Name: BS3 화학 가교 분석: 설치류 뇌의 세포 표면 GABAA 수용체 표현에 대한 만성 스트레스의 영향 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 학습하세요 BS3 화학 가교 분석법을 이용하여 설치류 뇌에서 GABA_A 수용체의 세포 표면 발현을 평가하는 방법입니다. 이 기술은 만성 스트레스가 신경전달물질 수용체 역학에 미치는 영향을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 연구 기간 동안 동물을 돌봐준 CAMH 동물 시설 직원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소 (CIHR 프로젝트 보조금 # 470458 TT), CAMH의 디스커버리 펀드 (TP), 정신 분열증 및 우울증 연구를위한 전국 연합 (NARSAD 상 # 25637 ES) 및 캠벨 가족 정신 건강 연구소 (ES). E.S.는 새로운 GABAergic 화합물을 클리닉에 도입하는 데 전념하는 바이오 제약 회사인 Damona Pharmaceuticals의 설립자입니다.

이 프로토콜의 모든 동물 작업은 온타리오 동물 연구법(RSO 1990, Chapter A.22) 및 캐나다 동물 관리 위원회(CCAC)에 따라 완료되었으며 기관 동물 관리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물의 준비
<ol><li>실험에 사용할 동물 수를 결정하고 적절한 그룹 또는 실험 코호트로 나눕니다. 그룹 크기, 성별 및 통계적 검정력에 대한 토론은 토론 섹션을 참조하십시오. 참고: 이 프로토콜은 마우스(C57BL6/J 균주, 생후 2-4개월, 일반적으로 체중 20-30g, 동등한 수의 수컷과 암컷 사용)에 맞게 맞춤화되었습니다.</li>
	<li>동물을 UCMS 또는 대조군 비스트레스 조건 하에 5-8주 동안 두고, 앞서 기술한 바와 같은 프로토콜에 따라14.</li>
	<li>마지막 UCMS 절차 후, 수용체 발현에 대한 급성 스트레스 효과를 피하기 위해 가교 분석에 사용하기 전에 동물을 1일 동안 홈 케이지에 머물게 합니다.</li>
</ol>2. 원액의 준비
<ol><li>분석 전에 지시된 대로 다음 용액을 준비하고 보관하십시오.<ol><li>40mL의 탈이온수에 14.6g의 NaCl을 용해시켜 5M NaCl을 준비합니다. 실온(RT)에서 보관하십시오.</li>
		<li>3.22g의 KCl을 탈이온수 40mL에 용해시켜 1.08M KCl을 준비합니다. RT에 보관하십시오.</li>
		<li>3.25g의 MgCl2·6H2O를 40mL의 탈이온수에 용해시켜 400mMMgCl2를 제조한다. RT에 보관하십시오.</li>
		<li>글리신 3g을 탈이온수 40mL에 용해시켜 1M 글리신을 제조하고 4°C에서 보관한다.</li>
		<li>1.54g의 DTT를 탈이온수 10mL에 용해시켜 1M 디티오트레이톨(DTT)을 준비합니다. 공극 크기가 0.2μm인 필터를 통해 필터 멸균하고 2mL 튜브에 분취액을 넣습니다. -20 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>10% Nonidet-P40(NP-40)을 탈이온수에 1:10(v/v)의 비율로 희석하여 준비합니다. RT에 보관하십시오.</li>
		<li>0.5 M EDTA (pH = 8.0)를 준비하고, RT에서 저장한다.</li>
		<li>1 M HEPES 완충액(pH = 7.2-7.5)을 준비하고, 4°C에서 보관한다.</li>
		<li>2.5M 또는 45%(w/v) 포도당을 준비하고 4°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 워크스테이션 준비
<ol><li>BS3 가교 분석 당일, 동물 해부실(그림 1)에서 얼음 양동이, 금속 온도 블록(얼음 위에서 사전 냉각), 50mL 원추형 튜브에 담긴 얼음처럼 차가운 PBS 및 페트리 접시에 담긴 냉동 PBS, PBS를 적신 여과지, 식힌 평평한 표면 또는 파란색 얼음 위에 놓은 여과지, 얼음에 미리 식힌 뇌 매트릭스(면도날 삽입을 위한 1mm 간격), 얼음에 미리 식힌 면도날(~10), 해부 도구(가위, 집게, 곡선 프로브), 티슈 펀치, 70% 에탄올 스프레이 닦는 종이와 종이 타월, 피펫 팁(200μL), 피펫(P200), 스톱워치, 메모장, 펜 및 미세 원심분리기 튜브(1.5mL).<ol><li>분석에 앞서 미세 원심분리기 튜브에 샘플 정보(예: 동물 ID 번호, 처리 유형[UCMS 대 스트레스 없음(NS)], 뇌 영역, BS3 유무 등)로 라벨을 붙입니다. 참고: BS3 가교 분석의 경우 각 뇌 영역에서 두 개의 샘플을 수집해야 합니다. 하나의 샘플은 가교(BS3 포함)에 사용되고 다른 샘플은 비가교 반응(BS3 제외)에 대조군으로 사용됩니다. 따라서 12마리의 마우스에서 두 개의 뇌 영역(즉, 전전두엽 피질[PFC] 및 해마[HPC])에서 샘플링하기 위해 초기 샘플링을 위해 48개의 튜브에 라벨을 붙입니다(= 12마리의 마우스× 2개 영역 × 2개의 샘플)(섹션 6에서 사용). 나중에 보관할 수 있도록 48개의 튜브로 구성된 추가 두 세트에 라벨을 붙입니다(각 샘플의 두 가지 다른 부피[100μL, 300μL]를 저장하기 위해)(섹션 7에서 사용). 따라서 이 코호트 크기에 대해 총 144개의 튜브에 라벨을 부착해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>또한 실험실에서 탁상용 냉장 마이크로 원심 분리기, 초음파 처리기, 튜브 회전 장치 (냉장실 또는 냉장고 내부 [4 ° C]에서 사용), 냉동고 (-80 ° C) 샘플을 저장하기 위한 s, s의 임시 보관을 위한 드라이 아이스 양동이(섹션 7에서 사용)</li>
</ol>4. 작업 용액 및 완충액의 준비
참고: 분석 당일 아침에 다음 용액을 준비합니다. 이 계산은 12마리의 생쥐에서 두 개의 뇌 영역(즉, PFC 및 HPC)을 처리하는 데 필요한 솔루션을 기반으로 합니다.
<ol><li>표 1에 언급된 바와 같이 인공 뇌척수액(aCSF, pH = 7.4)을 준비한다. 750 μL의 aCSF를 각 샘플링 튜브 (3.1.1 단계에서 라벨링 된 48 개의 튜브)에 분배하고 얼음 위의 금속 온도 블록에 넣어 완충액을 미리 냉각시킵니다.</li>
	<li>표 2에 언급된 용해 완충액을 준비한다. 얼음 위에 보관합니다(시료당 400 μL 사용).</li>
	<li>5 mM 구연산 나트륨 완충액(pH = 5.0)에 52 mM BS3 원액(26x)을 준비한다.<ol><li>먼저, 100 mM 시트르산 (스톡 A) 및 100 mM 시트르산 나트륨 (스톡 B)을 준비한다.</li>
		<li>스톡 A와 스톡 B를 탈이온수로 1:20의 비율로 희석합니다. 물 1.9mL에 각각 100μL를 첨가하여 각각 5mM 시트르산(스톡 C) 및 5mM 시트르산나트륨(스톡 D)을 제조합니다.</li>
		<li>410 μL의 스톡 C와 590 μL의 스톡 D를 혼합하여 5 mM 시트르산나트륨 완충액(pH = 5.0)(용액 E, 1 mL)을 제조하였다.</li>
		<li>pH 표시기 스트립을 사용하여 용액 E의 pH를 확인합니다.</li>
		<li>24 μL의 BS3를 806.4 μL의 용액 E에 용해시키고 30 초 동안 볼텍싱하여 BS3 원액 (26x)을 제조한다.</li>
		<li>비가교 샘플에 대한 비히클 대조군으로 사용하기 위해 용액 E 1mL를 추가로 준비합니다. 알림: 다른 모든 것이 준비되고 실험이 시작되려고 할 때 BS3 원액을 준비합니다. BS3는 사용할 때까지 4 °C에서 건조된 상태로 보관해야 합니다. 일단 재구성되면 BS3는 약 ≤3시간 동안만 활성 상태를 유지합니다. 5mM 구연산 나트륨 완충액(용액 E)의 pH가 시간이 지남에 따라 상승하여 BS3 가수분해를 가속화하는 것으로 보고되었으므로 용액 E는 원액 A 및 B9에서 신선하게 준비하는 것이 좋습니다. 저온에 BS3의 한정된 가용성으로 인해, RT에 재구성된 BS3를 지키십시오. 3 h에 있는 재구성된 BS3를 다 써버리고, 재구성된 BS3를 동결/해동하거나 재사용하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 뇌 조직의 해부
알림: 이 단계부터 적어도 두 사람이 조정된 방식으로 함께 작업해야 합니다. 한 사람이 동물 해부에 집중하는 동안(5.2-5.10단계 및 6.3단계), 다른 사람은 계시원으로 일하면서 분석 조정을 도와야 합니다(5.1단계, 6.1단계, 6.2단계, 6.4단계 및 6.5단계)
<ol><li>해부를 위해 첫 번째 동물을 주거 지역에서 해부실로 데려옵니다. 참고: 급성 스트레스 요인(예: 새로운 환경, 혈액 냄새)이 뇌 단백질 역학에 영향을 미칠 수 있으므로 동물을 해부 구역에서 멀리 떨어진 집 우리에 보관한 다음 즉시 참수를 위해 해부실로 개별적으로 가져와야 합니다.</li>
	<li>자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킨 후 참수하십시오. 두개골에서 뇌를 빠르게 제거하고 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS에 10-15초 동안 담급니다(그림 2). 참고: BS3 실험을 위해 동물을 마취하지 않았는데, 그 이유는 어떤 마취제도 신경전달물질 수용체의 표면 발현 수준에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있기 때문이다9.</li>
	<li>차가워진 뇌를 얼음 위의 뇌 매트릭스에 넣고 뇌의 복부 쪽이 위를 향하도록 합니다(그림 3).</li>
	<li>첫 번째 면도날을 후각 구근과 후각 꽃자루 사이의 경계를 통해 삽입하여 뇌를 관상 동맥으로 절단합니다(그림 4). 3-4개의 추가 면도날을 사용하여 뇌의 앞부분을 1mm 간격으로 관상적으로 연속적으로 절단합니다.</li>
	<li>삽입된 모든 면도날을 함께 잡고 뇌의 뒤쪽 부분을 뇌 매트릭스에 남겨 두어 뇌 매트릭스에서 관상 조각을 들어 올립니다. 집게를 사용하여 면도날을 서로 분리하고 뇌 조각이 위를 향하도록 평평하고 차가운 표면에 놓습니다(그림 5).</li>
	<li>관심 영역이 포함된 슬라이스를 식별합니다. PFC를 샘플링하려면 후각 꽃자루가 포함된 첫 번째 슬라이스 뒤쪽의 두 번째 및 세 번째 슬라이스를 선택합니다.</li>
	<li>티슈 펀치(비디오 1)를 사용하여 관심 영역을 제거하고 식힌 면도날에 따로 놓고 조직을 두 개로 고르게 나눕니다(예: 왼쪽 반구와 오른쪽 반구의 조직, 절반은 BS3 가교 반응에 사용하고 나머지 절반은 관심 대상 단백질이 양쪽 반구에서 동일하게 발현되는 경우 가교 없는 제어에 사용됨).</li>
	<li>조직을 으깨거나 갈지 대신 면도날에 대해 여러 수직 동작(비디오 2)을 사용하여 면도날의 미세한 끝을 사용하여 면도날에서 각 조직을 조각으로 다집니다. 이것은 세포의 막 무결성을 심각하게 손상시키지 않고 BS3에 접근할 수 있는 표면적을 최대화합니다. 다진 직후 다진 조직을 적절한 튜브에 옮깁니다 (6.3 단계 참조).</li>
	<li>HPC를 샘플링하려면 뇌의 뒤쪽 부분을 매트릭스에서 꺼내고 등쪽이 위를 향하도록 차갑고 평평한 표면의 축축한 여과지 위에 뇌를 놓습니다(그림 6).</li>
	<li>구부러진 프로브와 집게를 사용하고 등쪽(비디오 3)에서 접근하여 양쪽 반구(BS3 가교의 경우 절반, 대조군의 경우 나머지 절반)에서 HPC(등쪽 절반, 복부 절반 또는 둘 다)를 해부합니다. 5.8단계에서와 같이 각 조직을 다듬고 조직을 적절한 튜브에 옮깁니다(6.3단계 참조). 참고: 실험 조건과 결과가 일치하려면 각 동물의 전체 해부 시간을 ~5분으로 유지해야 합니다.</li>
</ol>6. 가교 반응
<ol><li>이전 마우스의 뇌 해부가 거의 끝나려고 할 때 해부를 위해 다음 동물을 주거 구역에서 해부실로 데려옵니다(5.10단계).</li>
	<li>다진 조직이 적절한 튜브로 옮겨질 준비가 되기 직전에 얼음 위에서 미리 냉각된 튜브(4.1단계부터)에 30μL의 BS3 용액(26x) 또는 비히클 용액 E를 주입합니다. 튜브 사이의 피펫 팁을 변경하여 가교되지 않는 제어 튜브에서 BS3가 오염되지 않도록 합니다.</li>
	<li>다진 조직 (5.8 단계 및 5.10 단계)을 적절한 튜브에 옮긴 후 다음 동물 해부를 시작합니다 (5.2 단계)</li>
	<li>튜브를 뒤집고 혼합하여 조직 덩어리를 더 작은 조각으로 분해하고(비디오 4) 냉장실의 튜브 회전자에서 30분에서 2시간 동안 샘플 배양을 시작합니다. 각 튜브에 대한 BS3 배양 시작 시간을 기록합니다. 최적의 배양 시간에 대해서는 토론 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>튜브에 1M 글리신 78μL를 스파이킹하여 반응을 종료하고 일정한 회전으로 4°C에서 10분 동안 샘플을 추가로 배양합니다. 각 튜브의 담금질 시작 및 종료 시간을 기록합니다. 다음 동물을 데려오고(6.1단계) 가교를 돕고(6.2단계) 동물 해부에 집중하는 사람을 계속 돕습니다. 알림: 각 샘플을 모든 샘플에서 정확히 동일한 타이밍으로 처리하십시오. 해부실이 냉장실에서 멀리 떨어져 있는 경우 냉장실에서 샘플 배양 및 담금질에 참여할 제3자를 모집하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>7. 조직 용해, 단백질 준비 및 웨스턴 블롯
<ol><li>담금질 10분 후(단계 6.5), 샘플을 4°C에서 20,000 x g 로 2분 동안 회전시키고, 상청액을 버린다. 세 번째 사람을 사용할 수 있는 경우 7.2단계로 진행합니다. 그렇지 않으면 샘플을 드라이 아이스에서 급속 냉동하고 모든 동물에 대한 뇌 해부 (섹션 5) 및 가교 (섹션 6)가 완료 될 때까지 분석을 일시 중지합니다.</li>
	<li>튜브당 400 μL의 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 추가합니다.</li>
	<li>샘플을 얼음 위에 유지하면서 5 초 간격으로 1 초 동안 샘플을 5 회 초음파 처리합니다.</li>
	<li>샘플을 20,000 x g 에서 2분 동안 회전시켜 불용성 조직 파편(펠릿)을 회전시키고 상층액을 저장합니다.</li>
	<li>비신코닉산(BCA) 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정하기 위해 상청액 5μL를 사용합니다.</li>
	<li>나머지 상청액을 두 개의 튜브로 나눕니다. 한 튜브에는 후속 웨스턴 블롯을 위한 100μL의 상청액이 들어 있고, 다른 튜브에는 -80°C에서 장기 보관을 위한 나머지(~300μL)가 들어 있습니다. 적절한 양의 4x SDS 샘플 버퍼(β2-메르캅토에탄올로 보충됨)를 샘플에 추가하고 70°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>전기영동(SDS-PAGE)을 위해 아크릴아미드 겔에서 웰당 10-20μg의 단백질을 실행한 다음 웨스턴 블롯 분석을 위해 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮깁니다.</li>
	<li>RT에서 1시간 동안 0.1% Tween-20(TBS-T)을 함유하는 Tris-완충 식염수에 용해된 5%(w/v) 탈지유로 PVDF 막을 차단합니다.</li>
	<li>멤브레인을 TBS-T로 2회 간략하게 세척하고, 4°C에서 밤새 TBS-T에 희석된 1차 항체와 함께 인큐베이션한다.</li>
	<li>1차 항체를 RT에서 TBS-T에서 각각 10분 동안 3회 세척한다.</li>
	<li>RT에서 1시간 동안 TBS-T에 희석된 양 고추 냉이 과산화효소 접합 2차 항체와 함께 멤브레인을 배양합니다.</li>
	<li>2차 항체를 RT에서 TBS-T로 각각 10분 동안 3회 세척한다.</li>
	<li>강화된 화학발광 시약에서 멤브레인을 인큐베이션하고, 겔 문서화 장치를 사용하여 신호를 검출한다.</li>
</ol>

<ol><li>Groc, L., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+glutamate+receptor+movements+and+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking glutamate receptor movements and synapse function.</a> Science. 368 (6496), (2020).</li>
<li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPA+receptor+code+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The AMPA receptor code of synaptic plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li>
<li>Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+DISC1+in+neuronal+trafficking+and+its+implication+in+neuropsychiatric+manifestation+and+neurotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics.</a> Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).</li>
<li>Sumitomo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulk2+controls+cortical+excitatory-inhibitory+balance+via+autophagic+regulation+of+p62+and+GABAA+receptor+trafficking+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons.</a> Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).</li>
<li>Brady, M. L., Jacob, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+%CE%B15+GABA+%28A%29+receptors+via+gephyrin+interaction+regulates+dendritic+outgrowth+and+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation.</a> Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gephyrin+regulates+the+cell+surface+dynamics+of+synaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).</li>
<li>Takamura, Y., Kakuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+receptor+visualization+and+evaluation+of+receptor+occupancy+with+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).</li>
<li>Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression+and+metabolic+half-life+of+AMPA+receptors+in+cultured+rat+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells.</a> Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).</li>
<li>Boudreau, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+crosslinking+assay+for+measuring+cell+surface+expression+of+glutamate+receptor+subunits+in+the+rodent+brain+after+in+vivo+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).</li>
<li>Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin-positive+gamma-aminobutyric+acid+interneuron+deficits+in+depression%3A+Cortical+microcircuit+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives.</a> Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).</li>
<li>Bernardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symptomatic+and+neurotrophic+effects+of+GABAA+receptor+positive+allosteric+modulation+in+a+mouse+model+of+chronic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress.</a> Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).</li>
<li>Prévot, T., Sibille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+GABA-mediated+information+processing+and+cognitive+dysfunctions+in+depression+and+other+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders.</a> Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).</li>
<li>Martin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha5GABAA+receptor+activity+sets+the+threshold+for+long-term+potentiation+and+constrains+hippocampus-dependent+memory%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).</li>
<li>Nollet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+depression%3A+Unpredictable+chronic+mild+stress+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice.</a> Current Protocols. 1 (8), e208(2021).</li>
<li>Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+origin+of+somatostatin-positive+neuron+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability.</a> Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).</li>
<li>Guilloux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+BDNF-+and+GABA-related+dysfunctions+in+the+amygdala+of+female+subjects+with+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression.</a> Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).</li>
<li>Lin, L. C., Sibille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin%2C+neuronal+vulnerability+and+behavioral+emotionality%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality.</a> Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).</li>
<li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain%3A+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).</li>
<li>Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29+and+gene+expression+analysis+of+Fos-expressing+neurons+from+fresh+and+frozen+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54358(2016).</li>
<li>Boudreau, A. C., Wolf, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+sensitization+to+cocaine+is+associated+with+increased+AMPA+receptor+surface+expression+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).</li>
<li>Conrad, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+accumbens+GluR2-lacking+AMPA+receptors+mediates+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving.</a> Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).</li>
<li>Tomoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+controls+GABAAR+trafficking+and+related+cognitive+processes+via+autophagic+regulation+of+p62%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62.</a> Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).</li>
<li>Hernandez-Rabaza, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sildenafil+reduces+neuroinflammation+and+restores+spatial+learning+in+rats+with+hepatic+encephalopathy%3A+Underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 195(2015).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

만성적인 심리사회적 스트레스가 행동(즉, 감정 및 인지 장애)과 분자 변화(즉, GABAergic 유전자의 발현 감소 및 GABAergic 신경전달의 수반되는 결핍)에 미치는 영향은 잘 문서화되어 있지만10, 이러한 결핍의 기저에 있는 메커니즘은 추가 조사가 필요하다. 특히, 만성 스트레스가 ER 기능에 과부하를 일으켜 신경세포 프로테옴에 상당한 영향을 미치고 따라서 ER 스트레스가 상승한다는 것을 보여주는 최근 연구를 감안할 때15, 만성 스트레스가 ER 막을 통한 GABAAR 트래피킹에 영향을 미치는지 여부와 GABAAR의 변화된 트래피킹 또는 표면 수준이 어떻게 정신병리와 인과적으로 연결될 수 있는지에 대한 질문이 남아 있습니다.
이 프로토콜에 표시된 BS3 가교 분석은 이러한 질문 중 일부에 답하기 위한 강력한 접근 방식으로 작용할 것입니다. 예를 ...

신경전달물질 수용체는 뉴런 원형질막 표면 또는 세포내막(예: 엔도솜, 소포체[ER] 또는 트랜스-골지체)에 국한되어 있으며, 뉴런의 내재적 생리학적 상태 또는 외인성 신경망 활동에 대한 반응에 따라 이 두 구획 사이를 동적으로 왕복합니다 1,2. 새로 분비된 신경전달물질은 주로 표면에 국한된 수용체 풀을 통해 생리적 기능을 이끌어내기 때문에, 주어진 신경전달물질에 대한 표면 수용체 수준은 신경 회로 내에서 신호 전달 능력의 중요한 결정 요인 중 하나이다3.
배양된 뉴런의 표면 수용체 수준을 모니터링하기 위해 표면 비오티닐화 분석(surface biotinylation) 분석법4, 비투과화 조건에서 특정 항체를 사용한 면역형광분석법(immunofluorescence assay)5, pH 민감성 형광 광학 지시약(예: pHluorin)6과 유전적으로 융합된 수용체 이식유전자(receptor transgene)의 사용을 포함하여 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 대조적으로, 이러한 접근법은 생체 내에서 표면 수용체 수준을 평가할 때 제한적이거나 비실용적입니다. 예를 들어, 표면 비오티닐화 절차는 상대적으로 높은 가격과 아비딘-접합 비드 상에서 비오티닐화된 단백질을 정제하는 데 필요한 후속 단계로 인해 생체 내 뇌 조직의 대량 및 샘플 수를 처리하는 데 실용적이지 않을 수 있습니다. 3차원 뇌 구조에 내장된 뉴런의 경우 항체 접근성이 낮거나 현미경 기반 정량화의 어려움으로 인해 생체 내 표면 수용체 수준을 평가하는 데 상당한 제한이 있을 수 있습니다. 온전한 뇌에서 신경전달물질 수용체의 분포를 시각화하기 위해, 양전자 방출 단층촬영과 같은 비침습적 방법을 사용하여 수용체 점유를 측정하고 표면 수용체 수준을 추정할 수 있다7. 그러나 이 접근 방식은 특정 무선 리간드의 가용성, 고가의 장비 및 특수 전문 지식에 크게 의존하므로 대부분의 연구자가 일상적으로 사용하기에 접근하기 어렵습니다.
여기에서는 수용성, 막 불투과성 화학 가교제인 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3)8,9를 사용하여 생체 외에서 실험 동물 뇌의 표면 수용체 수준을 측정하는 간단하고 다재다능한 방법을 설명합니다. BS3는 라이신 잔기의 측쇄에 있는 1차 아민을 표적으로 하며 서로 가까운 거리에서 단백질을 공유 결합할 수 있습니다. 관심 영역에서 뇌 조각을 갓 준비하고 BS3를 포함하는 완충액에서 배양하면 세포 표면 수용체는 이웃 단백질과 가교되어 더 높은 분자량 종으로 변형되는 반면 세포 내 막내 관련 수용체는 변형되지 않은 상태로 유지됩니다. 따라서, 표면 및 세포내 수용체 풀은 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분리되고 연구하고자 하는 수용체에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 정량화될 수 있다.
예측할 수 없는 만성 경미한 스트레스(UCMS)는 설치류에서 만성 심리사회적 스트레스를 유발하기 위한 잘 확립된 실험 패러다임이다10. UCMS는 GABA 및 그 수용체를 포함한 일련의 신경 전달 물질 시스템의 조절을 통해 불안/우울과 유사한 행동 표현형 및 인지 장애를 유발합니다10,11. 특히, α5 서브유닛 함유 GABAA 수용체(α5-GABAAR)는 기억 및 인지 기능의 조절에 연루되어 있으며(12,13), 이는 UCMS 유도 인지 결핍에서 이 서브유닛의 변경된 기능이 관여할 수 있음을 시사합니다. 이 프로토콜에서 우리는 BS3 가교 분석을 사용하여 스트레스를 받지 않은 대조군 마우스와 비교하여 UCMS에 노출된 마우스의 전두엽 피질에서 표면 발현된 α5-GABAAR의 수준을 정량화했습니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>2.5 m (45%, w/v) Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>4x SDS 시료 완충액 (Laemmli)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)</td><td>Pierce</td><td>A39266</td><td>No-Weigh Format; 10 x 2 mg</td></tr><tr><td>뇌 매트릭스</td><td>Ted Pella</td><td>15003</td><td>마우스용, 30 g 성인, 코로나, 1 mm</td></tr><tr><td>염화칼슘 (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 프로브</td><td>Fine Science Tools</td><td>10088-15</td><td>총 해부학 프로브; 각도 45</td></tr><tr><td>탈이온수</td><td>milli-Q</td><td>EQ 7000</td><td>초순수 [비저항 18.2 M&Omega; &미드닷; cm @ 25 &deg; C; 총 유기 탄소(TOC) &le; 5ppb]&nbsp;</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper (3MM)</td><td>Whatman</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (large)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>Extra Fine Graefe Forceps</td></tr><tr><td>Forceps (small)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Dumont #5 Forceps</td></tr><tr><td>GABA-A R alpha 5 항체</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-31163</td><td>다클론 토끼 IgG; 화학적 가교 시 잘못된 신호 검출</td></tr><tr><td>GABA-A R 알파 5 C-말단 항체</td><td>R& D Systems</td><td>PPS027</td><td>다클론 토끼 IgG; 마우스 및 랫</td></tr>트 <tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>W328707</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1721019</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40, 대체(NP-40)</td><td>SantaCruz</td><td>68412-54-4</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>가위(대)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td>수술용 가위 - 톱니</td></tr><tr><td>가위 (작은)</td><td>정밀 과학 도구</td><td>14060-09</td><td>정밀 가위 - 날카로운</td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Qsonica Sonicator Q55)&nbsp;</td><td>Qsonica</td><td>15338284</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 refregerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5425R</td><td></td></tr><tr><td>Tissue punch (ID 1 mm)</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td>Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>10026938</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator (LabRoller)</td><td>Labnet</td><td>H5000</td><td></td></tr></tbody></table>

bs3 화학 가교 분석: 설치류 뇌의 세포 표면 gabaa 수용체 표현에 대한 만성 스트레스의 영향 평가

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Evaluating the Effect of Chronic Stress on Cell Surface GABAA Receptor Presentation in the Rodent Brain

불안은 인지 기능을 포함하여 동물의 행동에 다양한 영향을 미치는 감정 상태입니다. 불안의 행동 징후는 동물계 전체에서 관찰되며 광범위한 스트레스 양식에 대한 적응 또는 부적응 반응으로 인식될 수 있습니다. 설치류는 분자, 세포 및 회로 수준에서 불안의 통합 메커니즘을 다루는 번역 연구를 위한 입증된 실험 모델을 제공합니다. 특히, 만성 심리사회적 스트레스 패러다임은 인간과 설치류 사이에 유사한 불안/우울과 유사한 행동 표현형을 모방하는 부적응 반응을 유도합니다. 이전 연구에서는 만성 스트레스가 뇌의 신경 전달 물질 함량에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났지만 신경 전달 물질 수용체 수준에 대한 스트레스의 영향은 충분히 연구되지 않았습니다. 이 기사에서는 특히 감정과 인지의 조절과 관련된 감마-아미노부티르산(GABA) 수용체에 초점을 맞춰 만성 스트레스를 받는 생쥐에서 신경 전달 물질 수용체의 신경 전달 물질 수용체의 신경 표면 수준을 정량화하는 실험 방법을 제시합니다. 막 불 투과성 비가역성 화학 가교제 인 bissulfosuccinimidyl suberate (BS3)를 사용하여 만성 스트레스가 전두엽 피질에서 GABAA 수용체의 표면 가용성을 상당히 하향 조절한다는 것을 보여줍니다. GABAA 수용체의 신경 표면 수준은 GABA 신경 전달에 대한 속도 제한 과정이므로 실험 동물 모델에서 불안 / 우울 유사 표현형의 정도에 대한 분자 마커 또는 프록시로 사용될 수 있습니다. 이 가교 접근법은 모든 뇌 영역에서 발현되는 신경 전달 물질 또는 신경 조절제에 대한 다양한 수용체 시스템에 적용할 수 있으며 감정과 인지의 기본 메커니즘에 대한 더 깊은 이해에 기여할 것으로 기대됩니다.

마우스 PFC에서 표면 α5-GABA AR 수준을 평가하기 위한 BS3 가교 분석의 타당성을 입증하기 위해, 우리는 SDS-PAGE에서 BS3 가교 및 비가교 단백질 샘플 각각 10μg을 실행하고 항-α5-GABAAR항체(토끼 다클론)를 사용하여 웨스턴 블롯으로 단백질을 분석했습니다(그림 7). 비-가교 단백질 샘플은 ~55 kDa에서 α5-GABA AR의 총량을 제공하는 반면, BS3-가교 단백질 샘플은 α5-GABAAR에 공유 가교결합된 단백질 복합체를 나타내는 고분자량 단백질 종과 함께 일정량의 내막 관련 α5-GABAAR(~55 kDa에서 이동)을 생성하였다. 표면 α5-GABAAR수준의 정량화를 위해, 우리는 가교 결합시 총 풀에서 ~ 55 kDa에서 α5-GABAAR의 고갈 정도를 평가할 수 있습니다. 실제적으로, α5-GABA<...

BS3 화학적 가교 분석은 만성 심리사회적 스트레스 조건 하에서 마우스 뇌에서 감소된 세포 표면 GABAA 수용체 발현을 보여줍니다.

BS3 화학 가교 분석: 설치류 뇌의 세포 표면 GABAA 수용체 표현에 대한 만성 스트레스의 영향 평가

Anxiety is a state of emotion that variably affects animal behaviors, including cognitive functions. Behavioral signs of anxiety are observed across the ...

BS3를 가교제로 사용하는 화학적 가교 분석은 신경 전달 효능의 중요한 결정 요인인 신경 전달 물질 수용체 세포 표면 수준을 결정하는 데 도움이 됩니다. 이 분석은 동물 모델에서 다양한 향정신성 제제 또는 심인성 스트레스 양식에 반응하는 수용체 역학의 뇌 영역 특이적 평가에 특히 유용합니다. 시작하려면 안락사된 C57BL/6J 마우스의 두개골에서 뇌를 빠르게 제거합니다.얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 10-15초 동안 담그십시오. 식힌 뇌를 복부 쪽이 위로 향하도록 얼음 위의 뇌 매트릭스에 놓습니다. 뇌를 관상 모양으로 자르려면 첫 번째 면도날을 후각 구근과 후각 꽃자루 사이의 경계를 통해 삽입합니다.3-4 개의 추가 면도날을 사용하여 뇌의 앞쪽 부분을 1 밀리미터 간격으로 관상 적으로 연속적으로 자릅니다. 삽입된 면도날을 함께 잡고 뇌 매트릭스에서 관상 조각을 들어 올리고 뒤쪽 부분은 남겨둡니다. 집게를 사용하여 면도날을 서로 분리하고 뇌 조각이 위를 향하도록 평평하고 차가운 표면에 놓습니다.전두엽 피질을 샘플링하려면 후각 꽃자루를 포함하는 첫 번째 조각의 뒤쪽에 있는 두 번째 및 세 번째 조각을 선택합니다. 티슈 펀치 또는 집게를 사용하여 원하는 부위를 제거하십시오. 식힌 면도날에 티슈를 올려 놓고 두 조각으로 골고루 나눕니다.집게의 미세한 끝을 사용하여 면도날에서 여러 수직 동작으로 각 조직을 조각으로 다집니다. 인공 뇌척수액이 들어있는 미리 냉장 된 라벨이 붙은 튜브에 30 마이크로 리터의 BS3 용액 또는 비히클 용액 E. 그런 다음 다진 조직을 원하는 튜브로 즉시 옮깁니다. 해마를 샘플링하려면 매트릭스에서 뇌의 뒤쪽 부분을 제거하고 등쪽이 위를 향하도록 차갑고 평평한 표면에 축축한 여과지 위에 놓습니다.구부러진 탐침과 집게가 등쪽에서 접근하여 양쪽 반구에서 해마를 해부한 다음 조직을 다져서 이전에 시연된 대로 적절한 스파이크 튜브로 옮깁니다. 가교 반응을 위해 조직과 용액이 들어 있는 튜브를 뒤집어 조직 덩어리를 작은 조각으로 나눕니다. 샘플 샘플을 섭씨 4도에서 30분에서 2시간 동안 튜브 회전자에서 배양하고 각 튜브에 대한 BS3 배양 시작 시간을 기록합니다.그런 다음 78 마이크로 리터의 1 몰 글리신으로 반응을 종결시킵니다. 일정한 회전으로 섭씨 4도에서 10분 동안 더 배양하고 담금질 시작 및 종료 시간을 기록합니다. BS3 가교 후 웨스턴 블롯 분석에서, 비 가교 단백질은 약 55 킬로 달톤에서 GABA-A 수용체의 알파 5- 서브 유닛의 총량을 보였다.그러나, BS3 가교 단백질은 GABA-A 수용체의 알파5 서브유닛에 공유 가교된 단백질 복합체를 나타내는 더 높은 분자량 단백질 종과 함께 약 55킬로달톤에서 이동하는 GABA-A 수용체의 막내 관련 알파5-서브유닛을 보여주었다. 더욱이, GABA-A 수용체 수준의 표면 알파5-서브유닛의 현저하고 점진적인 감소가 스트레스가 없는 대조군 마우스와 비교하여 UCMS의 3주 및 5주에 전두엽 피질에서 관찰되었습니다. 수용체는 주변 온도에서 원형질막 표면과 내부 막 사이를 왕복하는 것으로 알려져 있습니다.따라서 저온에서 조직 해부를 수행하는 것이 중요합니다. 가교 분석을 활용함으로써 심리사회적 스트레스가 부분적으로 불안, 행동 또는 인지 결핍의 분자적 기초 역할을 하는 GABA 수용체의 표면 수준을 크게 조절할 수 있음이 밝혀졌습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 PTSD 환자의 특징 neuroendocrine 기능의 영구적 인 변경 및 지연, 장기, 과장된 공포 반응을 보여 후 외상 후 스트레스 장애 (PTSD)의 쥐 모델을 설명합니다. 동물 모델과 여기에 설명 된 방법은 기계론의이지만 주변 흰색 혈액 세포의 생체과 함께, 환자로 측정 할 수없는 뇌 핵에 생체, 수를 상호 연관 유용합니다.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

이 비디오는 Bis-sulfosuccinimidyl suberate 또는 BS3를 사용하여 신경 세포 표면 단백질의 교차결합을 보여줍니다. 고립되고 차가워진 쥐의 뇌는 관상으로 절편되어 있습니다. 원하는 부위를 절편에서 추출하고, 다지고, BS3로 처리합니다. BS3는 GABA 수용체와 같은 표면 단백질을 가교하여 내부 단백질을 변경하지 않습니다. 추가 분석을 위해 샘플을 처리하기 전에 반응물을 글리신으로 담금질합니다.

화학적 가교 분석법을 사용한 마우스 뇌의 뉴런 표면 단백질 가교 분석

스트레스 과립 (SGS는) 실속 리보 입자 (RNP들), 각종 스트레스에 대한 세포 반응에 중요한 포함하는 세포질 RNA 과립이다. SG를 역학 스트레스 후 형질 일차 전지에있는 SG를의 태그 구성 요소의 현지화를 시각화하여 살아있는 세포에 따라 할 수있다.

라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

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선동 우울 증상, 행동 변화 및 ​​설치류에 부정적인 건강 성과에 대한 예측할 수없는 만성 가벼운 스트레스 프로토콜

여기 쥐에서 예측할 수 없는 만성 가벼운 스트레스 프로토콜 선물이. 이 프로토콜 장기 우울증 같은 표현 형을 유도 하 고 행동 하 고 neuromolecular 우울증 같은 적자 반전에 상 상속 항우울제의 효능을 평가 하기 위해 수 있습니다.

마우스에 Anhedonia 유도 대 한 예측할 수 없는 만성 가벼운 스트레스 프로토콜

여기, 우리 프로토콜 및 관련 만성 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인을 쥐 모델을 사용 하 여 메 틸 Seq, epigenomic 플랫폼의 구현을 설명 합니다. 결과 쥐 메 틸-Seq 플랫폼은 쥐에서 스트레스 노출에서 발생 하는 메 틸 화 차이 감지 수를 보여 줍니다.

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Y-미로 장벽 작업은 보상을 위한 노력을 소비하는 동기를 검사하는 행동 테스트입니다. 여기에서는 만성 코르티코스테론과 사회적 패배 스트레스를 비롯한 여러 가지 잘 검증된 만성 스트레스와 여성에게 효과적인 새로운 만성 비차별적 사회적 패배 스트레스(CNSDS)를 테스트하는 데 대해 논의합니다.

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