Name: 탈지유 응집 및 한외여과를 사용한 환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 입자 농도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 배우세요 환경 용수 및 폐수 샘플에서 RNA 바이러스를 농축하는 탈지유 응집 방법을 사용하여. 이 비용 효율적인 기술은 한외여과와 동등한 효율성으로 바이러스 역학 연구와 수질 평가에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 NSERC Alliance Covid-19 Grant(수상 번호 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan 및 Uyaguari-Díaz). MUD는 대학 연구 보조금 프로그램 (수상 번호 325201)에 감사드립니다. JF와 JZA는 모두 VADA(Visual and Automated Disease Analytics) 대학원 교육 프로그램의 지원을 받습니다. KY와 JF는 모두 Mitacs Accelerate 프로그램에서 펠로우십을 받았습니다. MUD와 그의 실험실 구성원(KY, JF, JZA)은 NSERC-DG(RGPIN-2022-04508) 및 Research Manitoba New Investigator Operating Grant(No 5385)의 지원을 받습니다. 매니토바 주 위니펙 시에 특별한 감사를 드립니다. 이 연구는 매니토바 대학교에서 수행되었습니다. 우리는 매니토바 대학교 캠퍼스가 Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota 및 Dene 민족의 원래 땅과 Métis Nation의 고향에 위치하고 있음을 인정하고 싶습니다.

1. 폐수 샘플에서 바이러스를 농축하기 위한 연속 한외여과 및 탈지유 응집의 비교
<ol><li>시료 전처리<ol><li>2L의 24시간 유량 비례 복합 원료(유입수) 폐수 샘플을 수집합니다. 샘플은 2020년 여름과 가을에 캐나다 위니펙에 있는 3개의 주요 폐수 처리장(WWTP)에서 수집되었습니다(표 1).</li>
		<li>샘플을 아이스박스에 담아 차광병에 담아 실험실로 운반하고 24시간 이내에 처리합니다. 폐수 물리화학적, 생물학적 특성 데이터를 수집합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>바이러스 농도 분석 참고: Armored RNA를 테스트 바이러스로 사용하여 각 방법의 총 회수 효율을 평가하기 위해 순차적 한외여과법과 유기응집법, 즉 탈지유 응집법(SMF)을 적용했습니다23. 다른 연구자들은 또한 패밀리와 같은 외피 바이러스에 대한 농축 방법의 회복을 평가하기 위해 Armored RNA를 대조 바이러스로 사용했습니다 Coronaviridae22,24,25,26.<ol><li>Armored RNA를 추가하려면 한외여과 및 SMF 방법에 대한 폐수 테스트 용량을 각각 140mL 및 500mL로 설정합니다. 피펫터를 사용하여 각 한외여과 방법에 대해 한 날짜에 수집된 6개의 신선한 폐수 샘플과 다른 날짜에 수집된 6개의 신선한 폐수 샘플에 Armored RNA의 5 x 104개 사본을 스파이크합니다. 또한, 스파이크 6은 세 번째, 이후 날짜에 수집된 (4°C에서) 폐수 샘플을 저장하고, SMF를 위해 며칠 후에 처리하였다. 참고: 서로 다른 날짜에 수집된 6개의 샘플 세트 각각은 3개의 WWTP 각각에서 2개의 샘플로 구성되었습니다. 본 연구에서는 2020 년 7 월 8 일에 첫 번째 신선한 폐수 샘플을 수집하고, 2020 년 9 월 30 일에 두 번째 폐수 샘플을 수집했으며, 2020 년 10 월 14 일에 SMF를 위해 저장할 폐수 샘플을 수집했습니다.</li>
		<li>4°C에서 30분 동안 교반하여 자기 교반기를 사용하여 샘플에 Armored RNA를 접종하고 균질화합니다.</li>
		<li>0.2μm보다 큰 모든 입자 또는 세포를 제거하고 한외여과를 수행합니다.<ol><li>스파이크 폐수 샘플(각 140mL 스파이크 샘플에서 120mL)을 각각 무명천 및 저단백질 결합, 0.45μm 및 0.2μm, 47mm 멤브레인 디스크 필터를 통해 여과하여 큰 입자, 퇴적물, 진핵생물 및 박테리아27. 후술하는 한외여과 방법을 사용하여 여과된 샘플을 처리한다. 참고: 7월 8일과 9월 30일에 수집된 폐수 샘플은 각각 3,000 x g 및 7,500 x g의 한외여과 방법에 사용되었습니다.</li>
			<li>3,000 x g (UF-3k x g)에서 순차적 한외 여과의 경우, 브랜드 A 원심 분리 장치, 30-kDa를 사용하여 샘플 60 mL를 약 5 mL에 두 번 로딩 하여 3,000 x g에서 30 분 동안 첫 번째 날짜에 수집 된 총 120 mL의 테스트 샘플을 농축합니다. 그런 다음 브랜드 B 원심 장치 30kDa를 사용하여 30분 동안 3,000 x g에서 5mL 부피를 500-1,200μL로 농축합니다.</li>
			<li>7,500 x g (UF-7.5k x g)에서 순차적 한외여과의 경우, 제조사의 권장 사항에 따라 브랜드 B 원심분리 장치의 원심분리 속도를 3,000 x g에서 7,500 x g로 변경하여 더 작은 최종 부피를 얻고, 브랜드 A 원심분리 장치의 원심분리 속도를 동일하게 유지합니다. 참고 : 테스트는 9 월 30일에 수집 된 샘플로 실행되었습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>SMF의 경우 아래에 설명된 단계를 수행합니다.</li>
		<li>폐수 샘플(각각 500mL)을 스파이크하여 아래에 설명된 대로 무명천 및 저단백질 결합 멤브레인 디스크 필터로 사전 여과하지 않고 SMF 프로토콜16,18을 사용하여 직접 농축합니다.</li>
		<li>탈지분유 0.5g을 합성 해수 50mL에 녹여 1%(w/v) 탈지유 용액을 얻고 1N HCl을 사용하여 용액의 pH를 3.5로 조심스럽게 조정합니다. 알림: 산성화는 등전점(16 )의 변화로 인해 바이러스가 응집되고 물 밖으로 침전되고 분유(28)의 용해도를 향상시킵니다.</li>
		<li>5mL의 탈지유 용액을 500mL의 원료 폐수 샘플에 추가하여 0.01%(w/v)의 탈지유의 최종 농도를 얻습니다.</li>
		<li>샘플을 중간 속도로 8시간 동안 저어주고 형성된 플록이 실온에서 8시간 동안 더 침전되도록 합니다.</li>
		<li>침전된 플록을 방해하지 않고 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 플록을 함유하는 50mL의 최종 부피를 원심분리 튜브로 옮기고 8°C에서 30분 동안 8,000 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>멸균된 주걱을 사용하여 펠릿을 조심스럽게 스크랩하고 상층액을 제거한 후 250μL의 0.2M 인산나트륨 완충액(pH 7.5)에 튜브에 남아 있는 펠릿을 다시 현탁합니다. 긁어내고 재현탁한 펠릿을 동일한 1.5mL 미니 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 및 β-메르캅토에탄올의 비율이 25:24:1인 RNA 추출 키트를 사용하여 폐수 샘플의 바이러스 농축액에서 바이러스 RNA 추출 및 회수 효율 분석을 수행하여 추출 효율을 향상시킵니다. 마지막으로 50μL의 용출 완충액에서 RNA를 용출합니다.</li>
	<li>실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석<ol><li>합성 단일 가닥 DNA 또는 gBlock 구조체의 10배 희석액(7.8 x 10,4 - 7.8 유전자 사본)을 사용하여 Armored RNA를 정량화합니다. Armored RNA를 검출하고 정량화하는 프라이머 및 프로브 세트에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.</li>
		<li>프라이머 설계 도구29 를 사용하여 프라이머 및 프로브 세트를 설계하고 Armored RNA 게놈 내의 95bp 영역(gBlock 구조)을 표적으로 합니다.</li>
		<li>각 RT-qPCR 실행에 대한 보정 곡선을 얻습니다. 각 qPCR 실행에 음성 대조군을 포함합니다. 표준, 샘플 및 템플릿이 아닌 컨트롤을 세 번 실행합니다.</li>
		<li>각 10μL RT-qPCR 혼합물을 다음 순서로 준비합니다: 2.5μL의 4x 마스터 믹스, 400nM의 각 프라이머, 200nM 프로브 및 2.5μL의 주형, 초순수 DNAse/RNAse가 없는 증류수.</li>
		<li>Real-Time PCR 시스템에서 50°C에서 5분 동안 열 순환 반응을 수행한 후 95°C에서 10초 동안, 60°C에서 30초 동안 45회 사이클을 수행합니다. CT가 <40이면 샘플 Armored RNA 양성을 고려하십시오.</li>
		<li>소혈청알부민을 하수검체와 함께 사용하여 qPCR 및 RT-qPCR 검사를 실시하여 휴믹산과 같은 억제제 또는 오염 물질의 가능성을 평가한다24. 효소가 있는 샘플과 없는 샘플 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>표준 곡선에서 농도를 계산합니다. 회수 효율 백분율을 계산하여 회수된 농도를 스파이크 농도로 나눕니다.</li>
	<li>분석을 위해 log10 함수를 사용하여 유전자 복제 수를 변환합니다. qPCR 데이터에 대한 통계 분석 도구를 사용하여 일반 선형 모델을 실행합니다. Tukey의 테스트를 적용하여 방법과 치료법 간의 차이를 감지합니다. p-값 0.05를 검정의 최소 유의 수준으로 간주합니다.</li>
</ol>2. 수성 역학을 위한 DNA 및 RNA 바이러스의 여과 및 농축
<ol><li>환경 지표수 수집을 위해 10L의 환경 지표수 샘플을 수집하고 배경 제어를 위해 10L의 탈이온수 샘플을 사용합니다. 모든 샘플을 4°C 실내에 보관하여 샘플 수집 후 24시간 이내에 처리할 때까지 처리합니다.</li>
	<li>아래 설명된 단계를 사용하여 SMF를 사용하여 환경 샘플에서 바이러스 농도를 수행합니다.<ol><li>고용량 지하수 샘플링 캡슐과 0.45 μm, 0.2 μm, 0.1 μm 크기의 멤브레인 디스크 필터를 사용하여 캡슐 및 진공 여과를 수행하여 미세 진핵생물 및 박테리아와 같은 더 큰 분획에서 바이러스와 같은 더 작은 분획에 이르기까지 메타게놈 염기서열 분석 중 노이즈를 최소화합니다.</li>
		<li>탈지유 13.2g과 함께 합성 해수 1.32L에 중량 1% 사전 응집 탈지유 용액을 준비합니다. 1N HCl을 사용하여 이 현탁액의 pH를 3.5로 조정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1N HCl을 사용하여 환경 지표수 샘플의 pH를 3.5로 조정합니다.</li>
	<li>사전 응집된 산성화된 탈지유 용액 100mL를 10L 산성화된(pH 3.5) 환경 용수 샘플(최종 탈지유 농도 0.01%[w/v])에 옮깁니다.</li>
	<li>마그네틱 교반기 및 마그네틱 교반 막대를 사용하여 실온에서 8시간 동안 샘플을 저어주고 플록이 추가로 8시간 동안 중력에 의해 침전되도록 합니다. 플록을 방해하지 않고 진공 펌프를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>50mL 원심분리기 튜브에서 나머지 플록을 무게에 따라 분취하고 균형을 맞추고 4°C에서 30분 동안 8,000 x g 로 회전시킵니다.</li>
	<li>상층액을 버리고 생성된 펠릿(이론적으로 관심 있는 바이러스 포함)을 200μL의 0.2M 인산나트륨 완충액에 용해시킵니다.</li>
	<li>용해된 펠릿을 제조업체의 지침에 따라 DNase I 및 RNase A로 처리하여 핵산 추출에 사용되는 키트로 인해 공동 침전될 수 있는 유리 DNA 및 RNA를 제거합니다. 제조업체의 지침에 따라 DNase I 및 RNase A를 비활성화합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 DNA/RNA 추출 키트를 사용하여 용해된 펠릿에서 총 핵산을 추출합니다.</li>
	<li>형광측정기를 사용하여 폐수 샘플에서 추출된 DNA와 RNA의 총량을 정량화합니다. 농도가 >1ng/μL인 샘플은 DNA 정량 분석 및 염기서열 분석에 최적인 것으로 간주됩니다.</li>
	<li>관심 장내 바이러스를 표적으로 하는 qPCR 분석과 바이러스 군집 구조를 식별하기 위한 고처리량 염기서열 분석을 수행합니다.</li>
</ol>3. 수성 역학을 위한 미생물 분획의 직접 침전 및 농도
<ol><li>보호되고 영향을 받는 수로에서 2L의 물 샘플을 수집합니다. 샘플에 상당한 양의 파편이 포함되어 있으면 무명천을 사용하여 제거하십시오. 참고: 샘플당 생물학적 복제본을 수집하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>합성 해수 1mL에 탈지분유 4.4g을 녹여 440%(w/v) 탈지유 용액을 준비합니다. 이 현탁액의 pH를 1N HCl로 3.5로 조정합니다.</li>
	<li>1N HCl을 사용하여 담수 샘플의 pH를 3.5로 조정합니다.</li>
	<li>이전에 pH가 조정된 2L 담수 샘플에 탈지유 용액 20mL를 추가합니다(최종 탈지유 농도 0.01%[w/v]). 샘플을 실온에서 8시간 동안 저어줍니다.</li>
	<li>플록이 중력에 의해 8시간 더 침전되도록 합니다. 연동 펌프로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 침전된 플록을 50mL 원심분리기 튜브로 옮기고 8,000 x g 에서 30분 동안 회전시킵니다.</li>
	<li>상청액을 버리고 펠릿을 200μL의 0.2M 인산나트륨 완충액으로 재현탁합니다. 샘플을 -20°C에서 보관하거나 제조업체의 지침에 따라 선택한 핵산 분리 키트를 사용하여 미생물 DNA 추출을 위해 ~0.5g의 플록을 선택합니다.</li>
	<li>고감도 형광측정기로 DNA 핵산 농도와 순도를 측정합니다. 농도가 >1ng/μL인 샘플은 DNA 정량 분석 및 염기서열 분석에 최적이어야 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wastewater-based+epidemiology+for+community+monitoring+of+SARS-CoV-2%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Environmental+Au%22%5BJournal%5D)">Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges.</a> ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).</li>
<li>Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+concentration-The+critical+step+in+implementing+the+wastewater+based+epidemiology+for+the+COVID-19+pandemic%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review.</a> The Science of The Total Environment. 747, 141245(2020).</li>
<li>Bi, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+household+transmission+of+SARS-CoV-2+from+a+population-based+serological+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey.</a> Nature Communications. 12, 3643(2021).</li>
<li>Day, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covid-19%3A+identifying+and+isolating+asymptomatic+people+helped+eliminate+virus+in+Italian+village%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village.</a> British Medical Journal. 368, 1165(2020).</li>
<li>Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19%3A+in+the+footsteps+of+Ernest+Shackleton%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton.</a> Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).</li>
<li>Bivins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wastewater-based+epidemiology%3A+global+collaborative+to+maximize+contributions+in+the+fight+against+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19.</a> Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).</li>
<li>Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+SARS-Coronavirus-2+RNA+in+sewage+and+correlation+with+reported+COVID-19+prevalence+in+the+early+stage+of+the+epidemic+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands.</a> Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).</li>
<li>Thompson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+waves%3A+Wastewater+surveillance+of+SARS-CoV-2+for+population-based+health+management%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management.</a> Water Research. 184, 116181(2020).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+RNA+concentrations+in+wastewater+foreshadow+dynamics+and+clinical+presentation+of+new+COVID-19+cases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases.</a> The Science of the Total Environment. 805, 150121(2022).</li>
<li>Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+measuring+the+recovery+of+SARS-CoV-2+from+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater.</a> Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).</li>
<li>Chik, A. H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+approaches+to+quantify+SARS-CoV-2+in+wastewater+using+RT-qPCR%3A+Results+and+implications+from+a+collaborative+inter-laboratory+study+in+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada.</a> Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).</li>
<li>Hjelmsø, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+methods+for+the+concentration+and+extraction+of+viruses+from+sewage+in+the+context+of+metagenomic+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing.</a> PLoS One. 12 (1), e0170199(2017).</li>
<li>Philo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+SARS-CoV-2+wastewater+concentration+methods+for+environmental+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance.</a> The Science of the Total Environment. 760, 144215(2021).</li>
<li>Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+concentration+methods+for+quantitative+detection+of+sewage-associated+viral+markers+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methods+for+the+concentration+of+viruses+from+urban+sewage+using+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR.</a> Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).</li>
<li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses%2C+bacteria+and+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li>
<li>Assis, A. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+skimmed-milk+flocculation+method+for+recovery+of+adenovirus+from+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge.</a> The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).</li>
<li>Goncharova, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+quantitative+RT-PCR+assay+with+armored+RNA+controls+for+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).</li>
<li>Yu, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+armored+RNA+as+a+control+for+multiplex+real-time+reverse+transcription-PCR+detection+of+influenza+virus+and+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).</li>
<li>Alygizakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methodologies+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+wastewater%3A+Protocols+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives.</a> Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125(2021).</li>
<li>Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+human+enteric+viruses+as+alternative+indicators+of+fecal+pollution+to+evaluate+wastewater+treatment+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes.</a> PeerJ. 10, e12957(2022).</li>
<li>Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+surveillance+in+Southeastern+Virginia+using+wastewater-based+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology.</a> Water Research. 186, 116296(2020).</li>
<li>Hietala, S. K., Crossley, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armored+RNA+as+virus+surrogate+in+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+proficiency+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).</li>
<li>Uyaguari-Diaz, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+method+for+amplicon-based+and+metagenomic+characterization+of+viruses%2C+bacteria%2C+and+eukaryotes+in+freshwater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples.</a> Microbiome. 4 (1), 20(2016).</li>
<li>Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+change+in+pH+of+skim+milk+and+ultrafiltered%2Fdiafiltered+retentates+on+milk+protein+concentrate+%28MPC70%29+powder+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties.</a> Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).</li>
<li>Geneious. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.geneious.com">https://www.geneious.com</a> (2021).</li>
<li>Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivability%2C+partitioning%2C+and+recovery+of+enveloped+viruses+in+untreated+municipal+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater.</a> Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).</li>
<li>Philo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+the+skimmed+milk+pellet+extraction+protocol+for+SARS-CoV-2+wastewater+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Environmental+Virology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance.</a> Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).</li>
<li>Monteiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+SARS-CoV-2+from+large+volumes+of+raw+wastewater+is+enhanced+with+the+inuvai+R180+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journalof+Environmental+Management%22%5BJournal%5D)">Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system.</a> Journalof Environmental Management. 304, 114296(2022).</li>
<li>Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+throughout+wastewater+treatment+plants+and+a+modeling+approach+to+understand+COVID-19+infection+dynamics+in+Winnipeg%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada.</a> The Science of The Total Environment. 825, 153906(2022).</li>
</ol>

저자는 이 논문에 보고된 작업에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적인 관계가 없다고 선언합니다.

이 연구의 중요한 단계 중 하나는 0.2μm 및 0.45μm 멤브레인 필터로 사전 여과 단계를 적용하여 고체 입자를 제거하는 것입니다. 바이러스를 고체 입자, 특히 외피 바이러스로 분할하는 것을 고려할 때, 사전 여과는 바이러스 회수에 상당한 손실을 초래할 수 있다30. 한외여과 장치의 막힘을 방지하기 위해 환경 및 폐수 시료의 경우 한외여과 방법에 대한 사전 여과 단계가 거의 항상 필요하지만, 다운스트림 분석 유형에 따라 SMF에 대한 사전 여과가 필요할 수 있습니다. 표적 PCR 연구의 경우 사전 여과가 필요하지 않을 수 있습니다. 반면에, 사전 여과는 미세진핵생물 및 박테리아와 같은 더 큰 분획에서 나오는 바이러스체의 배경 소음을 감소시키기 때문에 바이러스 균유전체학을 크게 개선할 수 있습니다. 이 단계는 더 큰 게놈이 바이러스 신호를 떼지 않도록 시퀀싱에 중요합니다.
순차적 한외여과로 처리할 수 있는 시료량은 140mL로 제한됩니...

미생물 군집 분석 및 역학 연구를 위한 지표 및 폐수 샘플에서 미생물의 유효 농도를 결정하는 것은 군집 1,2에서 발병 과정을 모니터링하고 예측하기 위한 중요한 단계 중 하나입니다. COVID-19 대유행은 집중력 개선의 중요성을 전개했습니다. COVID-19는 2019년 말에 등장했으며 2023년 3월 현재 여전히 인간의 건강, 사회 생활 및 경제에 위협이 되고 있습니다. COVID-19의 새로운 유행과 변종이 바이러스의 급속한 전파 및 확산과 더불어 출현하고 보고되지 않고 진단되지 않은 무증상 사례가 발생함에 따라 지역사회에서 COVID-19 발병의 영향을 완화하기 위한 효과적인 감시 및 통제 전략이 중요한 연구 주제가 되었습니다 3,4,5. 시민 사회 단체, 정부 기관 및 공공 또는 민간 유틸리티에서 COVID-19에 대한 폐수 기반 역학을 사용하는 것은 신속한 발병 관련 정보를 제공하고 COVID-19 발병의 영향을 완화하는 데 도움이 되었습니다 6,7,8,9. 그러나 폐수 샘플에서 외피 RNA 바이러스인 SARS-CoV-2의 농도는 여전히 문제를 제기합니다10. 예를 들어, 이러한 문제 중 하나는 폐수 고형물에서 SARS-CoV-2를 분할하는 것인데, 이는 농도11 동안 고형물이 제거될 때 회수에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 경우 정량화/평가의 초점은 수성상만이 아닌 환경 용수 샘플의 고체상과 수성상 모두에 있어야 합니다. 또한 농축 방법의 선택은 다운스트림 테스트 및 분석을 기반으로 수정할 수 있습니다. 환경 샘플에서 바이러스 입자와 병원체의 농도는 시퀀싱 및 마이크로바이옴 분야의 발전과 함께 시급한 연구 주제가 되었습니다.
환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 농축 분야에서 다양한 바이러스 농축 방법이 적용되었습니다. 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법은 여과, 탈지유 응집(SMF), 흡착/용출 및 폴리에틸렌 글리콜 침전12-17입니다. 그 중 SMF는 저렴하고 효과적인 방법으로 간주되어 폐수 및 지표수12,15,16,18에서 SARS-CoV-2를 포함한 바이러스를 성공적으로 테스트 및 회수하는 데 적용되었습니다. SMF 절차는 슬러지, 미처리 하수, 폐수 및 폐수 샘플과 같은 모든 유형의 물 샘플에서 바이러스, 박테리아 및 원생동물과 같은 광범위한 미생물을 동시에 회수하는 적절한 방법론으로 많은 환경 연구에서 인정을 받고 있는 비교적 새로운 접근 방식입니다19. 한외여과 및 글리신-알칼리 용출, 동결건조 기반 접근법 또는 초원심분리 및 글리신-알칼리 용출과 같은 환경 시료에서 바이러스를 회수하는 다른 알려진 방법론과 비교할 때, SMF는 더 높은 바이러스 회수율과 검출률을 가진 가장 효율적인 방법으로 보고되었다18,20. 본 연구에서는 SARS-CoV-2 회수 평가를 위한 테스트를 포함하여 바이러스 농축 방법의 회수 효율을 평가하기 위해 Armored RNA를 테스트 바이러스로 사용했습니다21,22.
여기에서 우리는 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR), 서열 기반 메타유전체학 및 심부 앰플리콘 시퀀싱을 위한 미생물 분획을 농축하기 위한 SMF 및 순차적 한외여과 방법의 유용성을 입증하기 위해 폐수 및 환경 용수 샘플을 테스트했습니다. SMF는 상대적으로 저렴한 방법이며 한외여과 방법에 비해 더 많은 양의 시료에 최적입니다. 순차적 한외여과법을 사용한다는 아이디어는 코로나19 팬데믹 기간 동안 일반적으로 사용되는 한외여과 장치의 공급이 제한되어 바이러스 농축액의 최종 부피를 줄여야 할 필요성에서 비롯되었으며, 대체 바이러스 농축 방법의 개발이 필요했습니다.

<table><tbody><tr><td>pH 7.5의 0.2M 인산나트륨 완충액</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62041AP</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>0.2 &mu; m 47-mm Supor-200 멤브레인 디스크 필터</td><td>VWR</td><td>66234</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>0.45 &mu; m 47-mm Supor-200 막 디스크 필터</td><td>VWR</td><td>60043</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444432</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control</td><td>Asuragen</td><td>49650</td><td>Asuragen, Austin, TX</td>,</tr><tr><td>USA 브랜드 A, Jumbosep 원심 장치, 30-kDa</td><td>Pall&nbsp;</td><td>OD030C65</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>브랜드 B, Microsep Advance 원심 장치, 30-kDa</td><td>Pall</td><td>MCP010C46</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 (50 ml)&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050PK</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Dyna Mag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>GWV 고용량 지하수 샘플링 캡슐 - 0.45 &마이크로; m</td><td>Pall</td><td>12179</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>염산, 1N 표준 용액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC124210025</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit</td><td>Applied biosystems</td><td>A42358</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Promega</td><td>P1197</td><td>Promega Corporation, Fitchburg, WI, 미국</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Masterflex, Cole-Parmer 기기</td><td>7553-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>pH 미터&nbsp;</td><td>덴버 악기</td><td>RK-59503-25</td><td>콜 - 파머. 이 제품은 단종되었습니다</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1</td><td>Invitrogen</td><td>15593031</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>Primers and probe sets IDT</td><td></td><td></td><td>Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA</td></tr><tr><td>Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A34322</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA 고감도(HS) 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Qubit 4 형광측정기, WiFi 포함</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Qubit RNA 고감도(HS) 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Invitrogen</td><td>EN0531</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>RNeasy PowerMicrobiome Kit</td><td>Qiagen</td><td>26000-50</td><td>Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA</td></tr><tr><td>탈지 분유</td><td>Difco (BD Life Sciences)</td><td>DF0032173</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr><tr><td>인산나트륨 완충액</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada</td></tr><tr><td>합성 해수</td><td>VWR&nbsp;</td><td>RC8363-1</td><td>RICCA 화학 회사</td></tr><tr><td>합성 단일 가닥 DNA gBlock</td><td>IDT</td><td></td><td>Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA</td></tr><tr><td>VacuCap 90 진공 여과 장치 - 0.1 &micro; m, 90 mm, 감마선 조사</td><td>Pall</td><td>4621</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI</td></tr><tr><td>VacuCap 90 진공 여과 장치 - 0.2 &micro; m, 90mm, 감마선 조사</td><td>Pall</td><td>4622</td><td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI&beta</td></tr><tr><td>;-메르캅토에탄올</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA</td></tr></tbody></table>

탈지유 응집 및 한외여과를 사용한 환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 입자 농도

Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration

물 및 폐수 기반 역학은 지역 사회의 발병 과정을 모니터링하고 예측하는 대체 방법으로 부상했습니다. 폐수 및 환경 용수 샘플에서 바이러스, 박테리아 및 미세진핵생물을 포함한 미생물 분획을 회수하는 것은 이러한 접근 방식에서 어려운 단계 중 하나입니다. 본 연구에서는 Armored RNA를 테스트 바이러스로 사용하는 순차적 한외여과 및 탈지유 응집(SMF) 방법의 회수 효율에 초점을 맞췄으며, 이는 일부 다른 연구에서도 대조군으로 사용됩니다. 0.45μm 및 0.2μm 멤브레인 디스크 필터를 사용한 사전 여과를 적용하여 한외여과 장치의 막힘을 방지하기 위해 한외여과 전에 고체 입자를 제거했습니다. 순차적 한외여과 방법으로 처리된 테스트 샘플을 두 가지 다른 속도로 원심분리했습니다. 속도가 증가하면 Armored RNA의 회복률과 양성률이 낮아졌습니다. 반면에 SMF는 Armored RNA의 비교적 일관된 회복률과 양성률을 보였습니다. 환경 용수 샘플로 수행된 추가 테스트는 다른 미생물 분획을 농축하기 위한 SMF의 유용성을 입증했습니다. 바이러스를 고체 입자로 분할하는 것은 폐수 샘플의 한외여과 전에 적용된 사전 여과 단계를 고려할 때 전체 회수율에 영향을 미칠 수 있습니다. 사전 여과 기능이 있는 SMF는 샘플의 고체 농도가 낮고 따라서 고체에 대한 분배 속도가 낮기 때문에 환경 용수 샘플에 적용할 때 더 나은 성능을 보였습니다. 본 연구에서는 코로나19 팬데믹 기간 동안 일반적으로 사용되는 한외여과 장치의 공급이 제한되어 바이러스 농축액의 최종 부피를 줄여야 할 필요성에서 순차적 한외여과법을 사용한다는 아이디어가 생겨났고, 대체 바이러스 농축법의 개발이 필요했습니다.

바이러스 RNA 농축 방법의 평가 UF-3k x g로 처리 된 6 개의 샘플 모두 양성이었고 13.38 % ± 8.14 %의 회수율을 보였다 (그림 1). 샘플을 UF-7.5k x g로 처리했을 때 단 하나의 샘플만 양성이었습니다. SMF로 처리된 모든 샘플은 양성이었고 15.27% ± 2.65%의 회수율을 보였습니다(그림 1). UF-3K x g 및 SMF의 평균 회수율은 UF-7.5K x g보다 유의하고 일관되게 (p &lt; 0.0001) 높았다. 반면, UF-3K x g와 SMF의 회수율 사이에는 유의한 차이(p=0.6240)가 없었다. 브랜드 B 원심분리 장치의 원심분리 속도를 3,000 x g에서 7,500 x g로 증가시키면 회수율...

환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 농도는 주로 바이러스의 식별 및 정량화를 위해 수행되는 어려운 작업입니다. 여러 바이러스 농축 방법이 개발되고 테스트되었지만, 여기서는 다양한 샘플 유형을 가진 RNA 바이러스에 대한 한외여과 및 탈지유 응집의 효과를 입증합니다.

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The ...

수성 및 폐수 역학은 지역 사회의 발병 과정을 모니터링하고 예측하는 대안적인 방법으로 부상했습니다. 탈지유 응집 방법은 미생물을 농축하는 대안적인 접근법을 나타냅니다. 탈지유 응집 방법은 한외 여과 또는 접선 유동 여과 접근법과 비교하여 큰 차이 없이 미생물 분획을 농축하기 위한 다재다능하고 저렴하며 쉬운 수동 방법을 나타냅니다.이 접근법은 균유전체학 또는 표적 PCR 연구에 사용됩니다. 미생물 분획이 농축되면 상업용 추출 키트 또는 사내 프로토콜을 사용하여 핵산 추출을 수행할 수 있습니다. 탈지유 응집 방법은 대량의 물 또는 폐수 샘플에 대해 상대적으로 쉽습니다.Milli-Q 물을 사용한 배경 제어가 이 방법의 일부로 포함되어야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 Miguel Uyaguari 연구실의 대학원생 인 Kadir Yanac, Jhannelle Francis 및 Jocelyn Zambrano-Alvarado가 될 것입니다. 시작하려면 2리터의 24시간 유량 비례 복합 미처리 폐수 샘플을 수집하십시오.샘플을 아이스박스에 담아 차광병에 담아 실험실로 운반하고 24시간 이내에 처리합니다. 폐수 처리장 기술 직원으로부터 폐수 특성 데이터를 얻으십시오. 각 한외 여과 방법에 대해 한 날짜에 수집된 6개의 신선한 폐수 샘플과 다른 날짜에 6개의 신선한 폐수 샘플 각각을 140밀리리터로 10배에서 네 번째 사본에 5배 스파이크합니다.자기 교반에서 섭씨 4도에서 30분 동안 교반하여 샘플의 장갑 RNA를 균질화합니다. 탈지유 응집 또는 SMF의 경우 1ml의 합성 해수에 0.5g의 탈지유를 녹여 50% 탈지유 용액을 준비합니다. 하나의 일반 염산을 사용하여 SMF의 pH를 3.5로 조정합니다.500 밀리리터의 원료 폐수 샘플에 5 밀리리터의 탈지유 용액을 첨가하십시오. 샘플을 8 시간 동안 저어주고 형성된 플록이 실온에서 8 시간 동안 더 침전되도록합니다. 침전 된 무리를 방해하지 않고 혈청 학적 피펫을 사용하여 상청액을 제거하십시오.무리를 포함하는 50 밀리리터의 최종 부피를 원심 분리 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30 분 동안 8, 000 G에서 원심 분리기. 상청액을 제거하고 멸균 된 주걱을 사용하여 펠릿을 조심스럽게 긁어냅니다. 나머지 펠릿을 250 마이크로 리터의 0.2 몰 인산 나트륨 완충액에 재현 탁하십시오.긁어내고 다시 부유시킨 펠릿을 동일한 1.5밀리리터 미니 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 제조업체의 지침에 따라 페놀 대 클로로포름, 이소아밀 알코올 및 베타 메르캅토에탄올의 비율이 25:24:2:1인 RNA 추출 키트를 사용하여 폐수 샘플의 바이러스 농축액에서 바이러스 RNA 추출 및 회수 효율 분석을 수행합니다. 마지막으로, 50 마이크로리터의 용출 완충액에서 RNA를 용리한다.RT-qPCR 분석의 경우, 합성 단일 가닥 DNA 또는 gBlock 구조의 10배 희석을 사용하여 장갑 RNA를 정량화합니다. 각 RT-qPCR 실행에 대한 보정 곡선을 얻습니다. 음성 대조군을 포함하고 샘플을 세 번 실행합니다.10리터의 환경 지표수 샘플을 수집합니다. 배경 제어를 위해 10리터의 탈이온수를 포함합니다. 0.45, 0.2 및 0.1 미크론 크기의 멤브레인 디스크 필터를 사용하여 캡슐 및 진공 여과를 수행하여 균유전체학 염기서열 분석 중 노이즈를 최소화합니다.여과 후, 하나의 정상 염산을 사용하여 물 샘플의 pH를 3.5로 조정하십시오. 1% 사전 응집 탈지유 용액을 준비하고 pH를 3.5로 조정합니다. 산성화 된 탈지유 용액 100 밀리리터를 산성화 된 환경 용수 샘플 10 리터에 첨가하십시오.마그네틱 셰이커에서 실온에서 8시간 동안 샘플을 저어주고 추가 8시간 동안 중력에 의해 무리가 침전되도록 합니다. 침전 후, 무리를 방해하지 않고 진공 펌프를 사용하여 상청액을 조심스럽게 제거하십시오. 50 밀리리터 원심 분리기 튜브와 원심 분리기의 무게에 따라 나머지 무리를 분취하고 균형을 맞 춥니 다.상청액을 제거하고 펠릿을 200 마이크로리터의 0.2몰 인산나트륨 완충액에 용해시킨다. 추출 과정에서 공동 침전된 유리 DNA 및 RNA를 제거하기 위한 제조업체의 지침에 따라 용해된 펠릿을 DNase I 및 RNase A로 처리합니다. 배양 후 DNA 또는 RNA 추출 키트를 사용하여 용해된 펠릿에서 DNase I 및 RNase A.Extract 핵산을 비활성화합니다.형광측정기를 사용하여 환경 지표수 샘플에서 추출된 DNA 또는 RNA의 총량을 정량화합니다. qPCR 분석을 수행하여 관심 장내 바이러스를 표적으로 삼고 Illumina 염기서열 분석을 수행하여 바이러스 군집 구조를 식별합니다. 보호되고 영향을 받은 수로에서 2리터의 물 샘플을 수집합니다.샘플에 상당한 파편이 포함되어 있으면 무명천을 사용하여 제거하십시오. 20 밀리리터의 1 % 탈지유 용액을 이전에 pH 조정 된 2 리터 담수 샘플에 첨가하십시오. 샘플을 실온에서 8시간 동안 저어주고 무리가 추가로 8시간 동안 중력에 의해 침전되도록 합니다.침전 후 연동 펌프를 사용하여 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 침전 된 무리를 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 30 분 동안 8, 000 G에서 원심 분리한다. 상청액을 버리고 펠릿을 200 마이크로 리터의 0.2 몰 인산 나트륨 완충액에 재현 탁시킨다.제조업체의 지침에 따라 선택한 핵산 분리 키트를 사용하여 DNA 추출을 위해 약 0.5g의 무리를 선택합니다. 형광 측정기를 사용하여 DNA 농도와 순도를 측정합니다. 3, 000 G에서 초여과로 처리된 6개의 샘플 모두 양성이었다.대조적으로, 샘플이 7, 500 G.All 샘플에 초울트라 여과로 처리되었을 때 단 하나의 샘플만이 양성이었고 더 나은 회수의 결과를 낳았습니다. 3, 000 G 및 SMF의 평균 회수율은 7, 500 G.Water 품질 매개 변수에서 3 계절에 걸쳐 위니펙 내에서 수집 된 환경 물 샘플에서 추출한 영향을받는 샘플 및 핵산에서 매우 일관되게 여과보다 일관되게 높았습니다. 2022년 4월부터 10월까지 아시니보인 강에서 채취한 샘플은 산림 1에서 가장 높은 DNA 농도를 산출했으며 가장 낮은 농도는 농업 현장 3에서 회수되었습니다.적절한 농도의 탈지유를 사용하고 사용하기 전에 샘플을 산성화하는 것이 매우 중요합니다. 이 기술은 물 및 폐수와 같은 환경 시료에 존재하는 다양한 미생물 병원체에 대한 신속한 스크리닝을 제공할 수 있습니다. 토양이나 퇴적물과 같은 고체 매트릭스를 사용하여 추가 수정을 구현할 수 있습니다.

concentration-virus-particles-from-environmental-water-wastewater

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

해양 및 담수 시스템에 바이러스의 매출 비율은 감소하고 reoccurrence 기술로 예상하실 수 있습니다. 데이터는 연구자들이 해양 시스템에서 바이러스 중재의 미생물 사망률의 속도를 추측할 수 있습니다.

아쿼틱 시스템에서 바이러스 생산 요금 예측

연구는 산악 표준시 도구로 제안 인간 / 돼지의 / 소 DNA 바이러스, adenoviruses과 polyomaviruses의 특정 부량에 대한 qPCR을 사용하여 물속에서 nitrates에 의해 배설물 / 소변 오염 또는 오염의 소스의 식별을위한 비용 효율적인 방법을 설명합니다.

특정 인간과 동물 바이러스를 사용하여 미생물 소스 추적을위한 비용 효율적인 방법

유리 양모 필터는 전세계 연구 그룹의 숫자 waterborne 바이러스를 집중하는 데 사용되었습니다. 여기 글라스울 필터를 구축하기위한 간단한 접근 방식을 보여 주며 필터도 waterborne 바이러스성, 세균성 및 protozoan 병원균을 집중 효과입니다 보여줍니다.

집중 Waterborne 바이러스와 농업 Zoonotic 병원균에 대한 유리 양모 필터

인간 아데노바이러스의 스파이크를 사용하여 소량의 물 샘플에 대한 최적의 바이러스 농도 조건을 식별하기 위한 접근 방식이 개발되었습니다. 여기에 설명된 기법은 다른 바이러스 표적에 대한 농도 매개변수를 식별하는 데 사용되며 대규모 바이러스 농도 실험에 적용됩니다.

물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차

EPA Method 1615는 전기 양성 필터를 사용하여 엔테로바이러스와 노로바이러스를 환경 및 음용수에 농축합니다. 이 원고는 Method 1615 분석을 위한 샘플 수집 절차를 설명합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

여기에서는 Buffalo Green Monkey 신장 세포주를 사용하여 총 배양 가능한 바이러스를 측정하는 절차를 제시합니다. 이 절차는 환경 및 음용수에서 감염성 바이러스의 발생을 측정하기 위한 표준화된 도구를 제공합니다.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

여기에서는 거대 바이러스의 새로운 아스파르바이러스 관련 계통인 파우스토바이러스의 새로운 유전자형을 특성화하기 위한 바이러스 분리의 최신 발전에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 바이러스, 특히 아메바를 감염시키는 거대 바이러스의 고처리량 격리에 적용할 수 있습니다.

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략<em&gt; Vermamoeba의 vermiformis</em

여기에서 우리는 VirWaTest를 제시, 이는 사용 시점에서 물 샘플에서 바이러스의 농도 및 검출을위한 간단하고 저렴하고 휴대용 방법입니다.

VirWaTest, 물 샘플에서 바이러스 검출을 위한 사용 시점 방법

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

여기에서는 시아노파지(및 그 숙주)를 분리하기 위해 해양 및 담수 생태계의 유쾌한 영역에서 샘플링하는 방법과 단일 유전자형을 풍부하게 하고 바이러스-숙주 상호 작용 역학을 특성화하는 사후 샘플링 프로세스에 대해 설명합니다.

광합성 미생물 및 바이러스의 환경 샘플링: 현장에서 실험실까지

배우세요 환경 용수 및 폐수 샘플에서 RNA 바이러스를 농축하는 탈지유 응집 방법을 사용하여. 이 비용 효율적인 기술은 한외여과와 동등한 효율성으로 바이러스 역학 연구와 수질 평가에 활용됩니다.

탈지유 응집 및 한외여과를 사용한 환경 용수 및 폐수 샘플의 바이러스 입자 농도

더 많은 동영상 탐색