Name: 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 정량화 및 전체 게놈 특성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 학습하세요 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA 정량화와 전체 게놈 특성 분석 방법을. 타일드 앰플리콘 장서열 템플릿 시퀀싱을 활용한 이 기술은 하수 역학 연구와 공중보건 모니터링에 필수적인 도구입니다.

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이 작업은 Castilla y Leon 지방 정부와 FEDER 프로그램 (프로젝트 CLU 2017-09, UIC315 및 VA266P20)의 재정 지원으로 수행되었습니다.

여기에 설명된 모든 방법은 다른 곳에서 발표되었으며 원래 방법에서 약간 수정된 내용이 포함되어 있습니다.
1. 폐수 수집 및 시료 전처리
참고: 환경 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 농도가 낮기 때문에 성공적인 검출을 위해서는 농도 단계의 구현이 중요합니다33,34,35. 여기에 설명된 것은 폐수36에서 SARS-CoV-2를 검출하기 위해 최초로 보고된 방법입니다.
<ol><li>폐수 샘플의 수집 및 농축<ol><li>1L의 24시간 복합 폐수 샘플을 수집합니다. 샘플을 4°C에서 보관하고 24시간 이내에 프로토콜을 진행합니다.</li>
		<li>병을 부드럽게 흔들어 샘플을 균질화합니다. 70mL를 100mL 원심 튜브에 수집하거나 샘플을 50mL의 원심 튜브 2개로 나눕니다.</li>
		<li>농축 공정의 내부 통제로 각 샘플의 70mL에 20μL의 mengovirus(3.2 x 103 copies/μL)를 스파이크합니다. 또는 각 50mL 원심분리기 튜브에 10μL의 mengovirus(3.2 x 103 copies/μL)를 스파이크합니다.</li>
		<li>시료를 균질화하고 700 x g에서 10분 동안 원심분리하여 큰 입자와 유기체(펠릿)를 제거합니다.</li>
		<li>4°C에서 40분 동안 4,000 x g 으로 원심분리하여 10KDa의 컷오프를 가진 원심 한외여과 장치로 농축을 위해 생성된 상층액을 사용합니다. 700 x g 에서 40분 동안 원심분리하고 한외여과 장치의 위치를 반전시켜 농축액을 용리합니다.</li>
		<li>결과 농축액의 부피를 측정하십시오. 부피는 원심 필터를 막는 샘플의 고형물의 양에 따라 변합니다. 이 연구에서 얻은 농축액 부피는 200-1,200 μL 사이였습니다.</li>
		<li>생성된 농축액은 상용 키트 또는 사내 분석법을 사용하여 RNA 추출에 사용합니다. 이 연구에 사용된 샘플의 경우 용출량이 50μL인 바이러스 RNA 추출을 위한 특정 상용 키트가 사용됩니다.</li>
		<li>형광 RNA 정량 분석 키트로 추출된 RNA의 농도를 측정합니다. 추출된 RNA를 부분 표본으로 나누고 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 동결합니다. 참고: 각 RNA 분리 절차 세트에 대해 추출 중 가능한 오염을 검출하기 위한 완충액만 포함하는 분리 음성 제어(NCI)가 포함되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Coriolis 소형 공기 샘플러를 사용한 공기 샘플 수집<ol><li>표본 추출 빈도와 표본 추출 위치를 정의하여 연구 목표에 따라 표본 추출 전략을 선택합니다.</li>
		<li>에어 샘플러의 유량을 설정합니다(여기서는 30분 동안 50L/min). 유속이 200L/min 이상이면 바이러스 RNA가 분해될 수 있으므로 200L/min 미만의 유속을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>시작을 펄스하여 수집을 시작하기 전에 공기 샘플러에 멸균 콘을 놓습니다. 샘플링이 완료되면 5-15mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 콘에 추가합니다. 샘플을 부드럽게 소용돌이치거나 손으로 15초 동안 흔듭니다. 4°C 또는 -80°C에서 최대 24시간 동안 샘플을 cryotube에 보관합니다.</li>
		<li>선택적 농축 단계를 수행할 수 있습니다. 표백제를 사용하여 각 실험 후에 콘을 청소하고 오염을 제거합니다.</li>
		<li>상용 키트 또는 자체 분석법을 사용하여 RNA를 추출합니다. 이 연구의 샘플에는 용출량이 50μL인 바이러스 RNA 추출을 위한 특정 상용 키트가 사용됩니다.</li>
		<li>형광 RNA 정량 분석 키트로 추출된 RNA의 농도를 측정합니다. 추출된 RNA를 부분 표본으로 나누고 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 동결합니다. 참고: 각 RNA 분리 절차 세트에 대해 추출 중 가능한 오염을 검출하기 위한 완충액만 포함하는 분리 음성 제어(NCI)가 포함되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 실시간 정량적 중합효소연쇄반응(RT-qPCR)에 의한 SARS-CoV-2 RNA 정량 분석
참고: 아래 프로토콜은 CDC 2019-신종 코로나바이러스(2019-nCoV) RT-PCR 진단 패널37에 따른 것입니다. 프라이머/프로브 혼합물을 여러 부분 표본으로 나누어 동결 및 해동 주기를 방지합니다.
<ol><li>각 표적에 대한 반응 마스터믹스를 준비합니다(mengovirus; SARS-CoV-2 [N1 및 N2 유전자])를 표 1과 같이 시약 설정실의 깨끗한 후드에 담았습니다. 프라이머/프로브 혼합물과 효소를 반전으로 5회 혼합합니다. 양자택일로, 가벼운 맥박 소용돌이는 뇌관/조사 혼합 및 효소5 시간. 알림: 준비 및 사용 중에는 모든 시약을 차갑게 유지하십시오. 동결-해동 주기를 최소화하려면 부분 표본으로 동결하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>튜브를 아래로 돌리고(15-30초 동안 1,000 x g ) 바닥에 내용물을 모으고 튜브를 차가운 선반이나 얼음 위에 놓습니다.</li>
	<li>각 표적에 대해 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 부착합니다. 각 마이크로 원심분리기 튜브에 필요한 각 시약의 양을 추가합니다(반응당 부피 x 필요한 대조군을 포함한 반응 횟수). 피펫팅을 위아래로 혼합하고 5초 동안 원심분리하여 바닥에 있는 내용물을 수집합니다.</li>
	<li>마이크로 원심분리기 튜브를 콜드 랙에 보관하고 15μL를 스트립 PCR 튜브 또는 냉각 랙의 96웰 플레이트에 분주합니다. 플레이트를 덮고 핵산 취급 구역으로 옮깁니다(냉각 랙에 보관).</li>
	<li>추출된 RNA의 부분 표본을 해동하고 5초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다. 5μL의 RNA(5μL의 비템플릿 대조군[NTC], 분리 음성 대조군[NCI] 및 양성 대조군[PC]에 추가)를 각 반응 웰 또는 이전에 준비된 마스터믹스가 포함된 튜브에 피펫팅합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 필요에 따라 장갑을 자주 교체하십시오.</li>
	<li>전체 반응판 또는 튜브를 덮고 부드럽게 소용돌이칩니다. 원심분리기(15-30초 동안 1,000 x g ) 플레이트 또는 PCR 튜브.</li>
	<li>다음 사이클링 조건에서 25 μL RT-qPCR을 시작합니다: 45°C에서 10분 동안 역전사 효소; 95°C에서 10분 동안 중합효소 활성화; 95°C에서 15초 동안 45회 변성 주기; 60 °C에서 45 초 동안 어닐링 / 확장.</li>
	<li>Conte et al.38에 의해 보고된 mengovirus 대조군의 회복 효율을 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65053/65053eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
</ol>3. 폐수 및 데이터 분석의 염기서열분석 변형
참고: 설명된 프로토콜은 Quick et al.39,40에 의해 생성된 수정된 프로토콜입니다. PCR 타일링 방법론에 의한 SARS-CoV-2 게놈 증폭을 위해 ARTIC 프라이머와 VarSkip 프라이머의 두 가지 프라이머 세트를 사용합니다. 프라이머의 조합은 최상의 게놈 커버리지를 보장하고 한 유형의 프라이머가 고장날 수 있는 새로운 돌연변이의 가능성을 최소화하는 데 사용됩니다. 일반적으로 프로토콜은 역전사(RT) 및 앰플리콘 생성, 염기서열분석 라이브러리 준비, 염기서열분석 및 데이터 분석의 세 부분으로 나뉩니다.
<ol><li>역전사 및 앰플리콘 생성<ol><li>입력 샘플에 알려진 qPCR 순환 임계값(Ct) 값이 있는지 확인하여 PCR 등급 물에서 올바르게 희석합니다. Ct 값은 qPCR로 정량화하는 동안 얻어집니다. 희석액은 다음과 같습니다 : Ct 값이 12-15 인 경우 샘플을 1:100으로 희석하십시오. Ct 값이 15-18이면 샘플을 1:10으로 희석합니다. Ct 값이 18-35이면 샘플을 희석하지 마십시오. Ct 값이 35 이상인 샘플은 작동하지 않을 가능성이 높습니다.</li>
		<li>PCR 플레이트에서 각 샘플의 16μL를 플레이트의 해당 위치로 피펫팅합니다. 4μL의 역전사(RT) 마스터믹스(5x)를 추가합니다. 플레이트를 덮고 25°C에서 2분, 55°C에서 20분, 95°C에서 1분 동안 PCR 반응을 시작합니다.</li>
		<li>각 프라이머 세트(ARTIC 풀 A 및 풀 B, VarSkip 풀 A 및 풀 B)의 10μM 희석액을 준비합니다. 표 2와 같이 각 프라이머 세트(ARTIC 세트 A 및 B, VarSkip 세트 A 및 B)에 대한 마스터믹스를 준비합니다. 이를 통해 4개의 마스터믹스가 탄생합니다.</li>
		<li>새 PCR 플레이트에서 마스터믹스 20μL를 각 해당 웰에 피펫팅합니다. 각 혼합물에 RT 샘플 5μL를 추가합니다. 참고: 각 샘플에는 ARTIC 풀 A와 B, VarSkip 풀 A와 B의 4가지 반응 혼합물이 있습니다.</li>
		<li>플레이트를 덮고 다음과 같이 PCR 반응을 시작합니다 : 중합효소 활성화 98 °C에서 30 초; 98°C에서 15초 동안 35회 변성 주기; 65°C에서 4분 동안 어닐링/연장. 플레이트를 아래로 돌립니다(1,000-15초 동안 30 x g ). ARTIC 반응 풀을 결합하고 VarSkip 반응 풀을 별도로 결합합니다. 각 샘플에는 두 개의 50μL 앰플리콘 반응이 있습니다.</li>
		<li>PCR 정제를 위한 비드 기반 시약 50μL를 각 웰에 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다. 참고: 매번 사용하기 전에 PCR 정제 시약을 세게 혼합하여 비드를 재현탁하십시오.</li>
		<li>플레이트를 자기 분리 스탠드에 놓고 비드가 펠릿을 형성하고 액체가 맑아질 때까지 기다립니다(~5분). 피펫팅하고 상층액을 버립니다. PCR 플레이트를 마그네틱 스탠드에 보관하십시오.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에 PCR 플레이트를 유지하면서 비드 펠릿을 건드리지 않고 각 샘플에 200μL의 80% 에탄올을 추가합니다. 에탄올을 제거하십시오.</li>
		<li>이전 단계를 반복합니다. 에탄올이 증발할 수 있도록 마그네틱 스탠드의 플레이트를 덮지 않은 상태로 30초 동안 그대로 두십시오.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거하고 각 샘플에 15μL의 PCR 등급 물을 추가합니다. 피펫팅으로 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 2분간 배양합니다.</li>
		<li>플레이트를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 비드가 펠릿이 되도록 합니다(2분). 각 샘플에서 상층액 15μL를 새 PCR 플레이트로 조심스럽게 피펫팅합니다.</li>
		<li>형광 RNA 정량 분석 키트로 각 샘플의 농도를 측정합니다. 12.5 μL의 각 샘플에서 약 50 ng를 다음 단계로 가져갑니다. 필요한 경우 샘플을 PCR 등급의 물에 희석합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>도서관 준비<ol><li>Illumina DNA 라이브러리 준비 키트의 반응 완충액 1.75μL와 효소 혼합물 0.75μL를 각 샘플에 추가합니다. 플레이트를 덮고 잠시 소용돌이친 다음 아래로 회전합니다(15-30초 동안 1,000 x g ). 21°C에서 5분, 65°C에서 5분간 배양합니다.</li>
		<li>새 플레이트에서 각 샘플에 대해 3μL의 PCR 등급 물을 새 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 준비된 샘플 0.75μL, 염기서열분석 라이브러리 준비를 위한 바코드 1.25μL, T4 DNA 리가아제 마스터믹스 5μL를 추가합니다. 피펫팅으로 잘 혼합하고 원심분리기에서 잠시 스핀다운(15-30초 동안 1,000 x g )하고 21°C에서 20분, 65°C에서 10분 동안 배양합니다. 참고: 25개 미만의 샘플을 사용하는 경우 이 단계의 모든 볼륨을 두 배로 늘립니다.</li>
		<li>각 샘플의 10μL를 동일한 저결합 튜브에 추가하여 모든 샘플을 함께 모읍니다. 480 μL를 다음 단계로 이동합니다.</li>
		<li>PCR 정제를 위한 비드 기반 시약 192μL를 풀에 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>튜브를 자석 스탠드에 놓고 상층액이 맑아지고 비드 펠릿이 형성될 때까지 기다립니다. 상층액을 제거합니다. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거합니다.</li>
		<li>700 μL의 짧은 단편 완충액(SFB)을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 펠릿이 형성되고 액체가 맑아질 때까지 기다립니다(~5분). 상층액을 피펫으로 꺼내 버리십시오.</li>
		<li>이전 단계를 반복합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 그대로 두십시오. 비드를 건드리지 않고 100μL의 80% 에탄올을 추가합니다. 에탄올을 피펫으로 꺼내고 비드를 30초 동안 건조시킵니다. 알림: 비드가 과도하게 건조되지 않도록 하십시오.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 35μL의 PCR 등급 물을 추가합니다. 피펫팅으로 혼합하고 실온에서 2분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드가 펠릿이 되고 액체가 제거되도록 합니다. 상층액 35μL를 새 튜브에 피펫팅합니다.</li>
		<li>통합 라이브러리의 RNA 농도를 측정합니다. 30-50ng의 RNA 양에 도달하는 데 필요한 부피를 피펫팅하고 최종 부피 30μL에 도달하기 위해 PCR 등급의 물로 채웁니다.</li>
		<li>어댑터 결찰 반응 혼합물을 준비합니다: 통합 라이브러리 30μL, 어댑터 믹스 II 5μL, 결찰 반응 완충액 10μL(5x) 및 T4 DNA 리가아제 5μL. 피펫팅과 스핀다운(15-30초 동안 1,000 x g )으로 혼합합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>PCR 정제를 위해 비드 기반 시약 20μL를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 실온에서 10분간 배양합니다.</li>
		<li>튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드 펠릿이 형성되고 상층액이 무색이 될 때까지 기다립니다. 조심스럽게 피펫팅하여 상층액을 버립니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 제거하고 125μL의 SFB를 추가합니다. 피펫팅으로 혼합하고 마그네틱 스탠드에 다시 올려 비드를 분리합니다. 액체가 맑아지면 피펫팅하고 상층액을 버립니다.</li>
		<li>이전 단계를 반복합니다. 남은 액체가 증발할 때까지 마그네틱 스탠드에서 튜브를 30초 동안 열어 둡니다.</li>
		<li>마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 용출 완충액 15μL를 추가합니다. 피펫팅과 짧은 스핀다운(15-30초 동안 1,000 x g )으로 잘 섞습니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다. 마그네틱 스탠드에 2분 동안 놓습니다.</li>
		<li>상층액 15μL를 새로운 저결합 튜브에 피펫팅합니다. 이것이 최종 라이브러리입니다. 형광 DNA 정량 분석 키트로 농도를 측정합니다. 참고: 다음 단계에서는 12μL가 필요합니다. 농도가 매우 높고 라이브러리의 12μL 미만이 필요한 경우 용출 완충 시약으로 최대 12μL를 채웁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플로우 셀 로딩 및 염기서열분석<ol><li>플로우 셀(Flow cell)(R9.4.1)을 실시간 DNA 및 RNA 염기서열분석 장치에 삽입합니다.</li>
		<li>플러시 버퍼(FB) 시약 튜브에 30μL의 플러시 테더(FLT) 시약을 추가하여 프라이밍 혼합물을 준비합니다. 소용돌이를 혼합하고 회전합니다(15-30초 동안 1,000 x g ).</li>
		<li>프라이밍 포트 커버를 엽니다. 1,000 μL 피펫을 사용하여 200 μL로 설정하고 팁을 프라이밍 포트에 삽입합니다. 볼륨 설정 휠을 돌려 팁의 액체가 보일 때까지 볼륨을 높입니다. 팁을 버리십시오. 알림: 팁에 몇 μL의 액체가 보일 때까지만 휠을 돌리십시오. 더 많은 양을 당기면 플로우 셀이 손상될 수 있습니다.</li>
		<li>800μL의 프라이밍 혼합물을 프라이밍 포트에 천천히 추가하되 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 5분 동안 기다립니다.</li>
		<li>그 동안 로드할 라이브러리를 준비합니다. 염기서열분석 완충액 37.5μL, 로딩 완충액 25.5μL, 라이브러리 12μL를 혼합합니다. 알림: 피펫팅하기 전에 로딩 버퍼를 혼합하십시오. 이 시약의 비드는 매우 빠르게 침전됩니다.</li>
		<li>포트 커버를 엽니다. 프라이밍 혼합물 200μL를 프라이밍 포트에 피펫팅합니다. 알림: 커버 포트가 열린 상태에서 프라이밍 포트에 피펫팅하는 동안 샘플 포트에서 작은 방울이 나오는 것을 볼 수 있습니다. 피펫은 샘플 포트가 방울을 쏟지 않고 끌어당길 수 있도록 충분히 천천히 합니다.</li>
		<li>준비된 라이브러리를 로드하기 전에 피펫팅으로 잘 혼합하십시오. 75 μL로 설정된 100 μL 피펫을 사용하여 라이브러리와 피펫을 샘플 포트에 한 방울씩 넣습니다. 액체가 넘치지 않도록 포트를 만지지 말고 다음 방울을 넣기 전에 각 방울이 포트에 흡수될 때까지 기다리십시오.</li>
		<li>덮개 포트와 프라이밍 포트를 닫습니다. 소프트웨어를 열고 염기서열분석 실험을 시작합니다. 베이스콜 링 켜기를 선택합니다. 96개의 멀티플렉스 샘플이 있는 라이브러리의 경우 일반적으로 10-12시간의 염기서열분석으로 충분한 데이터를 생성할 수 있습니다. 알림: 소프트웨어를 사용하여 샘플 시트를 .csv 형식으로 삽입할 수 있습니다. 샘플 시트에는 flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code 및 키트 데이터가 필요합니다. 플로우 셀 ID(플로우 셀 측면에 나열됨)가 사용된 키트와 함께 필요합니다. 제안된 프로토콜의 경우 LSK109 키트를 선택해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>염기서열분석 데이터 분석<ol><li>압축된 fastq 판독값을 wf-artic 워크플로우41에 삽입합니다. 두 개의 서로 다른 프라이머 체계(ARTIC/V4.1 및 NEB-VarSkip/v1a)를 사용하여 워크플로우를 별도로 실행합니다. 두 ". primertrimmed.rg.sorted.bam" 파일이 각 샘플에 대해 생성됩니다.</li>
		<li>"samtools merge" 명령42를 사용하여 BAM 파일을 단일 파일로 병합합니다. 병합된 BAM 파일을 기본 설정을 그대로 두고 Freyja 도구에 삽입하여 상대적 계보 풍부도43을 복구합니다.</li>
		<li>FASTA 파일을 만들려면 병합된 BAM 파일을 기본 설정44,45를 사용하여 "samtools mpileup" 및 "ivar" 도구에 삽입합니다. 돌연변이 호출의 경우 FASTA 파일을 Nextclade 도구46,47에 로드합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 경제적 이익 또는 기타 이해 상충이 없습니다.

(RT-)qPCR 방법을 사용한 미생물 및 바이러스 검출 및 정량화는 뛰어난 감도로 인해 널리 수용되고 있습니다. 그러나 이러한 기술은 환경 샘플을 분석할 때 많은 어려움에 직면합니다. 폐수 샘플에는 측정을 왜곡하고 오해의 소지가 있는 결과를 생성할 수 있는 억제 물질이 많이 포함되어 있습니다. 이러한 한계를 극복하고 정밀도를 높이기 위해 복잡한 프로토콜이 고안, 설계 및 구현되었습니다. 이 프로토콜은 과학 문헌의 프로토콜을 결합하고 공정의 각 단계에서 일련의 엄격한 제어를 통합하여 qPCR 방법에 내재된 제한 사항을 구체적으로 해결함으로써 맞춤화되었습니다. 이러한 엄격한 품질 관리 조치를 통합함으로써 이 프로토콜은 복잡한 환경 시료51,52에서 qPCR 기반 검출 및 정량화 방법이 직면한 문제에 대한 강력한 솔루션을 제공합니다. 분리의 음성 제어(NCI) 및 비템플릿 제어(NTC)는 RNA 추출 및 RT-qPCR 반응 중 ...

2019년 12월, 이전에 알려지지 않은 코로나바이러스인 SARS-CoV-21에 의해 발생하는 COVID-19라는 새로운 질병이 등장했습니다. 그로 인한 글로벌 팬데믹은 많은 사람들이 지역 사회에서 바이러스 전파 및 확산을 정확하게 평가하기 위해 검사를 필요로 하기 때문에 전 세계 임상 및 공중 보건 실험실에 상당한 도전을 제시했습니다. 그러나 많은 지역에서 적시에 공간적으로 포괄적인 방식으로 필요한 수준의 테스트를 달성하는 것은 경제적으로 실현 불가능하다 2,3. 개별 임상 진단을 기반으로 하는 현재의 감시 시스템은 증상의 심각도와 개별 보고뿐만 아니라 이러한 증상이 인구 4,5,6,7,8,9,10에서 유행하는 기존 질병과 겹치는 정도에 크게 의존합니다. 결과적으로, 무증상 사례의 수가 많다는 것은 질병 부담에 대한 현저한 과소평가에 기여한다 7,11.
이러한 문제로 인해 COVID-19 감시를 위한 폐수 기반 역학(WBE)이 보완적인 감시 전략으로 제안되었습니다. WBE는 2001년에 처음 기술되었으며12 처음에는 코카인 및 기타 불법 약물을 추적하는 데 사용되었다13. 이 접근법은 폐수에서 안정하고 인간에 의해 배설되는 모든 물질의 초기 농도를 계산할 수 있다는 가정에 의존합니다 8,12. WBE는 SARS-CoV-2 3,8,14,15,16에 대한 보완적이고 효율적인 감시 시스템으로 많은 국가에서 성공적으로 구현되었습니다. 수생 환경에서 인간 바이러스를 검출하는 대부분의 방법은 농축, 핵산 추출, 선택한 게놈 세그먼트(또는 세그먼트)의 증폭, 증폭된 게놈 세그먼트의 검출/정량화 단계를 따릅니다3.
SARS-CoV-2의 검출 및 정량을 위한 또 다른 중요한 환경은 공기 샘플입니다. 초기에 SARS-CoV-2는 주로 감염된 사람이 말하거나, 재채기하거나, 기침하거나, 노래하거나, 숨을 쉴 때 발생하는 에어로졸의 호흡기 비말과의 밀접한 개인 접촉을 통해 전염되는 것으로 생각되었다17. 그러나 여러 연구에서 공기 중, 특히 의료 시설 및 기타 밀폐된 공간에서 SARS-CoV-2 RNA의 존재를 보고하기 시작했습니다 18,19,20,21. SARS-CoV-2의 생존력에 대한 증거는 바이러스 농도가 충분히 높았을 때 병원 및 기타 밀폐된 공간의 실내에서 채취한 공기 샘플에서 발견되었습니다22,23,2 4. 실외 연구에서는 일반적으로 붐비는 실외 공간을 제외하고는 SARS-CoV-2의 증거가 발견되지 않았다 21,25,26,27,28,29. 현재 SARS-CoV-2의 공기 중 전파는 전파 방식으로 인식되고있다 30,31. 최근 문헌고찰 연구에 따르면 밀집된 지역 밖에서 공기 중 전염 위험이 최소화되는 실외와 강력한 감염원(예: 감염자 수)이 존재할 수 있는 환기가 잘 되지 않는 환경에서 더 큰 위험이 나타날 수 있는 실내 간의 차이를 보여줍니다. 최근의 종합 문헌고찰 연구에서는 실외 환경과 실내 환경, 특히 환기가 잘 되지 않는 밀집된 장소에서 공기 중 전염 위험 간에 상당한 차이가 있음을 강조했습니다. 이 연구는 바이러스 입자의 희석 및 분산을 위해 더 많은 양의 공기가 존재하는 실외 환경에서 공기 중 전염의 위험이 최소화됨을 나타낸다(32). 이러한 결과는 COVID-19와 관련된 공중 보건 정책 및 지침에 중요한 영향을 미칩니다. 정책 입안자는 실내와 실외 환경 간의 전염 위험의 상당한 차이를 인식함으로써 바이러스 확산을 완화하고 공중 보건을 보호하기 위한 보다 효과적인 전략을 개발할 수 있습니다.
다양한 환경 샘플에서 SARS-CoV-2의 검출, 정량화 및 염기서열 분석을 위한 다양한 방법과 프로토콜이 있습니다. 이 방법 기사는 다양한 용량 수준을 가진 실험실이 폐수 및 공기 샘플에서 바이러스의 환경 검출, 정량화 및 시퀀싱을 수행할 수 있도록 하는 잘 확립된 프로토콜의 조합을 제시하는 것을 목표로 합니다.

<table><tbody><tr><td>어댑터+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19</td><td>옥스포드 나노포어</td><td>EXP-AMII001</td><td>염기서열분석</td></tr><tr><td>AllPrep PowerViral DNA/RNA 키트</td><td>Qiagen</td><td>28000-50</td><td>RNA 추출 키트</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>PCR 정제, NGS 클린업, PCR 클린업</td></tr><tr><td>ARTIC SARS-CoV-2 앰플리콘 패널</td><td>IDT</td><td>10011442</td><td>SARS-CoV-2 게놈 증폭</td></tr><tr><td>Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0367S</td><td>라이브러리 준비</td></tr><tr><td>CENTRICON PLUS&shy; 70 10KDA.</td><td>Fisher Scientific</td><td>10296062</td><td>집중 필터</td></tr><tr><td>CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER</td><td>Bertin Technologies</td><td>083-DU001</td><td>공기 샘플러</td></tr><tr><td>Duran&nbsp; 실험실 병</td><td>Merck</td><td>Z305200-10EA</td><td>샘플링 병</td></tr><tr><td>플로우 셀 (R9.4.1)</td><td>Oxford Nanopore</td><td>FLO-MIN106D</td><td>시퀀싱</td></tr><tr><td>일반 labarotory 소모품 (튜브, qPCR 플레이트 등)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>결찰 시퀀싱 키트</td><td>Oxford Nanopore</td><td>SQK-LSK109</td><td>시퀀싱</td></tr><tr><td>LunaScript&nbsp; RT SuperMix 키트</td><td>NEB</td><td>E3010</td><td>&nbsp; cDNA 합성</td></tr><tr><td>Mengovirus 추출 제어 키트</td><td>Biom&eacute; rieux</td><td>KMG</td><td>농도 제어</td></tr><tr><td>Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes</td><td>Thermofisher</td><td>5011-0012</td><td>Sample storage</td></tr><tr><td>Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free</td><td>Oxford Nanopore</td><td>EXP-NBD104</td><td>바코드</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module</td><td>NEB</td><td>E7595</td><td>DNA repair</td></tr><tr><td>NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes</td><td>NEB</td><td>E7658</td><td>SARS-CoV-2 게놈 증폭</td></tr><tr><td>NEBNext&nbsp; 빠른 결찰 반응 버퍼</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td>시퀀싱&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Merck</td><td>P4474</td><td>수집 완충액</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS, 1X), 멸균 여과</td><td>Thermofisher</td><td>J61196. 공기</td><td>샘플의 AP 용출</td></tr><tr><td>Q5&nbsp; 핫스타트 하이파이도 2X 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>M0494S</td><td>핫스타트 DNA 중합효소</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS 어세이 키트</td><td>Thermofisher</td><td>Q32852</td><td>RNA 정량</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 RUO qPCR 프라이머 및 프로브 키트,</td><td>IDT</td><td>10006713</td><td>프라이머-프로브 믹스 및 qPCR 양성 대조군</td></tr><tr><td>TaqPath 1-Step RT-qPCR 마스터 믹스</td><td>Thermofisher</td><td>A15299</td><td>RT-qPCR 키트</td></tr></tbody></table>

폐수 및 공기 샘플에서 sars-cov-2 rna의 정량화 및 전체 게놈 특성 분석

Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples

폐수 기반 역학은 많은 국가에서 SARS-CoV-2 및 기타 전염병에 대한 유망하고 효과적인 감시 시스템으로 부상했습니다. 이 공정에는 일반적으로 폐수 농축, 핵산 추출, 선택된 게놈 세그먼트의 증폭, 증폭된 게놈 세그먼트의 검출 및 정량화가 포함됩니다. 이 방법론은 공기 샘플에서 SARS-CoV-2와 같은 감염원을 검출하고 정량화하는 데에도 유사하게 활용될 수 있습니다. 초기에 SARS-CoV-2는 주로 감염된 개인이 말, 재채기, 기침, 노래 부르기 또는 숨을 쉴 때 생성된 비말과의 밀접한 개인 접촉을 통해 확산되는 것으로 추정되었습니다. 그러나 점점 더 많은 연구에서 의료 시설의 공기 중에 SARS-CoV-2 RNA가 존재한다고 보고하여 공기 중 전파가 바이러스의 실행 가능한 경로임을 입증했습니다. 이 연구는 폐수 및 공기 샘플에서 바이러스의 환경 검출, 정량화 및 염기서열 분석을 용이하게 하기 위해 확립된 프로토콜의 복합체를 제시합니다.

표 3에 요약된 결과는 이 기사에 설명된 방법을 사용하여 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하고 정량화한 예를 보여줍니다. 폐수 샘플은 스페인과 슬로베니아의 폐수 처리장에서 수집되었으며 3번의 반복실험 중 최소 2번에서 Ct가 40 미만이면 양성으로 간주되었으며 Ct의 변동이 5% 미만인 경우 정량화가 유효한 것으로 간주되었습니다. 스페인과 포르투갈에서는 실내 및 실외 공기 샘플을 수집하여 동일한 규칙을 적용했습니다. 연구의 목적이 SARS-CoV-2 RNA를 검출하는 것이지 정량화하는 것이 아니었기 때문에 폐수 샘플의 경우 삼중이 아닌 공기 샘플에 대해 복제본이 사용되었습니다. 또한, RT-qPCR 실행은 사용된 모든 대조군(이 프로토콜에 설명된 대로)이 예상대로 작동하고 mengovirus RNA 대조군에서 유의한 편차가 관찰되지 않은 경우에만 유효한 것으로 간주되었습니다. 이 샘플의 경우 멩고바이러스 회수 효율은 13.7%에서 19.7% 사이였습니다. 억제는 10배 및 1...

이 프로토콜은 폐수 기반 역학 연구에 사용할 폐수 및 공기 샘플의 SARS-CoV-2 RNA를 정량화하고 실내 및 실외 에어로졸에서 SARS-CoV-2에 대한 노출 위험을 평가하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 또한 SARS-CoV-2 전체 게놈 특성 분석을 위한 타일형 앰플리콘 긴 템플릿 염기서열 분석 접근법을 설명합니다.

폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 정량화 및 전체 게놈 특성 분석

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. ...

폐수 기반 역학은 현재 폐수 샘플에서 바이러스 RNA를 검출하고 잠재적인 발병을 식별하여 전 세계적으로 COVID-19 통제 전략을 보완하는 데 사용됩니다. 이 기술은 무증상 사례를 포함하여 지역 사회의 COVID-19 확산에 대한 인구 전체 스냅샷을 제공합니다. 공기 샘플링도 이 프로토콜에 중요한 추가 기능입니다.임상 진단은 여전히 질병 발생 및 전염병을 관리하는 가장 정확한 방법입니다. 그러나 이 기술은 여전히 이를 보완하는 데 유용합니다. 이 방법에는 많은 단계와 임계점이 있습니다.분자 생물학에 익숙하지 않은 실험실에서 절차를 복제할 수 있으므로 시각적 시연이 필수적입니다. 시작하려면 24시간 복합 폐수 샘플 1리터를 수집합니다. 20마이크로리터의 멩고바이러스를 70밀리리터의 샘플에 넣습니다.샘플을 700G에서 10분 동안 원심분리한 후 원심분리에 의해 10킬로달톤이 차단된 원심 한외여과 장치를 사용하여 생성된 상층액을 농축합니다. 700G에서 40분 동안 원심분리하고 한외여과 장치의 위치를 반전시켜 농축액을 용리합니다. 생성된 농축액을 RNA 추출에 사용합니다.공기 샘플을 수집하려면 수집을 시작하기 전에 공기 샘플러에 멸균 콘을 놓습니다. 샘플링이 끝나면 상용 바이러스 RNA 추출 키트 또는 사내 방법을 사용하여 원뿔의 세척된 PBS에서 RNA를 추출합니다. 각 표적, 멩고바이러스, SARS-CoV-2, N1 및 N2 유전자에 대한 반응 마스터 믹스를 시약 설정실의 깨끗한 후드에서 준비합니다.프라이머-프로브 혼합물과 효소를 5회 반전 또는 펄스 와류로 혼합합니다. 마이크로 원심분리기 튜브를 콜드 랙에 보관하고 15마이크로리터의 혼합물을 스트립 PCR 튜브 또는 냉각 랙에 놓인 96웰 PCR 플레이트에 분주합니다. 플레이트를 덮고 핵산 취급 구역으로 옮깁니다.추출된 RNA의 부분 표본을 5초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다. 반응 혼합물에 RNA 5 마이크로 리터를 피펫하여 25 마이크로 리터를 만들고 RT-qPCR을 시작합니다. PCR 플레이트에서 각 샘플의 16 마이크로리터를 플레이트의 해당 위치에 피펫팅하고 5회 역전사 또는 RT 마스터 믹스 4마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 PCR 반응을 시작합니다. 다음으로, 각 프라이머 세트의 10 마이크로몰 희석액과 각 프라이머 세트에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 새 PCR 플레이트에서 마스터 혼합물 20 마이크로리터를 피펫팅한 다음 각 혼합물에 5 마이크로리터의 RT 샘플을 피펫팅합니다.플레이트를 덮은 후 PCR 반응을 시작합니다. PCR이 끝나면 1000G에서 15-30초 동안 플레이트를 회전시킵니다. PCR 정제를 위해 각 웰에 50마이크로리터의 비드 기반 시약을 추가하고 피펫팅으로 혼합하여 자기 분리를 진행합니다.마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 각 펠릿을 15 마이크로 리터의 PCR 등급 물로 재현탁시키고 플레이트를 실온에서 2 분 동안 배양합니다. 접시를 자석 스탠드에 다시 놓고 2분 동안 구슬이 펠릿되도록 합니다.그런 다음 각 샘플에서 15마이크로리터의 상층액을 새 PCR 플레이트로 조심스럽게 피펫팅합니다. 다음으로, 라이브러리 준비를 위해 DNA 라이브러리 준비 키트에서 1.75 마이크로리터의 반응 완충액과 0.75 마이크로리터의 효소 혼합물을 각 샘플에 추가합니다. 덮인 플레이트를 잠시 소용돌이치고 1000G에서 15-30초 동안 회전합니다.섭씨 21도에서 5분, 섭씨 65도에서 5분간 배양합니다. 각 샘플에 대해 3마이크로리터의 PCR 등급 물을 새 PCR 플레이트에 피펫팅합니다. 염기서열분석 라이브러리 준비를 위해 준비된 샘플 0.75마이크로리터와 바코드 1.25마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 5 마이크로리터의 T4 DNA 리가아제 마스터 믹스를 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다. 원심 분리기에서 플레이트를 회전시킨 후 플레이트를 섭씨 21도에서 20분, 섭씨 65도에서 10분 동안 배양합니다. 모든 샘플을 풀링한 후 PCR 정제를 위해 192마이크로리터의 비드 기반 시약을 풀에 추가합니다.피펫팅으로 잘 섞고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 자석 스탠드에 놓습니다. 상층액이 맑아지고 비드 펠릿이 형성될 때까지 기다립니다.마그네틱 스탠드에서 상층액과 튜브를 제거합니다. 700 마이크로리터의 짧은 단편 완충액 또는 SFB를 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 펠릿이 형성되고 액체가 맑아질 때까지 기다립니다.피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 35 마이크로리터의 PCR 등급 물을 튜브에 넣고 피펫팅으로 혼합한 후 실온에서 2분 동안 배양합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드가 펠릿이 되고 액체가 맑아지도록 합니다.상층액 35 마이크로 리터를 새 튜브에 피펫팅합니다. 다음으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 어댑터 결찰 반응 혼합물을 준비하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. PCR 정제를 위해 비드 기반 시약 20마이크로리터를 결찰 반응 혼합물에 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드 펠릿이 형성되고 상층액이 무색이 될 때까지 기다립니다. 피펫팅을 통해 상층액을 조심스럽게 폐기합니다. 125마이크로리터의 SFB를 튜브에 혼합하고 마그네틱 스탠드에 다시 올려 비드를 분리합니다.액체가 맑아지면 상층액을 버리고 앞에서 설명한 대로 SFB 추가를 반복합니다. 마그네틱 스탠드의 튜브를 30초 동안 열어 둡니다. 용출 완충액 15마이크로리터를 넣고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.잠깐 회전하여 실온에서 5분 동안 배양한 후 마그네틱 스탠드에 2분 동안 올려 놓습니다. 형광 DNA 정량 분석 키트로 농도를 측정하기 위해 15 마이크로리터의 상층액을 새로운 저결합 튜브에 피펫팅합니다. 그런 다음 플로우 셀을 Real-Time DNA 및 RNA 염기서열분석 장치에 삽입합니다.1, 000 마이크로리터로 설정된 피펫의 팁을 200 마이크로리터의 프라이밍 포트에 삽입합니다. 볼륨 설정 휠을 돌려 팁에 액체가 보일 때까지 볼륨을 높인 다음 팁을 버리십시오. 800 마이크로리터의 프라이밍 혼합물을 기포 없이 프라이밍 포트에 넣고 5분 동안 기다립니다.라이브러리 200 마이크로리터의 피펫을 프라이밍 포트에 혼합합니다. 덮개 포트와 프라이밍 포트를 닫습니다. 소프트웨어에서 염기서열분석 실험을 시작하고 Base Calling On을 선택합니다.이 방법은 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하고 정량화했습니다.폐수 샘플은 3 개의 유전자 중 1.91 %에서 13.98 %의 표준 편차를 가지며 3.05 x 10에서 3에서 2.83 x 10에서 리터 당 8 개의 유전자 사본 범위였습니다. 공기 샘플은 6.17 x 10 내지 3 내지 5.48 x 10 내지 9 범위였으며, 중복의 표준 편차는 0.54%와 10.95% 사이였으며, 이 프로토콜에 기술된 바와 같이, 샘플들은 시퀀싱되었고, 3개의 서열화된 샘플 결과의 예가 여기에 요약되어 있다. 세 가지 샘플 모두에서 BA.5 계통.x는 Freyja 도구에서 가장 널리 사용되는 것으로 할당되었습니다. 폐수 샘플의 농도는 바이러스 RNA가 폐수에 낮은 농도로 존재하기 때문에 중요한 단계입니다. 따라서 이 단계는 정확한 검출 및 정량화를 위한 기본입니다.이 절차는 다른 감염원을 검출하고 정량화하는 데 사용되는 RT-qPCR 프로토콜의 다양한 프라이머를 사용하여 조정할 수 있습니다. 이 기술은 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2를 정확하게 정량화했습니다. 서로 다른 위치에서 다양한 병원체를 검출하고 정량화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

여기서, 우리는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RNA를 시각화하기 위하여 정시 혼성화 (RNA-FISH)와 면역형광에 있는 RNA 형광을 결합하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA 숙주 상호 작용의 분자 특성에 대한 이해를 증가시킬 수 있다.

시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화

이 작업은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 다양한 분석법을 개발하는 단계를 요약합니다. 단계는 정교하며 분석 및 실험 성능을 개선하는 방법에 대한 메모가 포함되어 있습니다. 이러한 분석은 여러 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

시민 과학 프로젝트는 SARS-CoV-2에 대한 환경 샘플을 수집하기 위해 샌디에고 주민을 모집하도록 설계되었습니다. 다국어 웹 기반 플랫폼은 사용자 친화적인 모바일 장치 인터페이스를 사용하여 데이터 제출을 위해 만들어졌습니다. 실험실 정보 관리 시스템은 실시간 결과 추적을 통해 지리적으로 다양한 수천 개의 샘플을 수집할 수 있도록 했습니다.

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

이 프로토콜은 오픈 소스 자동화를 활용하여 타액 샘플의 RT-qPCR 분자 테스트를 수행하는 SARS-CoV-2 진단 방법을 설명합니다. 이 확장 가능한 접근 방식은 임상 공중 보건 감시뿐만 아니라 소규모 대학 실험실의 용량을 늘리는 데 적용될 수 있습니다.

오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 농도는 주로 바이러스의 식별 및 정량화를 위해 수행되는 어려운 작업입니다. 여러 바이러스 농축 방법이 개발되고 테스트되었지만, 여기서는 다양한 샘플 유형을 가진 RNA 바이러스에 대한 한외여과 및 탈지유 응집의 효과를 입증합니다.

탈지유 응집 및 한외여과를 사용한 환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 입자 농도

여기에서는 나노포어 기술을 사용하여 광견병 바이러스(RABV) 게놈을 특성화하기 위한 빠르고 비용 효율적인 워크플로우를 제시합니다. 이 워크플로우는 지역 수준에서 유전체학 정보 감시를 지원하기 위한 것으로, 광견병 통제 조치를 안내하기 위해 순환하는 RABV 계통 및 지역 계통 발생 내 배치에 대한 정보를 제공합니다.

나노포어 기술을 사용한 광견병 바이러스의 신속한 특성 분석을 위한 전체 게놈 염기서열 분석

여기에서는 RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)를 통해 인간 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 방법을 표준화하고 구현하기 위한 완전한 프로토콜을 제공합니다. 60분 이내에 완료되는 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 모든 실험실이나 현장 진료에 적용할 수 있습니다.

역전사 루프 매개 등온 증폭을 통한 SARS-CoV-2 바이러스 검출

일반적인 호흡기 바이러스에 대한 두 가지 프로브 기반 원스텝 RT-qPCR 키트를 소개합니다. 첫 번째 분석은 SARS-CoV-2(N), 인플루엔자 A(H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B에 대한 것입니다. 두 번째는 SARS-Cov-2(N)와 메르스(UPE 및 ORF1a)에 대한 것입니다. 이러한 분석은 모든 전문 실험실에서 성공적으로 구현할 수 있습니다.

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 검출을 위한 다중 Real-Time RT-qPCR 분석 개발

공기 샘플링 필터에서 대기 중 생물학적 입자에 대한 두 가지 상호 보완적인 분석, 즉 내독소 및 DNA의 추출 및 검출에 대해 설명합니다.

독소와 DNA 내용에 대한 공기 샘플링 필터 분석

학습하세요 폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA 정량화와 전체 게놈 특성 분석 방법을. 타일드 앰플리콘 장서열 템플릿 시퀀싱을 활용한 이 기술은 하수 역학 연구와 공중보건 모니터링에 필수적인 도구입니다.

폐수 및 공기 샘플에서 SARS-CoV-2 RNA의 정량화 및 전체 게놈 특성 분석

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