.포링 펄스 및 전송 펄스에 대한 매개변수로 전기포레이터를 설정합니다. 플라스미드가 있는 세포를 전기천공 큐벳에 넣습니다. 0.3암페어에서 0.55암페어 사이여야 하는 저항을 즉시 측정하고 즉시 전기천공합니다.완료되면 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 Rho-kinase 억제제가 보충 된 400 마이크로 리터의 전기 천공 완충액을 추가합니다. 세포를 실온에서 30분 동안 회복시킵니다. 다음으로, 세포를 500g에서 5분 동안 펠렛화한다.상청액을 버린 후, 세포를 200 마이크로리터의 ECM에 플레이트한다. 응고 후 마우스 확장 매체를 추가합니다. 오가노이드 제제의 경우, 이식일 약 3일 전에 인간 눈물샘 오가노이드를 분할합니다.ECM에서 오가노이드를 추출하려면 배양 배지에 디파아제를 첨가하여 밀리리터당 0.125단위의 최종 농도에 도달하고 P1000을 사용하여 ECM 방울을 완전히 재현탁하여 파쇄합니다. 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 30분 동안 다시 넣습니다. 오가노이드를 10밀리리터의 기본 배지에 재현탁하여 효소를 씻어냅니다.400g에서 5분 동안 세포를 펠릿화한 후 5% ECM이 보충된 50마이크로리터의 차가운 인간 팽창 배지에 재현탁합니다. 오가노이드 현탁액을 얼음 위에 놓고 즉시 이식을 진행합니다. 생쥐의 동소 이식을 위해 인슐린 바늘로 오가노이드 현탁액을 흡인합니다.마우스가 잠 들어있을 때, 주요 눈물샘에 접근 할 수 있도록 마우스를 옆으로 빠르게 눕히십시오. 5마이크로리터의 오가노이드 현탁액을 피부를 통해 눈물샘에 직접 주입합니다. 마우스가 회복될 수 있도록 하고 매일, 특히 눈에 이식 관련 불편함이 있는지 평가합니다.쥐의 눈물샘을 해부한 후, 효소 및 기계적 소화는 acini와 ducts를 포함한 작은 조직 조각을 생성했습니다. 성공적인 마우스 눈물샘 오가노이드 유도에서, 약 500 마이크로미터 직경의 낭성 오가노이드가 7일 후에 발견되었다. 인간 눈물샘 오가노이드는 3-4일 이내에 낭종으로 성장했으며 조직 분리 후 10-14일 이내에 완전히 자란 크기에 도달했습니다.분화 배지에서 각각 5일 및 7일 후, 마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드의 밀도가 높아졌다. 순환 AMP 활성제인 포스콜린 또는 신경전달물질인 노르에피네프린을 바르면 3시간 이내에 오가노이드 부종이 발생했습니다. 성공적인 전기천공법에서 하이그로마이신에 내성이 있는 오가노이드가 자랐습니다.300마이크로미터 이상의 성장하는 오가노이드 클론은 분화 전에 선택되었습니다. 가이드 RNA에 의해 표적화된 Pax6 유전자좌의 PCR 증폭은 선택된 모든 클론에 대해 367개의 염기쌍 밴드를 생성했습니다. 6개의 염기서열 중 하나의 동형접합 녹아웃 마우스 눈물샘 클론을 Pax6를 표적으로 하는 가이드 RNA를 사용하여 얻었습니다.일부 클론은 잘 자랐지만 일부 오가노이드 클론은 채취 후 손실되거나 분화되기 시작했습니다. 선별된 10개의 오가노이드 클론 중 7개가 잘 자랐습니다. 오가노이드 생착은 마우스 눈물샘에 오가노이드를 주입한 지 1개월 후에 인간 특이적 마커인 인간 뉴클레오라 항원에 대한 염색을 통해 확인하였다.주의해야 할 한 가지는 조직이나 오가노이드를 과도하게 소화하지 않는 것입니다. 그렇지 않으면 세포가 죽을 수 있으며 이는 오가노이드 확립 속도를 감소시킵니다. 눈물샘 오가노이드는 조직학에 의해 분석될 수 있다.그렇게 함으로써 세포 구성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

establishment-maintenance-differentiation-genetic-manipulation

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

눈물샘 (LG)는 비전과 눈 건강을 유지하기 위해 필요한 눈물의 수성 부품을 생산하는 분기 기관이다. 여기에서 우리는 LG 개발에 참여 경로 신호 해독 쥐 LG 절제술 및 체외 배양 기술에 대해 설명합니다.

쥐의 눈물샘을 조작

눈물 샘 (LG)에는 α-평활 근 액 틴를 발현 하는 두 가지 세포 유형 (α Sma)이 있습니다. MECs는 많은 선 조직에서 발견 되는 외 배 엽 기원 이며, 심 낭은 내 배 엽 기원의 혈관 평활 근 세포입니다. 이 프로토콜 뮤 린 LGs에서 MECs 및 심 낭을 분리 합니다.

성인 뮤 린 눈물과 턱 밑 동맥에서 Myoepithelial 세포의 고립

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

마우스 간세포로부터 장기 전 시험관 3D 오르간구배기 시스템이 구축되었다. 이러한 오르가노이드는 shRNA/ectopic 구조, siRNA 경질 및 CRISPR-Cas9 엔지니어링의 렌티바이러스 감염에 의해 통과되고 유전적으로 조작될 수 있다.

뮤린 헤파토세포 오르가노이드의 설립 및 유전적 조작

성체 눈물샘(LG) 줄기세포를 위한 삼차원, 무혈청 배양 방법은 LG 오가노이드 형성의 유도 및 아시나 또는 덕트 유사 세포로의 분화를 위해 잘 확립되어 있다.

눈물샘 줄기세포를 위한 삼차원, 무혈청 배양 시스템

여기에서는 안와외 및 안와하부눈물샘을 절제하여 수성 결핍성 안구건조증의 마우스 모델을 확립하고 수성 결핍성 안구건조증에서 안구 표면의 변화를 평가하는 방법을 제시합니다.

수성 결핍성 안구건조증 Mouse Model 구축

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

이 프로토콜은 건강, undifferentiated 인간의 배아 줄기 (ES) 세포를 유지하는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

성인 심장 myocytes 동물 마음으로부터 격리하고 며칠 동안 교양 수있는 기본 세포입니다. 이 문화가 기간 내에 adenoviral 유전자 전송은 유전자 인코딩 bi​​osensors (GEBs) 또는 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 두 접근 방법 공촛점 현미경에 의해 세포 조사를 허용합니다.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

유전자 전체에서 상피 세포를 조작하는...

침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

학습하세요 마우스와 인간 눈물샘 오가노이드 확립 및 유지 방법을 통해 재생의학 연구를 수행하세요. 이 기술은 건성안 질환 치료와 눈물샘 항상성 유전자 연구에 활용됩니다.

마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드의 확립, 유지, 분화, 유전자 조작 및 이식

더 많은 동영상 탐색