Name: Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정 방법을. L4 단계 수컷과 암컷을 배양하여 유전자 변이체의 발달 결함을 평가하고, 차등 세포 계수기로 정확한 데이터를 수집합니다.

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Jaramillo-Lambert 실험실에서의 작업은 국립 보건원 NIGMS R35GM142524의 지원을 받습니다. 모든 예쁜꼬마선충 균주는 국립 보건원(National Institutes of Health, P40 OD010440)이 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center에서 제공했습니다. 그림 1D 는 Biorender.com 를 사용하여 만들어졌습니다.

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 실험용 플레이트 준비
<ol><li>MYOB(Modified Youngren's, Only Bacto-peptone) 배지로 직경 35mm의 페트리 접시를 준비합니다. MYOB 플레이트를 만들기 위해 Bacto 한천 20g, NaCl 2g, Trizma-HCl 0.55g, Trizma-OH 0.24g, Bacto 펩톤 3.1g, 콜레스테롤 1.6mL를 ddH2O 1L에 넣고121°C에서 40분 동안 오토클레이브합니다. 55°C로 식히고 멸균 기술을 사용하여 용융된 매체 4mL를 각 35mm 페트리 접시에 붓습니다. 알림: MYOB 1리터는 ~250개의 플레이트를 만들며 4°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 각 균주에 대해 3개의 반복 세트가 있는 복제당 최소 10명의 개체를 권장합니다.</li>
	<li>멸균 기술을 사용하여 플레이트 중간에 OP50 박테리아의 작은 반점(약 50μL)으로 플레이트를 시딩합니다. 참고: 작은 잔디밭은 작은 지점이 수컷과 자웅동체 사이의 만남을 증가시켜 짝짓기 기회를 증가시키기 때문에 교차 수정을 평가하는 데 특히 중요합니다.</li>
</ol>2. 배아 생존력 분석(자웅동체 자가수정)
<ol><li>1일차<ol><li>각 접시의 뒷면에 라벨을 붙입니다. 실험 내내 각 플레이트와 각각의 웜을 추적해야 합니다. 참고: 선호하는 라벨링 기술-1일차: 웜 1, 1일차: 웜 2, ... 등.</li>
		<li>개별 L4 단계 자웅동체를 각 플레이트에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오. 벌레가 성충으로 발달하고 20°C의 표준 배양 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 3일차에 이 플레이트에 점수를 매기십시오. 참고: 온도에 민감한 돌연변이의 경우 실험 온도가 변경될 수 있습니다. 온도에 민감한 돌연변이의 경우, 배아 생존력 분석은 허용 온도(15-16 °C) 및 비허용 온도(24-26 °C) 모두에서 수행되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2일차<ol><li>새 플레이트 세트에 라벨을 붙입니다-2일차: 웜 1, 2일차: 웜 2, ... 등.</li>
		<li>1일차 개별 웜을 새 플레이트로 옮깁니다. 참고: 이 벌레는 성체에 도달해야 하며 야생형 벌레는 이미 배아를 낳기 시작했어야 합니다.</li>
		<li>벌레가 20°C 또는 기타 적절한 온도에서 24시간 동안 배아를 낳도록 합니다. 4일째에 이 판에 점수를 매기십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>3일차<ol><li>새 접시 세트에 라벨을 붙인다. 3일차: 웜 1, 3일차: 웜 2, ... 등.</li>
		<li>2일차 개별 웜을 새 플레이트로 옮깁니다. 20°C 또는 기타 적절한 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 5일째에 이 번호판에 점수를 매기십시오. 알림: 온도가 낮을 경우 부화 시간이 늘어납니다. 그에 따라 조정하십시오.</li>
		<li>미세 마커를 사용하여 35mm 뚜껑에 격자 패턴을 그립니다. 이전에 계수된 웜을 추적하기 위해 계수를 위해 테스트 플레이트 아래에 격자 뚜껑을 놓습니다(그림 1A-B).<ol><li>감별 세포 계수기를 사용하여 자손의 존재 또는 부재에 대해 1일째 플레이트에 점수를 매깁니다. 살아있는 애벌레와 부화하지 않은 배아를 세십시오. 참고: 이 시점에서 생존 가능한 배아가 부화해야 할 만큼 충분한 시간이 경과했습니다. 부화하지 않은 배아는 죽은 것으로 추정됩니다.</li>
			<li>개별 정사각형 내에서 정사각형 안에 있는 부화하지 않은 배아와 살아있는 유충을 세십시오(그림 1C-F).</li>
			<li>정사각형 테두리에 있는 웜의 경우 웜 헤드의 위치를 기준으로 계산합니다. 머리가 사각형의 위쪽과 왼쪽 가장자리에 닿는 웜을 세십시오(아래쪽 또는 오른쪽 가장자리에 닿는 웜은 계산하지 마십시오. 그림 1D). 이 분석을 위해 수정되지 않은 난모세포를 계산하지 마십시오(그림 1F).</li>
		</ol></li>
		<li>살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>4일차<ol><li>2.3.3.1 단계에 설명된 대로 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 2일차 플레이트를 채점합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>5일차<ol><li>2.3.3.1 단계에 설명된 대로 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 3일째 플레이트를 채점합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 데이터 분석에 설명된 방법을 사용하여 얻은 데이터를 분석합니다. 참고: 일부 유전적 돌연변이는 생식 주기가 지연되거나 확장될 수 있습니다. 3일차 플레이트 이후에도 배아가 계속 산란되는지 개별 균주를 모니터링합니다. 배아 생산이 4 일까지 중단되지 않으면 성인을 새로운 판으로 계속 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 배아 생존력 분석(수컷/자웅동체 교차 수정)
<ol><li>1일차<ol><li>각 접시의 뒷면에 라벨을 붙입니다. 실험 내내 각 플레이트와 각각의 웜을 추적해야 합니다.</li>
		<li>개별 L4 자웅동체 벌레를 각 플레이트에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오. 참고: 정자를 생산하지 않는 fog-2 기능 상실 돌연변이와 같은 여성화 균주를 자웅동체 대신 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>단일 L4 수컷 벌레를 L4 자웅동체가 들어 있는 각 라벨이 붙은 판에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오. 참고: plg-1 변종 수컷과 같은 균주는 짝짓기 후 자웅동체 외음부에 교합 플러그를 부착하기 때문에 짝짓기가 발생했는지 여부를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>벌레가 20°C 또는 다른 적절한 온도에서 24시간 동안 짝짓기를 하고 자손을 낳도록 합니다. 3일째에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대해 이 플레이트에 점수를 매깁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2일차<ol><li>새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 위의 2일차와 같이 웜을 옮깁니다. 이 경우 자웅동체와 수컷을 모두 새 판에 옮겨야 합니다. 자웅동체가 성인기에 도달했는지 확인하십시오.</li>
		<li>자웅동체가 20°C 또는 다른 적절한 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 4일째에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대해 이 플레이트에 점수를 매깁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>3일차<ol><li>새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 위의 3일차와 같이 웜을 옮깁니다. 자웅동체와 수컷을 모두 새 접시에 옮겨야 합니다.</li>
		<li>20°C 또는 다른 적절한 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 5일째에 살아있는 배아와 부화하지 않은 배아에 대해 이 플레이트에 점수를 매기십시오.</li>
		<li>감별 세포 계수기를 사용하여 단계 2.3.3.1에 설명된 대로 1일째 플레이트에서 살아있는 유충과 부화되지 않은 배아를 계산합니다. 알림: 접시는 4일차에 필요하므로 버리지 마십시오.</li>
		<li>살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>4일차<ol><li>2.3.3.1 단계에서 설명한대로 2 일째 판에서 살아있는 자손과 부화하지 않은 배아를 계산합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오.</li>
		<li>남성용 1일차 플레이트를 확인하세요. 짝짓기가 발생하면 수컷에 대한 자웅동체의 예상 유전 비율은 50:50이어야 합니다. 1일차 플레이트에 수컷이 포함되어 있지 않으면 수컷과 자웅동체 사이의 짝짓기가 발생하지 않았습니다. 이 짝짓기 쌍을 버리고 이 관찰을 실험실 노트에 기록하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>5일차<ol><li>2.3.3.1 단계에서 설명한대로 3 일째 판에서 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 계산합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 데이터 분석에 설명된 방법을 사용하여 얻은 데이터를 분석합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>식 (1)을 사용하여 균주의 주어진 생물학적 복제물의 배아 생존율 백분율을 계산합니다. 참고: 살아있는 자손과 부화하지 않은 배아의 수는 실험 기간 동안의 일일 수를 합산하여 얻습니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq01.jpg" style="margin: auto;">(1개)</li>
	<li>부모 자웅동체에 의해 생산된 자손(부화하지 않은 배아 및 유충)의 수를 합산하여 주어진 균주의 벌레당 무리 크기를 계산합니다. 방정식 (2)를 사용하여 평균 새끼 크기를 계산합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65064/65064eq02.jpg" style="margin: auto;">(2개)</li>
	<li>배아 생존율과 평균 무리 크기를 생물학적 복제 간의 평균 및 표준 편차와 함께 보고합니다. 대조군 데이터와 실험 데이터를 비교하는 스튜던트 t-검정을 수행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Hillers, K., Jantsch, V., Martinez-Perez, E., Yanowitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , (2017).</li>
<li>O'Connor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities%3A+aneuploidies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Education%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities: aneuploidies.</a> Nature Education. 1 (1), 172(2008).</li>
<li>Marcello, M. R., Singaravelu, G., Fertilization Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 321-350 (2013).</li>
<li>Marcello, M. R., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+and+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Fertilization and the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> BMB Reports. 43 (6), 389-399 (2010).</li>
<li>Robertson, S., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The oocyte-to-embryo transition.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 351-372 (2013).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-31 (2015).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+mutants+of+the+nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction mutants of the nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Chu, D. S., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 171-203 (2013).</li>
<li>Dernburg, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+recombination+in+C.+elegans+initiates+by+a+conserved+mechanism+and+is+dispensable+for+homologous+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiotic recombination in C. elegans initiates by a conserved mechanism and is dispensable for homologous chromosome synapsis.</a> Cell. 94 (3), 387-398 (1998).</li>
<li>Bhandari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suppressors+of+top-2+embryonic+lethality+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Identification of suppressors of top-2 embryonic lethality in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 3 (4), 1183-1191 (2020).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Fabritius, A. S., Hansen, T. J., Smith, H. E., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+a+novel+mutant+allele+of+topoisomerase+II+in+Caenorhabditis+elegans+reveals+a+unique+role+in+chromosome+segregation+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The identification of a novel mutant allele of topoisomerase II in Caenorhabditis elegans reveals a unique role in chromosome segregation during spermatogenesis.</a> Genetics. 204 (4), 1407-1422 (2016).</li>
<li>Jaramillo-Lambert, A., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminus+of+SPE-11+is+required+for+proper+embryonic+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">The C-terminus of SPE-11 is required for proper embryonic development in C. elegans.</a> microPublication Biology. , (2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

유성 생식 종의 번식은 감수 분열을 통해 반수체 배우자 (즉, 난자 및 정자)의 형성을 필요로하며, 수정시 통합되어 이배체 염색체 번호를 복원하고 배아 발달을 시작합니다. 이러한 과정의 오류는 불임, 배아 치사율 및/또는 선천적 기형으로 이어질 수 있습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 유성 생식을 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 유전자 돌연변이 또는 유전자 발현 녹다운(예: RNA 간섭)의 효과는 위에서 설명한 배아 생존력 및 무리 크기 분석을 사용하여 비교적 빠르고 쉽게 평가할 수 있습니다. 우리는 감수 분열 염색체 분리 및 수정/난자 활성화에 관여하는 유전자의 초기 특성화를 위해 이러한 방법을 사용했습니다10,11,12. 배아 생존력 또는 새끼 크기의 관찰된 감소는 감수분열, 배우자 형성, 수정 또는 배아 발생의 중단을 나타냅니다.
배아 생존력과 새끼 크기는 자손 계수와 간단한 수학적 계산을 통해 비교적 쉽게 평가되기 때문에 실험실이나 교실에서 연구 초보자를 위한 최적의 입문 실험입니다. 예쁜꼬마선충 사육의 용이성과 경제적 이점으로 인해 실험 생물학 수업에 특히 적합합니다. 학생들은 예쁜꼬마선충 축산을 통해 귀중한 연구 경험을 얻고, 해부 현미경 사용법을 배우고, 비교적 짧은 시간(이 논문에 설명된 프로토콜로 약 5일)에 답변할 수 있는 발달 시스템에서 생물학적 질문을 할 수 있습니다.
자손 계수의 시기는 배아 생존력 분석에 매우 중요합니다. 20°C에서 배발생은 약 16시간이 걸리고 생식적으로 성숙한 성충은 L1 유충으로 부화한 후 약 60시간 후에 알을 낳기 시작합니다. 수명 주기가 빠르기 때문에 적절한 기간 내에 자손을 세어 배아가 부화할 수 있는 충분한 시간을 허용하지만 자손 자체가 알을 낳기 시작하기 전에 자손을 세는 것이 중요합니다. 성장 기간은 온도에 따라 다르다는 점에 유의하는 것도 중요합니다. 성장은 15-16°C보다 24-25°C에서 약 2.1배 빠르고, 15-16°C보다 20°C에서 약 1.3배 빠르다13. 이 프로토콜에서는 성인을 새 접시에 담은 후 48시간 후에 계수하는 것이 좋습니다. 이 기간은 야생형 발달이 있는 모든 배아가 부화할 수 있는 충분한 시간(>16시간)을 갖지만 생식 능력 지점까지 노화되지 않도록 합니다. 20°C 미만의 온도에서 수행된 분석은 배아가 부화하고 부화한 자손이 MYOB 플레이트의 박테리아 중에서 관찰하기 쉬운 유충 단계(L3-L4 단계)에 도달하기 위해 연장(4일 동안 동물 이식)해야 할 수 있습니다.
배아 생존력 분석 및 새끼 크기 측정에 대한 한계는 교란되는 특정 발달 과정이 쉽게 드러나지 않는다는 것입니다. 그러나 이러한 초기 분석은 어떤 과정이 영향을 받는지 결정하기 위해 세포학적 기술로 후속 조치를 취할 수 있습니다. 예를 들어, 성충을 해부하여 생식선을 방출한 후 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 염색을 하고 생식계열 내의 DNA 형태를 주의 깊게 분석하면 감수분열 과정이 중단되는지 여부를 알 수 있습니다. 또한, 배아의 DAPI 염색은 어느 단계에서 배아 발생이 정지되는지를 밝힐 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 생산된 배아(무리)의 수와 다양한 예쁜꼬마선충 돌연변이에 대해 생존할 수 있는 배아의 비율을 분석하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 이 분석은 자가 수정 자웅동체와 수컷/자웅동체 교배에 모두 사용할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충 의 짧은 수명 주기로 이 프로토콜은 1주일 이내에 완료할 수 있습니다. 배아 생존력 분석 및 새끼 크기는 감수분열, 수정 또는 배아 발달과 관련된 유전자의 첫 번째 분석으로 사용할 수 있으며 고급 연구자 및 연구 초보자(학부 및 1학년 대학원생) 모두에게 적합한 프로토콜입니다.

진핵 생물의 유성 생식은 수정 과정을 통해 배아를 형성하기 위해 합쳐지는 기능적 배우자의 생산을 필요로합니다. 모계 및 부계 배우자, 난자(난자), 정자는 감수분열과 배우자 형성의 특수한 세포 분열 및 분화 과정을 통해 생성된다1. 감수 분열은 단일 이배체 세포로 시작하여 원래 부모 세포의 염색체 수의 절반을 포함하는 딸 세포의 형성으로 끝납니다. 배수성의 감소에서 독립적인 구색 및 교차 재조합을 통한 유전 물질의 셔플링에 이르기까지 감수분열은 여러 가지 중요한 기능을 수행합니다1. 감수 분열의 오류는 배우자 내에 염색체가 너무 많거나 너무 적은 이수성을 유발할 수 있습니다. 염색체 불균형은 유산과 다운 증후군 및 에드워즈 증후군과 같은 발달 장애의 주요 원인이기 때문에 이수성의 발생률은 인체 건강에 엄청난 영향을 미친다2.
수정(Fertilization)은 모계와 부계 배우자가 융합하여 새로운 유기체를 생성하는 과정이다3. 배우자-배우자 인식은 배우자 표면의 단백질에 의해 촉진된다3. 배우자 적합성 오류는 정자와 난자 융합이 진행되지 않아 불임으로 이어집니다. 정자와 난모세포의 융합은 유사분열 분열을 통해 단세포 배아에서 완전한 기능을 하는 다세포 유기체로의 발달 여정을 시작할 수 있는 활성 배아의 적절한 형성으로 이어지는 많은 사건을 유발한다4. 배아 발생 전반에 걸쳐, 발달을 조절하는 분자적 사건은 유기체의 적절한 성장을 가능하게 하기 위해 엄격하게 조절되고 정확한 타이밍을 맞춰야 한다5. 초기 발달 동안 적절한 세포 분화는 유기체가 만능 배아에서 본격적인 유기체로 전환함에 따라 중요합니다. 이러한 사건의 복잡성으로 인해 혼란은 배아 치사를 초래하는 발달 결함으로 이어질 수 있습니다.
Caenorhabditis elegans는 감수 분열, 수정 및 배아 발달을 연구하는 훌륭한 모델 유기체입니다. 예쁜꼬마선충은 수컷과 자웅동체의 두 가지 성별을 가진 투명한 선충류입니다. 자가 수정이 가능한 예쁜꼬마선충 자웅동체가 우세한 성이다 6,7. 자웅동체 생식선은 정자에 저장되는 네 번째 유충(L4) 단계에서 먼저 정자를 생산합니다. L4에서 성인기로의 전환에서 생식선은 난모세포 생산으로 전환되며, 난모세포는 저장된 정자를 통해 수정됩니다. 자웅동체에서 0.2% 미만의 비율로 발생하는 수컷은 정자만 생산하고 자웅동체와 짝짓기를 할 수 있습니다. 교차 수정(cross-fertilization)을 할 때, 남성 정자는 난모세포의 수정(pseudocyte)에서 자웅동체 정자를 능가한다8. 이것은 자가 수정 주식을 통해 동형접합 돌연변이를 비교적 쉽게 유지하고 유전자 교차를 통한 유전자 조작을 가능하게 합니다. 두 성별은 남성과 여성 생식선에서 감수 분열의 차이를 탐구하는 연구를 허용합니다. 또한, 예쁜꼬마선충과 그 알의 투명한 특성으로 인해 감수 분열, 배우자 형성, 수정 및 배아 발생 과정은 형광 이미징 기술을 사용하여 살아 있는 온전한 동물에서 연구할 수 있습니다.
예쁜꼬마선충의 감수분열, 수정 및/또는 배아 발달에 역할을 할 수 있는 유전자의 새로운 돌연변이를 분석할 때, 이러한 과정의 오류는 종종 생존 가능한 자손의 생산 실패 또는 감소로 이어지기 때문에 중요한 첫 번째 단계는 배아 생존력과 무리 크기를 결정하는 것입니다. 이 논문은 자가 수정 자웅동체 또는 자웅동체와 수컷 사이의 교배에서 생식력, 배아 생존력 및 무리 크기를 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 고전적인 분석은 많은 예쁜꼬마선충 연구에서 사용되어 왔지만, 당사는 설정 및 정확한 정량화를 위한 표준화된 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에서는 짝짓기 및 자손 생산을 허용하기 위해 개별 벌레 또는 수컷/자웅동체 쌍을 분리합니다. 자손 생산 및 생존력은 생존 가능한 자손 및 생존 불가능한 배아의 수를 결정하기 위해 일련의 날에 걸쳐 관찰됩니다. 실험이 끝나면 개별 무리를 분석하여 배아 생존율과 총 무리 크기를 계산합니다.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 페트리 접시</td><td>Tritech research</td><td>T3501</td><td>반 쌓을 수 있고 통기되지 않습니다.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td>MYOB</td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td>MYOB</td></tr><tr><td>콜레스트롤</td><td>시그마&nbsp;</td><td>C8503</td><td>MYOB</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>J.T. Baker</td><td>FW 58.440</td><td>MYOB</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>MYOB</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>시그마</td><td>T3253</td><td>MYOB</td></tr><<tr><td>strong>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em<>C. elegans wild type strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>him-5(e1490)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>DR466</td><td></td></tr><tr><td>spo-11(ok79)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>AV106</td><td></td></tr><tr><td>Equipment/software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>차동 셀 카운터</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-670-12</td><td></td></tr><tr><td>MicroSoft Excel 또는 Prism</td><td>MicroSoft 또는 GraphPad</td><td></td><td>데이터의 그래픽 표현 기록 및 생성용.</td></tr><tr><td>플래티넘 와이어</td><td>Tritech Research</td><td>PT9901</td><td>웜 픽 제작용. 99.5% 플래티넘, 0.5% 이리듐. 이것은 3피트/팩으로 제공되며 36개의 웜 픽(픽당 ~1인치 백금 와이어)을 만들기에 충분합니다.</td></tr><tr><td>초점</td><td>마운트, 통합 LED 모듈, 전원 코드, 6.7x - 50x 줌 범위[WD 115mm], 광시야 접안렌즈 C-15x/17이 있는 실체현미경 Nikon SMZ-745 디아스코픽 베이스(참고: 동등한 실체현미경은 다른 제조업체에서 구할 수 있습니다.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>웜 픽 핸들</td><td>Tritech 연구</td><td>TWPH1</td><td>웜 픽을 만들기 위해. 웜 픽 핸들에 ~1개의 백금 와이어를 장착합니다. 또는 유리 파스퇴르 피펫에 백금 와이어를 장착하여 웜 픽을 만들 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans 는 감수 분열, 수정 및 배아 발달 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 예쁜꼬마선충은 자웅동체로 존재하며, 이는 많은 자손 무리를 생산하며, 수컷이 존재하면 더 큰 무리의 교배를 생산할 수 있습니다. 감수 분열, 수정 및 배아 발생의 오류는 불임, 생식력 감소 또는 배아 치사율의 표현형으로 신속하게 평가할 수 있습니다. 이 기사에서는 예쁜꼬마선충의 배아 생존력과 새끼 크기를 결정하는 방법을 설명합니다. 우리는 개별 변형 영렌의 박토펩톤만(MYOB) 플레이트에 벌레를 채취하여 이 분석을 설정하는 방법을 보여주고, 생존 가능한 자손과 생존 불가능한 배아를 계산하기 위한 적절한 기간을 설정하고, 살아있는 벌레 표본을 정확하게 계산하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 자가 수정 자웅동체의 생존력과 짝짓기 쌍에 의한 교차 수정을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 비교적 간단한 실험은 학부생 및 1 학년 대학원생과 같은 새로운 연구자에게 쉽게 채택 할 수 있습니다.

우리는 N2(야생형)와 감수분열에 관여하는 유전자에 돌연변이가 있는 두 가지 균주인 him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)에 대해 배아 생존력 및 무리 크기 분석을 수행했습니다. him-5와 spo-11 모두 감수 분열 교차 형성에 역할을 하기 때문에 이 두 유전자의 돌연변이는 이수성 배우자의 형성을 초래합니다. N2에 대한 이 배아 생존력 분석은 98.9%의 생존율을 보인 반면, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)은 각각 74.9% 및 0.8%의 백분율로 자손 생존율의 감소를 보여주었습니다(그림 2A; p &lt; 0.0005). 이러한 결과는 이전에 발표된 결과 7,9와 일치합니다. N2, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)의 평균 무리 크기는 각각 217, 105 및 219로 결정되었습니다(그림 2B). 이전 간행물과 일관되게, him-5(e1490)는 야생형에 비해 무리 크기가 현저히 감소한 반면, spo-11(ok79)은 7,9가 아닙니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig01.jpg"> 그림 1: 플레이트의 계수 설정 및 배아 형태 시연 . (A) 미세한 샤피를 사용하여 그린 십자형 격자 패턴이 있는 뚜껑 이미지. (B) 계산을 위해 아래에 패턴이 있는 뚜껑이 있는 35mm MYOB 플레이트. (C) 그리드의 여러 상자를 보여주는 저배율(10x) 시야를 보여주는 이미지. 흰색 화살촉은 이 시야 내에서 여러 유충을 가리킵니다. 계수는 유충과 배아를 모두 관찰하기 위해 더 높은 배율(들판에서 단 한 칸)에서 이루어져야 합니다. 스케일 바 = 1,000 μm. (D) 격자 패턴이 있는 뚜껑의 만화를 35mm 플레이트 아래에 놓습니다. 삽입물은 주어진 사각형에서 어떤 유충이 계산되는지 결정하는 적절한 기술을 나타냅니다. 위에서 아래로, 왼쪽에서 오른쪽으로 센다. 사각형 안에 있는 모든 웜을 세십시오. 경계에 닿는 웜은 꼬리가 아닌 웜 머리의 위치를 기준으로 계산해야 합니다. 현재 그리드를 향하는 웜 또는 이전에 계산된 그리드(예: 위쪽 및 왼쪽 가장자리)를 계산합니다. 머리가 아래쪽이나 오른쪽 가장자리에 닿는 웜을 세지 마십시오. 삽입부터 파란색 벌레는 계산되지만 빨간색 벌레는 계산되지 않습니다. (E) 건강한 N2 L1 부화한 유충(흰색 화살촉)의 대표 이미지. (F) 수정되지 않은 난모세포(검은색 화살촉)와 부화하지 않은 배아(빨간색 화살촉)의 대표 이미지. 수정되지 않은 난모세포는 이 분석에 포함되어서는 안 됩니다. 스케일 바 (E,F) = (100 μm). 참고: C, E, F 의 이미지는 Zeiss AxioZoom 현미경으로 촬영했으며, 웜 플레이트에 유충, 배아 및 난모세포의 모습을 보여주기 위해 카메라가 부착되었습니다. 배아 생존력 분석의 경우, 실체 현미경(카메라 없음)을 사용하여 플레이트를 관찰하면서 계수를 수행합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65064/65064fig02.jpg"> 그림 2: 배아 생존율 분석 및 새끼 크기의 결과를 나타내는 대표적인 그래프. (A) 20°C에서 N2, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)의 배아 생존율. (B) 20°C에서 N2, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)의 무리 크기 . 최소 28개의 자웅동체의 자손이 각 균주에 대해 점수를 매겼습니다. 부화하지 않은 배아와 유충의 총 수는 N2 = 6302, him-5(e1490) = 2,945, spo-11(ok79) = 7,230이었습니다. 오차 막대는 세 번의 개별 반복실험에 걸친 표준 편차를 나타냅니다. 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산된 통계량, n.s. = 유의하지 않음, *p &lt; 0.0005. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65064/65064fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 모델 유기체 C. elegans를 사용하여 배아 생존력과 생산된 배아(새끼)의 총 수를 결정하는 일반적인 방법을 제시합니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

Caenorhabditis elegans is an excellent model organism for the study of meiosis, fertilization, and embryonic development. C. elegans exist as ...

새끼 크기와 배아 생존력을 결정하기 위한 이 프로토콜은 많은 예쁜꼬마선충 실험실에서 사용됩니다. 짐승 크기와 배아 생존력의 감소는 근화, 수정 및 배아 발생과 같은 중요한 발달 과정의 결함을 나타낼 수 있습니다. 이 기술은 초보 예쁜꼬마선충 연구자들에게 명확한 지침을 제공합니다.설정 및 실행이 비교적 간단하며 새로운 돌연변이 균주로 작업할 때 좋은 출발점입니다. 이 기술의 가장 큰 과제는 배아 대 수정되지 않은 배아 식별입니다. 새로운 연구자들은 이러한 실험을 시작하기 전에 배아, 난모세포 및 다양한 애벌레 단계의 식별을 연습해야 합니다.시작하려면 플레이트 뒷면에 라벨을 붙이고 개별 L4 단계 자웅동체를 플레이트로 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오. 벌레가 성충으로 발달하도록 하고 섭씨 20도의 표준 배양 온도에서 24시간 동안 자가 자손을 낳습니다.3일차에 플레이트에 점수를 매깁니다. 다음 날, 새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 하루 종일 개별 웜을 새 플레이트에 옮깁니다. 벌레가 섭씨 20도에서 24시간 동안 배아를 낳도록 합니다.넷째 날에 플레이트에 점수를 매기십시오. 3일차에 새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 2일차에 개별 웜을 새 플레이트에 옮깁니다. 벌레가 20도에서 24 시간 동안 자손을 낳도록하십시오.5일차에 플레이트에 점수를 매깁니다. 미세 마커를 사용하여 35mm 뚜껑에 격자 패턴을 그립니다. 이전에 계수된 웜을 추적하기 위해 계수를 위해 테스트 플레이트 아래에 격자 뚜껑을 놓습니다.차등 세포 계수기를 사용하여 개별 사각형 내에서 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 계산합니다. 사각형 테두리에 있는 웜의 경우 웜 헤드의 위치에 따라 계산됩니다. 머리가 사각형의 상단과 왼쪽 가장자리에 닿는 웜을 세십시오.살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 넷째 날에는 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 둘째 날 접시에 점수를 매기고 실험실 노트에 기록합니다. 5일째에는 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 3일째 접시에 점수를 매기고 실험실 노트에 기록합니다.플레이트 뒷면에 라벨을 붙인 후 개별 L4 자웅동체 웜을 플레이트에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오. L4 수컷 벌레 한 마리를 L 4 자웅동체가 들어 있는 접시에 옮깁니다.벌레가 짝짓기를 하고 섭씨 20도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 3일차에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대한 플레이트에 점수를 매깁니다. 다음날, 새 접시 세트에 라벨을 붙이고 자웅동체와 수컷을 새 접시에 옮깁니다.자웅동체가 성인기에 도달했는지 확인하십시오. 자웅동체가 섭씨 20도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 4일째에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대한 플레이트에 점수를 매깁니다.셋째 날에는 새 접시 세트에 라벨을 붙이고 자웅동체와 수컷을 새 접시에 옮깁니다. 벌레가 20도에서 24 시간 동안 자손을 낳도록하십시오. 5일째에 살아있는 배아와 부화하지 않은 배아에 대해 플레이트에 점수를 매깁니다.감별 세포 계수기를 사용하여 첫날 플레이트에서 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세고 실험실 노트에 기록합니다. 넷째 날에는 둘째 날의 살아있는 자손과 부화하지 않은 배아를 세어 실험실 노트에 기록합니다. 남성용 1 일 접시를 확인하십시오.짝짓기가 발생하면 수컷에 대한 자웅동체의 예상 유전 비율은 50 대 50입니다. 한 접시에 수컷이 들어 있지 않으면 수컷과 자웅동체 사이의 짝짓기가 일어나지 않았습니다. 이 짝짓기 쌍을 버리고 실험실 노트에 관찰을 기록합니다.5일째에는 3일째 접시에서 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 실험실 노트에 기록합니다. N2에 대한 배아 생존율 분석은 98.9%의 생존율을 보인 반면, him-5(e1490)와 spo-11(ok79)은 각각 74.9%와 0.8%의 비율로 배아 생존율의 감소를 보였다. N2, him-5(e1490) 및 spo-11(ok79)의 평균 새끼 크기는 각각 217, 105 및 219로 결정되었습니다.예쁜꼬마선충 개발의 다양한 단계에 대한 인식은 정확하고 재현 가능한 데이터를 위해 중요합니다. 사진과 해부 현미경을 사용하여 웜 개발에 익숙해지는 것이 좋습니다. 이 절차는 유전자가 발달 과정에 관여하는지 여부를 결정하는 훌륭한 첫 번째 단계이며 어떤 과정이 중단되었는지 확인하기 위해 세포학적 분석이 뒤따를 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 예쁜꼬마선충의 수명을 측정하는 전통적인 플레이트 기반 방법을 설명합니다. 예시 프로토콜은 RNAi로 처리된 기생충의 수명을 측정합니다.

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C. elegans의 알을 낳는 행동은 발달, 생식 및 해부학 연구에서 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.이 비디오는 알을 낳는 분석의 중요한 단계를 소개하고 약물의 생식 독성을 테스트하는 샘플 실험을 보여줍니다.

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여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

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모델 동물, 꼬마 선 충, 화학 물질의 독성을 평가 하는 기본 프로토콜을 설명 합니다. 방법은 편리 하 고 다양 한 환경 오염 물질의 위험 평가 관해서는 뿐만 아니라 의약품의 개발에 유용 합니다.

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여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.

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미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

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정자는 성공적으로 난 모 세포를 비료를 통해 이동 해야 합니다. 여기에서, 우리는 C에서 정자 이동 측정에 대 한 분석을 설명 합니다 .  이 분석은 결합 후 자 궁 내 정자 분포에 대 한 정량적 데이터 뿐만 아니라 속도, 방향 속도 및 반전 주파수를 제공 할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 배아에서 성인에 이르기까지 모든 발달 단계에서 Drosophila의 생존 가능성을 평가하기 위해 고안되었습니다. 이 방법은 상이한 유전자형 또는 성장 조건의 생존 가능성을 결정하고 비교하는 데 사용될 수 있다.

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이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

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Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

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