폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 정량화 및 전체 게놈 특성 분석

폐수 기반 역학은 현재 폐수 샘플에서 바이러스 RNA를 검출하고 잠재적인 발병을 식별하여 전 세계적으로 COVID-19 통제 전략을 보완하는 데 사용됩니다. 이 기술은 무증상 사례를 포함하여 지역 사회의 COVID-19 확산에 대한 인구 전체 스냅샷을 제공합니다. 공기 샘플링도 이 프로토콜에 중요한 추가 기능입니다.

임상 진단은 여전히 질병 발생 및 전염병을 관리하는 가장 정확한 방법입니다. 그러나 이 기술은 여전히 이를 보완하는 데 유용합니다. 이 방법에는 많은 단계와 임계점이 있습니다.

분자 생물학에 익숙하지 않은 실험실에서 절차를 복제할 수 있으므로 시각적 시연이 필수적입니다. 시작하려면 24시간 복합 폐수 샘플 1리터를 수집합니다. 20마이크로리터의 멩고바이러스를 70밀리리터의 샘플에 넣습니다.

샘플을 700G에서 10분 동안 원심분리한 후 원심분리에 의해 10킬로달톤이 차단된 원심 한외여과 장치를 사용하여 생성된 상층액을 농축합니다. 700G에서 40분 동안 원심분리하고 한외여과 장치의 위치를 반전시켜 농축액을 용리합니다. 생성된 농축액을 RNA 추출에 사용합니다.

공기 샘플을 수집하려면 수집을 시작하기 전에 공기 샘플러에 멸균 콘을 놓습니다. 샘플링이 끝나면 상용 바이러스 RNA 추출 키트 또는 사내 방법을 사용하여 원뿔의 세척된 PBS에서 RNA를 추출합니다. 각 표적, 멩고바이러스, SARS-CoV-2, N1 및 N2 유전자에 대한 반응 마스터 믹스를 시약 설정실의 깨끗한 후드에서 준비합니다.

프라이머-프로브 혼합물과 효소를 5회 반전 또는 펄스 와류로 혼합합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 콜드 랙에 보관하고 15마이크로리터의 혼합물을 스트립 PCR 튜브 또는 냉각 랙에 놓인 96웰 PCR 플레이트에 분주합니다. 플레이트를 덮고 핵산 취급 구역으로 옮깁니다.

추출된 RNA의 부분 표본을 5초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다. 반응 혼합물에 RNA 5 마이크로 리터를 피펫하여 25 마이크로 리터를 만들고 RT-qPCR을 시작합니다. PCR 플레이트에서 각 샘플의 16 마이크로리터를 플레이트의 해당 위치에 피펫팅하고 5회 역전사 또는 RT 마스터 믹스 4마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음 PCR 반응을 시작합니다. 다음으로, 각 프라이머 세트의 10 마이크로몰 희석액과 각 프라이머 세트에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 새 PCR 플레이트에서 마스터 혼합물 20 마이크로리터를 피펫팅한 다음 각 혼합물에 5 마이크로리터의 RT 샘플을 피펫팅합니다.

플레이트를 덮은 후 PCR 반응을 시작합니다. PCR이 끝나면 1000G에서 15-30초 동안 플레이트를 회전시킵니다. PCR 정제를 위해 각 웰에 50마이크로리터의 비드 기반 시약을 추가하고 피펫팅으로 혼합하여 자기 분리를 진행합니다.

마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 각 펠릿을 15 마이크로 리터의 PCR 등급 물로 재현탁시키고 플레이트를 실온에서 2 분 동안 배양합니다. 접시를 자석 스탠드에 다시 놓고 2분 동안 구슬이 펠릿되도록 합니다.

그런 다음 각 샘플에서 15마이크로리터의 상층액을 새 PCR 플레이트로 조심스럽게 피펫팅합니다. 다음으로, 라이브러리 준비를 위해 DNA 라이브러리 준비 키트에서 1.75 마이크로리터의 반응 완충액과 0.75 마이크로리터의 효소 혼합물을 각 샘플에 추가합니다. 덮인 플레이트를 잠시 소용돌이치고 1000G에서 15-30초 동안 회전합니다.

섭씨 21도에서 5분, 섭씨 65도에서 5분간 배양합니다. 각 샘플에 대해 3마이크로리터의 PCR 등급 물을 새 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 염기서열분석 라이브러리 준비를 위해 준비된 샘플 0.75마이크로리터와 바코드 1.25마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음 5 마이크로리터의 T4 DNA 리가아제 마스터 믹스를 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 원심 분리기에서 플레이트를 회전시킨 후 플레이트를 섭씨 21도에서 20분, 섭씨 65도에서 10분 동안 배양합니다. 모든 샘플을 풀링한 후 PCR 정제를 위해 192마이크로리터의 비드 기반 시약을 풀에 추가합니다.

피펫팅으로 잘 섞고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 자석 스탠드에 놓습니다. 상층액이 맑아지고 비드 펠릿이 형성될 때까지 기다립니다.

마그네틱 스탠드에서 상층액과 튜브를 제거합니다. 700 마이크로리터의 짧은 단편 완충액 또는 SFB를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 펠릿이 형성되고 액체가 맑아질 때까지 기다립니다.

피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 35 마이크로리터의 PCR 등급 물을 튜브에 넣고 피펫팅으로 혼합한 후 실온에서 2분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드가 펠릿이 되고 액체가 맑아지도록 합니다.

상층액 35 마이크로 리터를 새 튜브에 피펫팅합니다. 다음으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 어댑터 결찰 반응 혼합물을 준비하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PCR 정제를 위해 비드 기반 시약 20마이크로리터를 결찰 반응 혼합물에 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드 펠릿이 형성되고 상층액이 무색이 될 때까지 기다립니다. 피펫팅을 통해 상층액을 조심스럽게 폐기합니다. 125마이크로리터의 SFB를 튜브에 혼합하고 마그네틱 스탠드에 다시 올려 비드를 분리합니다.

액체가 맑아지면 상층액을 버리고 앞에서 설명한 대로 SFB 추가를 반복합니다. 마그네틱 스탠드의 튜브를 30초 동안 열어 둡니다. 용출 완충액 15마이크로리터를 넣고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.

잠깐 회전하여 실온에서 5분 동안 배양한 후 마그네틱 스탠드에 2분 동안 올려 놓습니다. 형광 DNA 정량 분석 키트로 농도를 측정하기 위해 15 마이크로리터의 상층액을 새로운 저결합 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 플로우 셀을 Real-Time DNA 및 RNA 염기서열분석 장치에 삽입합니다.

1, 000 마이크로리터로 설정된 피펫의 팁을 200 마이크로리터의 프라이밍 포트에 삽입합니다. 볼륨 설정 휠을 돌려 팁에 액체가 보일 때까지 볼륨을 높인 다음 팁을 버리십시오. 800 마이크로리터의 프라이밍 혼합물을 기포 없이 프라이밍 포트에 넣고 5분 동안 기다립니다.

라이브러리 200 마이크로리터의 피펫을 프라이밍 포트에 혼합합니다. 덮개 포트와 프라이밍 포트를 닫습니다. 소프트웨어에서 염기서열분석 실험을 시작하고 Base Calling On을 선택합니다.이 방법은 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하고 정량화했습니다.

폐수 샘플은 3 개의 유전자 중 1.91 %에서 13.98 %의 표준 편차를 가지며 3.05 x 10에서 3에서 2.83 x 10에서 리터 당 8 개의 유전자 사본 범위였습니다. 공기 샘플은 6.17 x 10 내지 3 내지 5.48 x 10 내지 9 범위였으며, 중복의 표준 편차는 0.54%와 10.95% 사이였으며, 이 프로토콜에 기술된 바와 같이, 샘플들은 시퀀싱되었고, 3개의 서열화된 샘플 결과의 예가 여기에 요약되어 있다. 세 가지 샘플 모두에서 BA.5 계통.

x는 Freyja 도구에서 가장 널리 사용되는 것으로 할당되었습니다. 폐수 샘플의 농도는 바이러스 RNA가 폐수에 낮은 농도로 존재하기 때문에 중요한 단계입니다. 따라서 이 단계는 정확한 검출 및 정량화를 위한 기본입니다.

이 절차는 다른 감염원을 검출하고 정량화하는 데 사용되는 RT-qPCR 프로토콜의 다양한 프라이머를 사용하여 조정할 수 있습니다. 이 기술은 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2를 정확하게 정량화했습니다. 서로 다른 위치에서 다양한 병원체를 검출하고 정량화할 수 있습니다.