Name: 암 세포주에서 유래한 낮은 내독소 함량 세포외 소포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 배우세요 SW480 및 SW620 암 세포주에서 저내독소 세포외 소포를 분리하는 방법을. 무균 기술과 초원심분리를 활용하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

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이 작업은 폴란드 국립 과학 센터(National Science Centre)의 보조금 번호 2019/33/B/NZ5/00647의 지원을 받았습니다. EV에서 박테리아 DNA를 검출하는 데 귀중한 도움을 주신 Jagiellonian University Medical College의 분자 의료 미생물학과의 Tomasz Gosiewski 교수와 Agnieszka Krawczyk 교수에게 감사드립니다.

1. 초원심분리기 튜브의 제조
<ol><li>멸균된 일회용 튜브를 사용하십시오. 이것이 가능하지 않은 경우 멸균 파스퇴르 피펫 또는 기타 일회용 애플리케이터를 사용하여 세제로 세척한 후 초원심분리기 튜브를 재사용하십시오. 초원심분리기 튜브는 한 가지 유형의 원심분리 물질(세포 배양 상청액/혈청/혈장)과 종(인간/마우스 등) 전용이어야 합니다.</li>
	<li>세제 세척 후 초원심분리기 튜브를 탈이온화된 LPS가 없는 물로 3회 헹굽니다. 알림: 저질의 물을 사용하지 마십시오.</li>
	<li>초원심분리기 튜브를 건조시킨 다음 70% 에탄올로 채웁니다. 밤새 소독을 위해 튜브에 70% 에탄올을 그대로 두십시오. 에탄올을 제거하고 튜브를 다시 건조시킵니다.</li>
	<li>튜브와 캡을 멸균 포장에 넣고 단단히 닫으십시오. 플라즈마 또는 기체(에틸렌옥사이드) 멸균법18,19를 사용한다. 멸균 포장에 동봉된 초원심분리기 튜브는 건조한 곳에 보관하고 유통기한이 지난 전에 사용하십시오. 알림: 인산염 완충 식염수(PBS)의 LPS 수준과 EV 격리에 사용되는 물을 매월 모니터링합니다. 모니터링에는 튜브도 포함되어야 합니다(예: 실온[RT]에서 밤새 초원심분리기 튜브에 저장된 물[세척 제어]을 테스트).</li>
</ol>2. EV가 고갈된 저내독소 소태아혈청(EE-FBS)의 제조
<ol><li>초저 내독소 FBS(시판, 재료 표 참조, <0.1 EU/mL)를 사용하십시오.</li>
	<li>초저내독소 FBS 병을 수조에 넣고 56°C에서 30분 동안 배양합니다. 이 단계는 보완 시스템을 비활성화하는 데 필요합니다.</li>
	<li>비활성화된 FBS를 초원심분리기 튜브에 피펫팅하고 4°C에서 4시간 동안 100,000 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 멸균된 50mL 튜브에 모으고 튜브당 45mL를 초과하지 않도록 하여 캡 오염을 방지하고 튜브 링을 적시십시오.</li>
	<li>이와 같이 제조된 EE-FBS 혈청을 -20°C에서 보관한다. EE-FBS에서 LPS의 농도를 확인하십시오(6단계). LPS 농도는 초원심분리 전과 같은 수준이어야 합니다.</li>
</ol>3. 세포 배양
<ol><li>이 연구를 위해 SW480 및 SW620 세포주를 4.5g/L 포도당, L-글루타민, 피루브산나트륨 및 겐타마이신(50μL/mL)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 무균 기술을 사용하여 75cm2 배양 플라스크에서 배양했습니다. SW480 및 SW620에 대해 각각 플라스크당 거의 4.5 x 10 6 셀 및 6.5 x 106 셀을 시드합니다.</li>
	<li>세포가 완전한 밀도(SW480 및 SW620의 경우 각각 플라스크당 ~13.5 x 106 및 20 x 10 6 세포)에 도달하면 일주일에 두 번(플라스크당 ~10mL) 상층액을 수집하고 분할합니다. 세포의 생존율이 99% 이상인지 확인하고 세포가 5%CO2 분위기에서 37°C에서 배양되는지 확인한다.</li>
	<li>세포 배양에서 상층액을 적절하게 표지된 15mL 튜브에 수집합니다. 수집된 상층액을 RT에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.</li>
	<li>상층액을 조심스럽게 수집하고, 파편을 흡입하지 않도록 하고, 라벨이 붙은 튜브에 넣고, 4°C에서 12분 동안 3,200 x g 에서 다시 원심분리합니다.</li>
	<li>두 번째 원심분리 단계에서 얻은 상층액을 라벨이 붙은 멸균된 50mL 튜브에 수집합니다. 튜브의 가장자리가 젖지 않도록 하십시오. 상청액의 부피가 45mL를 초과하지 않고 튜브가 수직으로 유지되는지 확인하십시오.</li>
	<li>튜브의 캡을 멸균 투명 필름으로 감싸고 상층액을 -80°C의 수직 위치에 보관합니다. 참고: Mycoplasma spp.의 월간 제어를 수행합니다. 및 신선한 배양 상청액에서의 LPS 오염 (단계 6). 상층액의 내독소 수준이 0.05 EU/mL를 초과하는 경우 오염이 발생했을 수 있는 단계를 확인하고 처음부터 공정을 다시 시작하십시오. Mycoplasma spp.에 의한 세포 배양물의 오염 감지되면 이러한 상청액으로부터 EV의 분리를 중단해야 합니다.</li>
</ol>4. 세포 배양 상층액에서 EV의 분리
<ol><li>0.22μm 주사기 필터와 적절한 부피의 주사기를 준비합니다. 배양 상청액(90mL)이 담긴 두 개의 튜브를 준비합니다.</li>
	<li>주사기에 상층액을 채우고 필터를 바늘 어댑터에 부착하십시오. 필터가 있는 채워진 주사기를 50mL 튜브 위에 놓습니다. 플런저 플랜지를 누르고 ~90mL의 여과액을 수집합니다.</li>
	<li>여과액(7 mL)을 초원심분리기 튜브에 피펫팅하고(적절한 균형을 위해 동일한 부피가 각 튜브에 피펫팅되도록 보장) 4°C에서 2시간 동안 100,000 x g 로 원심분리합니다. 참고: EV 펠릿화의 효율은 EV의 더 나은 회수를 위해 최적화되어야 하는 많은 요인(예: 로터 유형, k-factor, 이동 경로 길이, 매체의 점도 등)에 따라 달라집니다(20).</li>
	<li>멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 여과된 긴 피펫 팁을 사용하여 나머지 펠릿을 수집하고 두 개의 초원심분리기 튜브에 풀링합니다. 여과된 내독소가 없는 PBS로 최대 7mL를 채워 EV를 헹굽니다.</li>
	<li>PBS 재현탁 펠릿을 4°C에서 2시간 동안 100,000 x g 로 원심분리합니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거하고 여과된 내독소가 없는 PBS 200μL를 두 튜브에 추가하여 EV를 재현탁합니다. EV 펠릿을 부드럽게 피펫팅하여 모든 EV를 수집합니다.</li>
	<li>EV 현탁액을 멸균된 1.5mL 시험관으로 옮깁니다(가능하면 저단백질 결합 튜브 사용). 나노입자 추적 분석(NTA) 및 기타 목적(예: 단백질 농도 측정)을 위한 희석액을 준비하기 위해 EV 현탁액 10μL를 유지합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 NTA로 측정하기 위해 여과된 PBS(1:1,000)로 EV를 희석합니다. 캡을 멸균 투명 필름으로 감싸 EV 튜브를 고정합니다. EV를 -80 °C에서 보관하십시오.</li>
</ol>5. 웨스턴 블로팅에 의한 특정 마커 검출
<ol><li>샘플에서 단백질 수준을 결정하고(예를 들어, 브래드포드 분석에 의해), 로딩 완충액으로 샘플(20 μg)을 준비한다. 5 μL의 샘플 버퍼(4x)와 2 μL의 샘플 환원제(10x)를 총 부피 20 μL로 혼합하여 로딩 버퍼를 준비합니다. 샘플을 70°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>SDS(10%-14%)로 폴리아크릴아미드 겔을 준비하고 20μg의 EV를 각 웰에 로드합니다.</li>
	<li>150V에서 45분 동안 러닝 버퍼(트리스 30g, 글리신 144g, 1L당 10% SDS)로 전기영동을 실행합니다.</li>
	<li>Towbin 버퍼(트리스 1.51g, 글리신 7.2g, 0.5L당 10% 메탄올)를 사용하여 이송 기계에서 겔에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 25V에서 1시간 동안 반건식으로 전달합니다.</li>
	<li>멤브레인을 TBST 완충액 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 블로킹하기 위해 TBST 완충액(1 L 당 1 mL의 Tween, 100 mL의 Tris-완충 식염수(TBS 10x))에 넣고, RT에서 로커 상에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>희석된(1:1,000) 항체, 항-CD9 1(클론#D8O1A) 또는 항-알릭스 1(클론#3A9)을1% BSA에 넣고 로커에서 4°C에서 밤새 멤브레인과 함께 배양합니다. 항체를 제거하고 멤브레인을 10mL의 1x TBST로 10분 동안 3배 세척합니다.</li>
	<li>멤브레인의 1차 항체에 따라 염소 항토끼 또는 염소 항-마우스(희석: 1:2,000) 2차 항체를 양고추냉이 과산화효소와 접합하고 RT의 로커에서 1시간 동안 배양합니다. 항체를 제거하고 멤브레인을 10mL의 1x TBST로 10분 동안 3배 세척합니다.</li>
	<li>기질과 루미놀을 1:1 비율로 혼합하여 1mL 용액을 얻습니다. 멤브레인에 용액을 붓습니다. 멤브레인을 이미징 시스템의 측정 챔버에 즉시 배치하고, 화학발광 모듈을 선택하고, 화면에서 단백질 밴드를 시각화합니다.</li>
</ol>6. Limulus Amebocyte Lysate test(LAL)에 의한 내독소 수준 측정
<ol><li>제조업체의 권장 사항에 따라 내독소 수준의 발색 LAL 측정을 수행합니다. 간단히 말해서, 내 독소와 limulus amebocyte lysate (LAL)의 상호 작용에 기초한 방법을 사용하십시오. 이 방법의 검출 한계는 0.005 EU/mL입니다. 참고: LAL 분석은 한계에도 불구하고 현재 과학 또는 의학에서 사용되는 다양한 종류의 용액 및 기타 제품에서 내독소 오염을 검출하고 정량화하는 표준 방법으로 남아 있습니다8. 이 키트의 제한 요소는 재구성 직후 동결된 경우 -20°C에서 1주일 동안만 안정한 재구성된 아메보사이트 용해물 용액의 안정성입니다.</li>
	<li>EV 및 기타 샘플의 10배 희석과 혈청의 50배 희석을 사용하십시오. 추가 실험을 위해 EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI(<0.005 EU/mL) 및 LPS가 없는 배양 상층액과 같은 저내독소 시약만 사용하십시오.</li>
</ol>7. EV 샘플에서 원핵 16S rRNA 유전자 검출
<ol><li>EV 샘플에서 DNA를 분리합니다. 시약과 격리 부위를 무균 상태로 유지하십시오. DNA 농도 및 품질을 측정합니다(예: 분광 광도계 사용).</li>
	<li>앞서 설명한 바와 같이 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행한다21. 에티듐 브로마이드 또는 SYBR 녹색으로 1.5% 아가로스 겔을 준비하여 PCR 산물을 자외선(UV)으로 시각화합니다.</li>
	<li>TRIS-아세테이트-EDTA 버퍼를 사용하여 45분 동안 75V에서 샘플 및 중량 마커의 전기영동을 실행합니다. 이미징 시스템을 사용하여 DNA 밴드를 시각화합니다.</li>
</ol>8. 인간 단핵구 모델에서 자극을 위한 효과적인 LPS 농도의 결정
<ol><li>L-글루타민, 포도당 및 2% EE-FBS가 보충된 RPMI 1640에 2 x 106 단핵구/mL의 단핵구 현탁액을 준비합니다. 96-웰 조직 배양 플레이트22의 웰 당 50 μL의 현탁액을 첨가한다.</li>
	<li>적절한 부피의 LPS 또는 배양 배지를 추가하여 0 pg/mL(대조군), 10 pg/mL, 50 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL 및 100 ng/mL, 100 μL 총 부피의 세포 현탁액. 각 LPS 농도를 세 번 만듭니다.</li>
	<li>세포를 37°C, 5%CO2에서 18시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집합니다.</li>
	<li>상층액을 2,000 x g에서 5분 동안 회전시킵니다. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 수집된 상층액에서 TNF 8,23 및 IL-10 23 농도를 유세포 분석기로 제조업체의 절차에 따라 세포측정 비드 어레이(CBA) 인간 사이토카인 키트로 측정합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 잠재적인 이해 상충으로 구성될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

지난 몇 년 동안, 적절한 전기차 분리를 위한 방법들이 점점 더 중요해졌으며, 예를 들어, 신뢰할 수 있는 오믹스 및 기능 데이터를 얻는 맥락에서 더욱 신뢰할 수 있는 분석이 가능해졌다24. 이전 연구 경험에 비추어 볼 때, 격리 방법의 유형뿐만 아니라이 절차 중 다른 조건도 중요 할 수 있습니다. EV-고갈 FBS의 사용은 필요성으로 널리 인식되고 있다25,26; 그러나 EV의 내독소 오염 모니터링은 종종 무시됩니다.
그럼에도 불구하고 EV 격리에 사용되는 모든 방법은 절차의 모든 단계에서 엄격한 무균 취급 및 품질 관리에 대한 표준을 개발해야 합니다. 이는 EV의 추가 다운스트림 애플리케이션으로 인해 특히 중요합니다. 제안된 프로토콜은 내독소에 민감한 단핵구 및 대식세포와 같은 내독소 민감성 세포에 대한 이전 경험의 결과입니다. ...

MISEV 2018 명명법에 따르면 세포외 소포(EV)는 수많은 생리학적 및 병리학적 과정에서 중요한 역할을 하는 세포 분비 막낭의 다양한 하위 유형을 설명하는 집합적인 용어입니다 1,2. 또한 EV는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커, 치료제 및 약물 전달 수단으로서의 가능성을 보여줍니다. 그러나 인수와 관련된 기술적 장애물이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다3. 이러한 과제 중 하나는 많은 경우 무시되어 온 내독소가 없는 EV의 분리입니다. 가장 흔한 내독소 중 하나는 지질다당류(LPS)로, 그람 음성 박테리아 세포벽의 주요 구성 요소이며 다양한 세포에 의한 많은 수의 염증성 사이토카인의 방출로 인해 급성 염증 반응을 일으킬 수 있습니다 4,5. LPS는 LPS 결합 단백질에 결합한 후 골수 세포에서 CD14/TLR4/MD2 복합체와 상호작용하여 반응을 유도합니다. 이 상호 작용은 MyD88 및 TRIF 의존성 신호 전달 경로의 활성화로 이어지며, 이는 차례로 핵 인자 카파 B(NFkB)를 유발합니다. NFkB의 핵으로의 전좌는 사이토카인의 생산을 개시한다6. 단핵구와 대식세포는 LPS에 매우 민감하며 LPS에 노출되면 염증성 사이토카인과 케모카인(예: IL-6, IL-12, CXCL8 및 TNF-α)이 방출됩니다7,8. CD14 구조는 유사한 친화도를 갖는 상이한 LPS 종의 결합을 가능하게 하고, 다른 톨-유사 수용체 (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 및 9)에 대한 공동-수용체로서 작용한다6. 단핵구/대식세포에 대한 EV의 영향에 대한 연구의 수는 여전히 증가하고 있습니다 9,10,11. 특히 단핵구, 그 하위 집단 및 기타 면역 세포의 기능을 연구하는 관점에서 볼 때, 내독소의 존재와 EV에서 가려진 존재는 매우 중요합니다12. 내독소로 인한 EV의 간과된 오염은 오해의 소지가 있는 결론으로 이어지고 진정한 생물학적 활성을 숨길 수 있습니다. 즉, 단핵구 세포로 작업하려면 내독소 오염이 없다는 확신이 필요합니다13. 내독소의 잠재적 공급원은 물, 상업적으로 입수된 배지 및 혈청, 배지 성분 및 첨가제, 실험실 유리 제품 및 플라스틱 제품일 수 있다 5,14,15.
따라서 본 연구는 저내독소 함유 EV의 분리를 위한 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 이 프로토콜은 EV에서 내독소를 제거하는 대신 EV 격리 중에 내독소 오염을 피하는 방법에 대한 간단한 힌트를 제공합니다. 이전에는 예를 들어 나노 의학에 사용되는 조작 된 나노 입자에서 내 독소를 제거하는 방법에 대한 많은 프로토콜이 제시되었습니다. 그러나 이들 중 어느 것도 EV와 같은 생물학적 구조에 유용하지 않습니다. 나노 입자의 효과적인 발열원 제거는 에탄올 또는 아세트산 헹굼, 175 °C에서 3 시간 동안 가열, γ 조사 또는 트리톤 X-100 처리에 의해 수행 될 수 있습니다. 그러나 이러한 절차는 EV16,17의 파괴로 이어집니다.
제시된 프로토콜은 단핵구에 대한 EV의 효과에 대한 이전 연구와 달리 EV의 내독소 불순물을 피하는 데 초점을 맞춘 선구적인 연구입니다9. 제안된 원리를 실험실 실습에 적용하면 신뢰할 수 있는 연구 결과를 얻는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 클리닉에서 치료제로서 EV의 잠재적 사용을 고려할 때 중요할 수 있다12.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Alix (3A9) 마우스 mAb&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2171</td><td></td></tr><tr><td>1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-Pyrogenic</td><td>GoogLab Scientific</td><td>GBFT1250-R-NS</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 유동 세포분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>CD9 (D8O1A) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13174</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 이미징 시스템</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>17001401</tr><tr><td>DMEM (둘베코' 의 변형된 독수리' s 미디엄)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ELX800NB, 유니버설 마이크로플레이트 리더</td><td>BIO-TEK INSTRUMENTS, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼 남미 초저 내독소</td><td>&nbsp; 바이오웨스트</td><td>&nbsp; S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신, 50 mg/mL</td><td>&nbsp; 팬 &ndash; Biotech</td><td>P06-13100</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG- HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-토끼 IgG- HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membrane</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salmonella abortus equi S-form(TLRGRADE)의 1620177 LPS</td><td>&nbsp; 엔조 생명과학(Enzo Life Sciences, Inc.)</td><td>ALX-581-009-L002</td><td></td></tr><tr><td>미니 트랜스-블롯 전기영동 전사 세포</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1703930</tr><tr><td>나노 입자 추적 분석&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (4X)</td><td>&nbsp; 인비트로젠</td><td>&nbsp; NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 시료 환원제(10개)</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P7793</td><td>투명 필름</td></tr><tr><td>Perfect 100-1000 bp DNA Ladder</td><td>EURx</td><td>E3141-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PierceTM 발색 내독소 퀀트 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39552</td><td></td></tr><tr><td>PP Oak Ridge 튜브(밀봉 캡 포함</td>) <td>Thermo Scientific</td><td>3929, 03613</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>RPMI-1640(Gibco)</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystem</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall wX+ ULTRA 시리즈 원심분리기(T-1270 로터</td> <td>포함)Thermo Scientific</td><td>75000100</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT 수평 전기영동 시스템</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>1704401</tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS 화학발광 기질</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>SW480 세포주</td><td>미국형 배양 컬렉션(ATCC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW480 세포주</td><td>미국형 배양 컬렉션(ATCC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 0.22 um</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>바이오 라드 연구소, Inc.&nbsp;</td><td>1703940</td><td>반송기</td></tr><tr><td>이송 피펫, 3.5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr></tbody></table>

암 세포주에서 유래한 낮은 내독소 함량 세포외 소포의 분리

Isolation of Low Endotoxin Content Extracellular Vesicles Derived from Cancer Cell Lines

세포외 소포(EV)는 시험관 내 및 생체 내 세포에서 방출되는 이질적인 막 소포 집단입니다. 그들의 편재성과 생물학적 정보의 운반자로서의 중요한 역할은 그들을 흥미로운 연구 대상으로 만들고 분리를 위해 신뢰할 수 있고 반복적인 프로토콜이 필요합니다. 그러나 연구와 관련된 많은 기술적 장애물(예: 적절한 획득)이 여전히 많기 때문에 잠재력을 최대한 실현하는 것은 어렵습니다. 이 연구는 차등 원심분리를 기반으로 하는 종양 세포주의 배양 상층액에서 소형 EV(MISEV 2018 명명법에 따름)를 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 EV를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다. EV의 내독소 오염은 후속 실험을 크게 방해하거나 실제 생물학적 효과를 가릴 수도 있습니다. 반면에, 내 독소의 간과 된 존재는 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 이것은 단핵구를 포함한 면역계의 세포를 언급 할 때 특히 중요한데, 이는 단핵구가 내 독소 잔기에 특히 민감한 집단을 구성하기 때문입니다. 따라서 특히 단핵구, 대식세포, 골수 유래 억제 세포 또는 수지상 세포와 같은 내독소에 민감한 세포로 작업할 때 EV의 내독소 오염을 스크리닝하는 것이 좋습니다.

이 프로토콜의 전제 조건 또는 필수 단계는 시약에서 가능한 내독소 오염을 배제하는 것입니다. FBS, DMEM, RPMI, PBS 및 초원심분리기 튜브와 같이 사용되는 모든 시약은 내독소가 없어야 합니다(&lt;0.005 EU/mL). 예를 들어, 세포 배양을 위한 일반/표준 혈청이 풍부한 공급원이 될 수 있기 때문에 내독소 오염이 없는 체계를 유지하는 것은 쉽지 않습니다(0.364 EU/mL, 표 1 참조).
이 프로토콜은 내독소 함량이 낮은 EV를 분리하기 위해 개발되었지만 분리된 EV를 특성화하는 것이 중요합니다. 이 연구에서 EV는 두 개의 대장암 세포주인 SW480과 SW620에서 분리되었습니다. EVs 마커인 CD9 및 Alix의 발현은 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다(도 1A). SW480 및 SW620 셀에서 분리된 EV의 평균 크기에는 차이가 없었습니다(각각 134nm 및 128.2...

제안된 프로토콜에는 세포 배양 상층액에서 세포외 소포를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane vesicles released by cells in vitro and in vivo. Their omnipresence and ...

이 프로토콜은 세포 배양 상층액에서 세포외 소포체를 분리하는 동안 내독소 오염을 방지하는 방법과 이를 적절하게 평가하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 EV와 관련된 모든 실험실이 무균 절차를 유지하고 간단하고 널리 사용 가능한 장비를 사용하여 내독소 오염을 제한할 수 있다는 것입니다. 이 기술을 처음 시도하는 모든 사람은 내독소가 적고 발열성이 없는 표지가 된 새로운 배지, 시약 및 플라스틱 제품으로 시작해야 합니다.이 프로토콜의 경우 내독소가 없는 시약, 물, 배양 배지, 여과된 PBS, 초저내독소 FBS 및 초원심분리기 튜브를 사용합니다. 시작하려면 이전에 배양된 SW480 및 SW620 세포주에서 상층액을 적절하게 표지된 15밀리리터 튜브에 수집합니다. 상층액을 실온에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.파편을 방해하지 않고 상층액을 새 라벨이 붙은 튜브에 모으고 섭씨 4도에서 12 분 동안 3, 200 x g에서 원심 분리합니다. 튜브의 가장자리를 적시지 않고 45 밀리리터의 상청액을 수직으로 배치 된 멸균 50 밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 튜브의 캡을 멸균 투명 필름으로 감싸고 섭씨 영하 80도에서 수직으로 보관하여 세포외 소포를 분리합니다.약 90ml의 상층액이 들어 있는 0.22마이크로미터 주사기 필터, 주사기 및 튜브를 준비하여 분리를 시작합니다. 주사기에 상청액을 채우고 필터를 바늘 어댑터에 고정하십시오. 필터를 통해 상청액을 50 밀리리터 튜브로 여과합니다.여과액 7 밀리리터를 준비된 초원심분리 튜브에 피펫팅하고, 섭씨 4도에서 2시간 동안 100, 000 x g에서 원심분리한다. 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 긴 여과된 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 초원심분리기 튜브로 당깁니다.7밀리리터의 여과된 내독소가 없는 PBS를 추가하여 세포외 소포를 헹굽니다. 초원심분리 후, 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 200마이크로리터의 내독소가 없는 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 현탁액을 멸균된 1.5밀리리터 저단백질 결합 시험관으로 옮깁니다.그런 다음 추가 분석을 위해 10마이크로리터의 현탁액을 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 튜브의 캡을 감싸고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 이제 새로운 튜브에 나노 입자 추적 분석을 위해 여과 된 PBS를 사용하여 1 : 1000의 비율로 1 마이크로 리터의 현탁액을 희석합니다.블로팅 분석을 수행하려면 먼저 20마이크로그램의 샘플을 로딩 버퍼와 혼합합니다. 샘플을 섭씨 70도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 20마이크로그램의 샘플을 SDS가 포함된 10-14% 폴리아크릴아미드 겔의 각 웰에 로드하고 완충액을 사용하여 150볼트에서 45분 동안 전기영동을 수행합니다.다음으로, Towbin 완충액이 있는 이송 기계에 겔을 넣고 1시간 동안 25볼트에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인 상에 단백질의 반건조 전사를 수행합니다. 멤브레인을 1%BSA로 차단하여 로커에서 1시간 동안 배양합니다. BSA 희석 항체인 항-CD9 또는 항-알릭스를 멤브레인에 넣고 로커에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.항체를 제거한 후, 10 분 동안 10 밀리리터의 TBST로 멤브레인을 3 회 세척한다. 이제 염소 항 토끼 또는 항 마우스 2 차 항체를 넣고 실온에서 1 시간 동안 로커에서 다시 배양하십시오. 항체를 버리고 이전에 시연된 대로 멤브레인을 세척합니다.기질과 루미놀을 함유한 용액 1밀리리터를 멤브레인에 같은 비율로 붓습니다. 즉시 멤브레인을 이미징 시스템에 배치하고 화면에서 단백질 밴드를 시각화합니다. 본 연구에서 웨스턴 블롯 분석을 통해 두 개의 세포외 소포 마커인 CD9와 Alix의 존재가 확인되었습니다.SW480과 SW620 모두에서 분리된 소포의 평균 크기와 농도는 비슷했습니다. 다른 용량의 지질다당류(LPS)로 단핵구를 자극한 결과 인터루킨 10의 분비를 가능하게 하는 LPS의 최저 용량과 단핵구의 종양 괴사 인자는 밀리리터당 50피코그램이었습니다. 발색 LAL 테스트는 세포외 소포의 LPS 오염이 두 세포주 모두에서 밀리리터당 약 50피코그램임을 나타냅니다.기억해야 할 가장 중요한 것은 LPS가 없거나 고갈된 시약을 사용하고 절차의 각 단계에서 일상적인 LPS 측정입니다. 내독소 오염을 예방하는 것이 제거하는 것보다 쉽습니다. 제안된 프로토콜은 내독소에 의한 EV의 오염으로 인한 잘못된 결과의 가능성을 제한하고 세포당 EV 활성을 평가할 수 있도록 합니다.제안된 프로토콜은 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포와 같은 내독소에 민감한 세포를 다루는 연구자에게 유용합니다.

isolation-low-endotoxin-content-extracellular-vesicles-derived-from

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

이것은 간에서 조직 세포 외 소포 (EV)를 격리하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 콜라게나아제 관류와 관련된 2단계 과정을 설명하고 간 조직 EV를 분리하기 위한 차동 초원심분리를 설명합니다.

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

이 원고는 유세포 분석기를 사용하여 종양 세포 유래 세포밖 소포 (EVs)의 생체 내 면역원성을 평가하는 방법을 설명합니다. 치료를 받는 종양으로부터 유래된 EVs-유도된 면역원성 세포 사멸은 종양 면역감시에 특히 관련있는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 옥살리플라틴-유도된 면역자극성 종양 EVs의 평가를 예시하지만, 다양한 설정에 적응될 수 있다.

생체 내 비장 T 세포의 유세포 분석기에 의한 종양 유래 세포밖 소포의 면역원성 스크리닝

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.

간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포체의 농축 방법

여기에서는 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 생물학적 기원과 천연 세포외 소포체(EV)의 생물학적 기원과 유사한 구조, 형태 및 단백질 조성을 공유하는 새로운 유형의 엑소좀 모방체(EM)로 설명합니다.

엔도솜 유래 소포의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법

자연살해세포유래 세포외 소포체(NK-EV)는 암 바이오치료제로서 유망한 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법론 기반 연구는 대량의 고순도 NK-EV를 지속적으로 생산하고 분리하도록 설계된 확장 가능한 폐쇄 루프 바이오제조 워크플로를 제시합니다. 공정 중 제어 테스트는 바이오 제조 워크플로 전반에 걸쳐 수행되어 EV가 제품 출시를 위한 품질 표준을 충족하는지 확인합니다.

자연 살해 세포 유래 세포외 소포체 기반 암 바이오치료제를 생산 및 분리하기 위한 확장 가능한 바이오제조 워크플로우

이 프로토콜은 고순도의 인간 모유에서 세포외 소포를 신속하게 분리하고 효과적으로 분리할 수 있도록 설계되었습니다.

인간 모유 유래 세포외 소포의 신속한 분리

배우세요 SW480 및 SW620 암 세포주에서 저내독소 세포외 소포를 분리하는 방법을. 무균 기술과 초원심분리를 활용하여 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

암 세포주에서 유래한 낮은 내독소 함량 세포외 소포의 분리

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