Name: Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 학습하세요 이중 염료 광학 매핑 기법을 사용하여 CPVT 마우스 심장의 전기생리학적 특성을 평가하는 방법입니다. 이 기술은 심장 부정맥의 메커니즘 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81700308에서 XO로, 31871181에서 ML로, 82270334에서 XT로), 쓰촨성 과학 기술 지원 프로그램 (CN) (2021YJ0206 - XO, 23ZYZYTS0433 및 2022YFS0607 - XT, 2022NSFSC1602 - TC) 및 의약 자원의 화학 및 분자 공학을 위한 국가 핵심 연구소 (광시 사범 대학) (CMEMR2017-B08 - XO)의 지원을 받습니다. MRC(G10031871181 to ML02647, G1002082, ML), BHF(PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE at Oxford(ML) 보조금.

실험에는 10주 내지 14주령의 수컷 야생형 마우스 또는 무게가 20-25g인 RyR2-R2474S/+ 마우스(C57BL/6 배경)가 사용되었다. 모든 절차는 기관이 운영되는 국가 지침에 따라 중국 쓰촨성 사우스웨스트 의과대학의 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호:20160930)의 승인을 받았습니다.
1. 준비
<ol><li>스톡 솔루션<ol><li>블레비스타틴 원액: 100% 디메틸설폭사이드(DMSO) 1mL를 (-) 블레비스타틴 분말 2.924mg이 함유된 원래 플라스크에 넣어 10mM의 농도에 도달합니다.</li>
		<li>전압 표시기 RH237 원액: 원래 플라스크에 100% DMSO 1mL를 RH237 분말 1mg과 함께 첨가하여 2.01mM의 농도를 달성합니다.</li>
		<li>칼슘 지시약 Rhod-2 AM 원액: 100% DMSO 1mL를 Rhod-2 AM 분말 1mg에 첨가하여 0.89mM 농도에 도달합니다.</li>
		<li>Pluronic F127 원액: 100% DMSO 1mL를 Pluronic F127 200mg에 첨가하여 20% w/v(0.66mM)의 농도에 도달합니다.</li>
		<li>반복적인 동결 및 해동을 방지하기 위해 단일 또는 이중 사용을 위해 21-51 μL(RH237 21μL, Rhod-2 AM 31μL, blebbistatin 51μL)의 200μL PCR 튜브에 원액을 분주합니다. 그런 다음 용액을 알루미늄 호일로 싸서 상온의 어두운 방에 배치한 Pluronic F20 원액을 제외하고 -127°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>관류 용액<ol><li>크렙스 용액(mM): 크렙스 용액 1L(NaCl 119, NaHCO3 25, NaH2PO41.0, KCl 4.7, MgCl2 1.05, CaCl2 1.35 및 포도당 10)를 준비합니다.</li>
		<li>0.22 μm 무균 바늘 필터로 용액을 여과하고 95 % O2 / 5 %CO2로 산소를 공급하십시오.</li>
		<li>40mL의 Krebs 용액을 50mL 원심 튜브에 넣고 후속 심장 격리를 위해 4°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Langendorff 관류 시스템 및 광학 매핑 장치<ol><li>Langendorff 관류 시스템을 설정합니다.<ol><li>수조를 켜고 온도를 37°C로 설정합니다.</li>
			<li>Langendorff 관류 시스템을 탈이온수 1L로 세척합니다.</li>
			<li>흡입관에서 용액을 관류하고 유출 속도를 3.5-4mL/분으로 조정합니다. 그런 다음 37°C에서 O 2/CO2(95%/5%) 가스로 관류액에 산소를 공급합니다. 알림: 관류 시스템에는 기포가 허용되지 않습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>광학 매핑 시스템을 준비합니다.<ol><li>전자 곱셈 전하 결합 장치(EMCCD) 카메라(512픽셀 × 512픽셀), 렌즈(40배 확대), 파장 분할기 LED(발광 다이오드), 심전도(ECG) 모니터 및 자극 전극을 설치합니다(그림 1).</li>
			<li>렌즈에서 심장 위치까지 적절한 작동 거리를 조정하십시오.</li>
			<li>균일한 조명을 위해 자동 온도 조절 수조의 대각선 위치에 두 개의 LED를 배치하여 여기광을 생성하기 위한 530nm의 파장을 제공합니다. ET525/50 스퍼터 코팅 필터를 사용하여 LED의 대역 외 조명을 제거합니다.</li>
			<li>핸들 스위치를 조정하여 대상 표면의 동일한 정사각형을 달성하여 전압 및 칼슘 이미지가 획득 인터페이스에 적절하게 나타나도록 합니다.</li>
			<li>전압 또는 칼슘 신호의 누출을 방지하기 위해 렌즈의 조리개를 최대 직경으로 돌립니다.</li>
			<li>카메라 렌즈는 자동 온도 조절 수조에 미세한 작동 거리를 제공하므로 적절한 높이로 조정하며 대부분 10cm가 사용됩니다.</li>
			<li>-50°C에서 안정적인 샘플링 온도를 위해 카메라를 켭니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 절차
<ol><li>쥐 심장 채취, 캐뉼레이션 및 관류<ol><li>동물에게 아베르틴 용액(1.2%, 0.5-0.8mL)과 헤파린(200단위)을 복강내 주사하여 고통과 통증 반사를 최소화하고 혈전 형성을 예방합니다. 15분 후 자궁경부 탈구로 동물을 희생시킵니다.</li>
		<li>가위로 가슴을 열고 심장을 조심스럽게 채취하여 차가운 크렙스 용액(4°C, 95% O2, 5%CO2)에 넣어 신진대사를 늦추고 심장을 보호합니다.</li>
		<li>대동맥 주변 조직을 제거하고 맞춤형 캐뉼레이션 바늘(외경: 0.8mm, 내경: 0.6mm, 길이: 27mm)을 사용하여 대동맥을 캐뉼레이션하고 4-0 실크 봉합사로 고정합니다.</li>
		<li>Langendorff 시스템으로 심장에 3.5-4.0mL/분의 일정한 속도로 관류하고 온도를 37 ± 1 °C로 유지합니다. 참고: 모든 후속 절차는 이 조건에서 수행됩니다.</li>
		<li>작은 플라스틱 튜브(직경 0.7mm, 길이 20mm)를 좌심실에 삽입하여 챔버의 용액 혼잡을 해제하여 과부하를 방지합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>excitation-contraction 및 dual-dye loading의 Uncoupler<ol><li>두 개의 리드를 수조의 관류수에 넣고 ECG 증폭기 상자와 전기 자극 컨트롤러의 전원을 켠 다음 참조된 ECG 소프트웨어를 시작하고 ECG를 지속적으로 모니터링합니다.</li>
		<li>심장이 안정된 상태에 도달하면 어둠 속에서 후속 단계를 수행합니다(심장이 ~400bpm에서 리드미컬하게 뛰고 있음).</li>
		<li>50μL의 10mM 블레비스타틴 원액과 50mL의 크렙스 용액을 혼합하여 10μM의 농도에 도달합니다. 블레비스타틴-크렙스 용액 혼합물을 10분 동안 심장에 지속적으로 관류하여 흥분으로 인한 수축을 분리하고 촬영 중 수축 아티팩트를 방지합니다.</li>
		<li>수축이 염료 로딩 품질에 영향을 미치기 때문에 빨간색 손전등을 사용하여 심장 수축이 완전히 멈췄는지 확인하십시오.</li>
		<li>여기-수축을 분리한 후 50mL의 Krebs 용액에 15μL의 Rhod-2 AM 원액과 15μL의 Pluronic F127 원액을 혼합하여 0.267μM Rhod-2 AM 및 0.198μM Pluronic F127의 최종 농도를 얻습니다. 그런 다음 Langendorff 관류 시스템에서 Rhod-2 AM 작동 용액으로 15분 동안 심장을 지속적으로 관류합니다.</li>
		<li>세포 내 칼슘 염료 로딩 중에 산소 공급을 유지하십시오. Pluronic F127에서는 기포가 쉽게 형성되기 때문에 관류 시스템에 기포 트랩을 삽입하여 관상 동맥의 가스 색전술을 방지합니다.</li>
		<li>RH237 원액 10μL를 관류액 50mL에 희석하여 0.402μM의 최종 농도에 도달하고 10분 동안 로딩을 수행합니다.</li>
		<li>이중 염료 로딩이 끝나면 일련의 사진을 찍어 전압 및 칼슘 신호가 모두 분석에 적합한지 확인합니다(두 신호 간의 상호 작용 없음).</li>
	</ol></li>
	<li>광학 매핑 및 부정맥 유도 참고: 광학 매핑은 수축 중단 및 적절한 염료 로딩 후에 시작되며 심장은 위의 2.1(4)에서 설명한 단계에서와 같이 연속적으로 관류됩니다.<ol><li>여기 조명을 위해 두 개의 LED를 켜고 적절한 범위(조명과 비교적 간단한 촬영에 충분히 강하지만 과다 노출에 너무 강하지 않음)에서 강도를 조정합니다.</li>
		<li>심장을 감지 장치 아래에 놓고 두 개의 LED가 적절하게 비추는지 확인한 다음 광점 직경을 2cm로 조정합니다.</li>
		<li>렌즈에서 심장까지의 working distance를 10cm로 설정하여 거의 500Hz의 샘플링 속도와 픽셀당 120 x 120μm의 공간 해상도를 제공합니다.</li>
		<li>신호 샘플링 소프트웨어를 열어 카메라를 디지털 방식으로 제어하여 전압과 칼슘 신호를 동시에 캡처합니다.</li>
		<li>myopacer 필드 자극기를 시작하고 TTL(Transistor Transistor Logic)에서 페이싱 패턴, 각 펄스에 대한 2ms 페이싱 지속 시간, 초기 강도로 0.3V를 설정합니다.</li>
		<li>30개의 연속 10Hz S1 자극을 사용하여 ECG 기록 소프트웨어로 구동되는 심장의 이완기 전압 임계값을 테스트합니다. 점차적으로 증가tage amp1:1 캡처가 실현될 때까지 위폭을 조정합니다(ECG 모니터의 QRS 파동, 활동 전위(AP) 및 칼슘 과도 상태(CaT) 신호 확인).</li>
		<li>전압 임계값을 결정한 후 좌심실(LV) 정점(ELVA)의 심외막에 부착된 한 쌍의 백금 전극을 사용하여 이완기 전압 임계값의 2배 강도로 심장 속도를 조절합니다.</li>
		<li>S1S1 프로토콜을 구현하여 칼슘 또는 활동 전위 대체 물질 및 회복 특성을 측정합니다. 100ms의 기본 주기 길이로 심장을 연속적으로 페이스를 조절하고 50ms에 도달할 때까지 다음 시퀀스마다 주기 길이의 10ms를 줄입니다. 각 에피소드에는 2ms 펄스 폭의 30개의 연속 자극이 포함됩니다. 동시에 자극 전에 광학 매핑을 시작합니다(샘플링 시간에는 ~10개의 부비동 리듬 및 페이싱 기간이 포함됨).</li>
		<li>S1S2 자극 프로토콜을 사용하여 심실 유효 불응 기간(ERP)을 측정하려면 S1S1 페이싱 주기 길이 100ms로 시작하여 S2가 이소성 QRS 복합체를 포착하지 못할 때까지 2ms 단계 감소로 60ms에서 S2가 결합됩니다.</li>
		<li>부정맥 유도의 경우 영구 50Hz 버스트 페이싱(2ms 펄스 폭으로 50회 연속 전기 자극)을 수행하고 2초 간격의 휴식 후 동일한 페이싱 에피소드를 수행합니다.</li>
		<li>흥미로운 부정맥 ECG 파동이 생성될 때 동시 광학 매핑 기록이 즉시 시작될 수 있도록 연속 고주파 페이싱 기간 동안 ECG 기록을 주의 깊게 관찰하십시오(대부분의 심장 부정맥은 전기 페이싱에 의해 유도되기 때문에 광학 신호는 samp중요한 심장 사건을 잃는 경우 버스트 페이싱 2-3초 전에).</li>
		<li>EMCCD 카메라를 사용한 이미지(샘플링 속도: 500Hz, 픽셀 크기: 64 x 64).</li>
	</ol></li>
	<li>데이터 분석<ol><li>이미지 로딩 및 신호 처리<ol><li>폴더 선택 및 이미지 로드를 눌러 앞서 설명한 설정 및 프로토콜에 따라 반자동 대용량 비디오 데이터 분석을 위해 이미지 수집 소프트웨어에 이미지를 로드합니다15,16.</li>
			<li>올바른 샘플링 매개변수(예: Pixel Size 및 Framerate)를 입력합니다.</li>
			<li>수동 입력으로 이미지 임계값을 설정하고 관심 영역(ROI)을 선택합니다.</li>
			<li>3 x 3 픽셀 가우스 공간 필터, 사비츠키-골리 필터, top-hat 기준선 보정을 구현합니다.</li>
			<li>영상 처리를 눌러 기준선을 제거하고 APD80 및 CaTD50과 같은 전기생리학적 파라미터를 계산합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>전기생리학적 파라미터 분석<ol><li>APD80 계산을 위해 피크에서 APD의 시작 시간을 설정하고 80% 재분극(APD80)에서 단자점을 설정합니다. 마찬가지로 CaTD 시작 시간은 피크로 정의되고 터미널 포인트는 80% 완화로 정의됩니다.</li>
			<li>전도 속도(CV)의 측정은 픽셀 크기와 두 픽셀 이상의 활동 전위 전도 시간에 따라 달라집니다. 선택한 모든 픽셀의 평균 속도를 계산합니다 - 이것은 선택한 영역의 평균 전도 속도입니다. 전도 방향을 명확하게 볼 수 있도록 해당 등시간 맵을 동시에 생성합니다. 참고: O'Shea et al.15 는 CV 측정을 자세히 보고했습니다.</li>
			<li>alternans 및 부정맥 분석의 경우, calcium alternans는 번갈아 나타나는 연속적인 크고 작은 피크 진폭으로 정의됩니다. 피크 진폭 비율을 사용하여 주파수 종속 교류(1-A2/A1)의 심각도를 평가합니다. 심실 빈맥(VT)과 같은 복잡한 부정맥을 분석하기 위해 위상 맵을 적용합니다. 로터가 이동할 때 특정 영역에 뚜렷하게 나타나는 로터를 찾습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314(2021).</li>
<li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmogenesis%3A+a+tale+of+two+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li>
<li>Mal Baudot,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+%CE%B11D+and+T-type+Cav3.1+%CE%B11G+Ca2%2B+channels+disrupts+heart+automaticity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge%3A+Modulation+by+p21-activated+kinase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li>
<li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).</li>
<li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3%2F4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li>
</ol>

저자 중 누구도 선언할 이해 상충이 없습니다.

우리의 경험에 비추어 볼 때, 쥐 심장의 성공적인 이중 염료 광학 매핑의 핵심은 잘 준비된 솔루션과 심장, 염료 로딩, 최상의 신호 대 잡음비 달성 및 모션 아티팩트 감소입니다.
용액의 준비 크렙스 용액은 성공적인 심장 실험에 필수적입니다. MgCl 2및 CaCl 2 원액 (1 mol / L)은 수분 흡수를 고려하여 미리 준비되고 다른 모든 성분이 순수한 물에 용해 된 후 Krebs 용액에 첨가됩니다. Krebs 용액은 산소화를 보장하기 위해 최소 30분 동안 95% O 2/5% CO2로 기포됩니다. 쥐의 심장은 pH에 특히 민감하기 때문에 산소화 후 용액 pH는 약 7.4여야 합니다. 용액에 작은 입자가 있더라도 이러한 입자가 모세혈관을 차단하고 관류 효과에 영향을 줄 수 있기 때문에 실...

유전성 심장 질환 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥(PVT) 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실세동으로 악화될 수 있습니다 1,2,3,4 . 1995년 임상 증후군으로 처음 보고된 이후 최근의 증거는 7개의 유전자에 돌연변이가 있음을 시사했으며, 모두 이 상태에서 근질 망상(SR) 저장 Ca 2+ 방출에 관여했습니다: 가장 빈번하게 보고된 RYR2 인코딩 리아노딘 수용체 2(RyR2)의 Ca2+ 방출 채널5,6, FKBP12.67, CASQ2 인코딩 심장 calsequestrin8, TRDN 접합 SR 단백질 트리아딘9 및 CALM1 9, CALM2 10 및 CALM3 칼모듈린11,12를 동일하게 인코딩하는 인코딩. 이러한 유전형 패턴은 부정맥 사건을 SR 저장소 Ca2+12의 조절되지 않은 병리학적 방출에 기인합니다.
SR로부터의 자발적인 Ca 2+ 방출은 Ca 2+ 스파크 또는 Ca 2+ 파동으로 감지될 수 있으며, 이는 Na+/Ca 2+ 교환기(NCX)를 활성화합니다. 3 Na+에 대한 1 Ca의교환기 2 +는 내부 전류를 생성하여 이완기 탈분극을 가속화하고 멤브레인 전압을 활동 전위 (AP)의 임계 값으로 구동합니다. RyR2 knock-in 마우스에서, 동방 결절(SAN)에서 RyR2R4496C의 증가된 활성은 이완기 동안 I, Ca, L 및 SR Ca 2+ 고갈의 Ca2+ 의존적 감소에 의해 SAN 자동성의 예상치 못한 감소를 초래하여, CPVT 환자에서 SAN 기능 장애에 기여하는 세포 내 병태생리학적 변화를 확인한다13,14. 관련 심근세포 세포질 Ca 2+ 파의 발생은 이소프로테레놀(ISO)을 포함한 카테콜아민에 의한 RyR 감작 후 배경 세포질[Ca2+]의 증가에 따라 발생할 가능성이 더 높습니다.
온전한 심장 CPVT 모델에서 관찰된 심실 부정맥의 원인이 될 수 있는 활동 전위(AP) 활성화에 대한 반응으로 RyR2 매개 Ca 2+ 방출에 따른 Ca2+ 신호의 자세한 역학적 변화는 보고된 RyR2 유전자형12의 전체 범위에 대해 결정되어야 합니다. 이 논문은 이소프로테레놀 챌린지 전후에 프로그래밍된 전기 페이싱과 결합된 쥐 야생형(WT) 및 이형접합 RyR2-R2474S/+ 심장에서 Ca2+ 신호 및 막관통 전위(V, m)의 고처리량 매핑을 위한 기기 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 분리된 마우스 심장에서 CPVT 질병의 기계론적 연구를 위한 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>0.2 &무; m 주사기 필터</td><td>의료 기기 공장 Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>여과 용액</td></tr><tr><td>15 mL 원심 분리기 튜브</td><td>Guangzhou Jet Bio-filtration Co., Ltd. 중국</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 파스퇴르 피펫</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. 중국</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &뮤; L PCR 튜브</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. 상하이. 중국</td><td>F611541-0010</td><td>Aliquote 재고 솔루션&nbsp; 반복적인 동결 및 해동을 피하기 위해</td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Guangzhou Jet Bio-filtration Co., Ltd. 중국</td><td>CFT011500</td><td>스토어 Tyrode의 솔루션을 4 &deg; 후속 심장 격리를 위한 C</td></tr><tr><td>585/40nm 필터</td><td>Chroma Technology</td><td>칼슘 신호용</td><td>N/A</td> 필터</tr><tr><td>630nm 장역 통과 필터</td><td>크로마 기술</td><td>G15604AJ</td><td>전압 신호용 필터</td></tr><tr><td>Avertin(2,2,2-tribromoethanol)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom</td><td>T48402-100G</td><td>고통과 통증 반사를 최소화하기 위해</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States</td><td>SLBV5564</td><td>Excitation-contraction uncoupler to &nbsp; 매핑 중 모션 아티팩트 제거</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBK1794V</td><td>Tyrode의 솔루션</td></tr><tr><td>맞춤형 자동 온도 조절 수조</td><td>MappingLab, 영국</td><td>TBC-2.1</td><td>관류 용액</td></tr><tr><td>의 온도를 유지하기 위해디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>(RNBT7442)</td><td>염료용 용제</td></tr><tr><td>Dumont 집게</td><td>의료 기기 공장 Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>YAF030</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMap software</td><td>University of Birmingham</td> N<td>/A</td><td>전기 매개변수 정량화</td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Evolve 512 Delta, Photometrics, 투손, AZ, 미국</td><td></td><td>A18G150001 광 신호에 대한 이미지 획득</td></tr><tr><td>ET525/36 스퍼터 코팅 필터</td><td>크로마 기술</td><td>319106</td><td>여기 필터</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국</td><td>SLBT4811V</td><td>Tyrode의 솔루션</td></tr><tr><td>Heparin Sodium</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China</td><td>(H51021209)</td><td>관상 동맥의 혈전을 방지하기 위해</td></tr><tr><td>&nbsp; 홍채 겸자</td><td>의료 기기 공장 Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States</td><td>HY-B0468 / CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBS5003</td><td>Tyrode의 솔루션</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td><td>7355/7356</td><td>형광 프로브의 여기 광</td></tr><tr><td>MacroLED 광원</td><td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td><td>7352</td><td>LED 제어</td></tr><tr><td>Mayo 가위</td><td>의료 기기 공장 Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>광학 신호 샘플링</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 미국</td><td>BCBS6841V</td><td>Tyrode의 솔루션</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, 영국</td><td>M5337</td><td>전기 자극기와 Spike2 소프트웨어 연결</td></tr><tr><td>MyoPacer EP 필드 자극기</td><td>Ion Optix Co, Milton, MA, 미국</td><td>S006152</td><td>전기 자극기</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 미국</td><td>SLBS2340V</td><td>Tyrode의 솔루션</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>BCBW9042</td><td>Tyrode의 솔루션</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States</td><td>SLBX3605</td><td>Tyrode의 솔루션</td></tr><tr><td>NeuroLog System</td><td>Digitimer</td><td>NL905-229</td><td>ECG 증폭기</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, 영국</td><td>N/A</td><td>칼슘 대체 식품 및 부정맥 분석</td></tr><tr><td>안과 가위</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, United Kingdom</td><td>6970</td><td>Ca2+ 및 Vm&nbsp; 동시에</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, </td><td>BT100-2J</td><td>용액을 펌핑하려면</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국</td><td>1899021</td><td>Rhod2AM</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States</td><td>1971387</td><td>전압 민감 염료</td></tr><tr><td>Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국</td><td>1890519</td><td>칼슘 지시자</td></tr><tr><td>실리카 젤 관</td><td>더 긴 정밀도 펌프 Co., 주식 회사, 보정 중국,</td> <td>96402-16</td><td>연동 펌프와 연결하십시오</td></tr><tr><td>실크 봉합</td>사 <td>Yuankang Medical Instrument Co., 주식 회사 양저우, 중국</td><td>20172650032</td> 대<td>동맥 Spike2를 고치려면</td></tr><tr><td></td><td>Cambridge Electronic Design limited, 영국</td><td>N/A</td><td>ECG 데이터를 기록하고 분석하려면</td></tr><tr><td>자극 전극</td><td>MappingLab, 영국</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>크로마 기술</td><td>312461</td><td>광원용</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>크로마 기술</td><td>321343</td><td>광원용</td></tr></tbody></table>

catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia의 ryr2r2474s knock-in 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

부정맥성 심장 질환인 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥(CPVT)은 신체 활동, 스트레스 또는 카테콜아민 챌린지 후 다형성 심실 빈맥 에피소드로 나타나며, 잠재적으로 치명적인 심실 세동으로 악화될 수 있습니다. 마우스 심장은 CPVT를 포함한 유전성 심장 부정맥 질환을 모델링하는 데 널리 사용되는 종입니다. Langendorff 관류된 쥐 심장의 막관통 전위(Vm)와 칼슘 과도성(CaT)의 동시 광학 매핑은 부정맥 발생의 기전을 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 세포 수준 조사와 비교하여 광학 매핑 기술은 활성화, 전도 속도, 활동 전위 지속 시간 및 CaT 지속 시간 결정과 같은 일부 전기 생리학적 매개변수를 테스트할 수 있습니다. 이 논문은 이소프로테레놀 챌린지 전과 도중에 프로그래밍된 전기 페이싱과 결합된 쥐 야생형 및 이형접합 RyR2-R2474S/+ 심장에서 CaT 및 Vm의 고처리량 광학 매핑을 위한 기기 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 이 접근법은 생체 외 마우스 심장 제제에서 CPVT 질환을 기계적으로 연구하기 위한 실현 가능하고 신뢰할 수 있는 방법을 입증했습니다.

광학 매핑은 지난 10년 동안 복잡한 심장 부정맥을 연구하는 데 널리 사용되는 접근 방식이었습니다. 광학 매핑 설정은 EMCCD 카메라로 구성되며 각 픽셀에 대해 최대 1,000Hz의 샘플링 속도와 74 x 74μm의 공간 분해능을 제공합니다. 이를 통해 신호 샘플링 중에 다소 높은 신호 잡음비를 구현할 수 있습니다(그림 1). 랑겐도르프 관류된 심장이 안정된 상태에 도달하고 염료 로딩이 완료되면 심장은 전압 표시기 RH237 및 Ca2+ 표시기 Rhod-2 AM의 여기(excitation)에 사용되는 두 개의 530nm LED 조명 아래 동종 발열 챔버에 배치됩니다. 방출광은 600nm(Ca2+의 경우)와 670nm(V의 경우)의 두 가지 파장으로 나뉘며 EMCCD 카메라를 사용하여 동시에 감지됩니다. 15분 동안 아베르틴과 헤파린을 관류한 후 수술 기구(그림 2A)를 사용하여 흉부를 열고 심장을 빠르게 추출한 다음...

이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 분해능으로 막관통 전압 및 세포 내 Ca2+ 과도 현상의 전기 생리학적 측정을 포함하여 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥의 영향을 받는 야생형 및 녹인 동물에서 얻은 마우스 심장의 이중 염료 광학 매핑을 소개합니다.

Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

이 방법은 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥과 같은 질병과 관련된 심실 정지 도말의 전기 생리학적 특성과 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술을 사용하면 CPVT와 같은 심장 부정맥 질환의 기본 메커니즘과 역학을 탐구하는 데 특히 적합한 다양한 프로그래밍된 전기 페이싱 프로토콜에서 막 전위와 세포 간 칼슘 신호를 동시에 얻을 수 있습니다. 이 실험을 성공적으로 수행하려면 심장이 잘 관류되고, 염료가 적절하게 로딩되고, 여기-수축 분리가 이루어지고, 카메라가 세심하게 설정되어야 합니다.시작하려면 광학 매핑 시스템을 설정하고 영하 50도에서 안정적인 샘플링 온도를 위해 카메라를 켜십시오. 채취한 쥐의 심장을 차가운 CREB 용액에 넣어 신진대사를 늦추고 심장을 보호합니다. 대동맥의 주변 조직을 제거합니다.맞춤형 캐뉼레이션 바늘을 사용하여 캐뉼레이션하고 4-0 실크 봉합사로 고정합니다. 이제 분당 3.5-4.0밀리리터의 일정한 속도로 랑겐도르프 시스템으로 심장을 관류하십시오. 작은 플라스틱 튜브를 좌심실에 삽입하여 챔버의 용액 혼잡을 풀어 과부하를 방지하고 플라스틱 튜브를 캐뉼레이션 바늘에 고정합니다.그런 다음 두 개의 리드를 수조의 관류액에 넣고 심전도 증폭기 상자와 전기 자극 컨트롤러의 전원을 켭니다. 그런 다음 참조된 심전도 또는 ECG 소프트웨어를 시작하고 ECG를 지속적으로 모니터링합니다. 심장이 안정된 상태에 도달하면 어둠 속에서 후속 단계를 수행하십시오.블레비스타틴 CREBs 용액 혼합물을 10분 동안 심장에 지속적으로 관류하여 흥분으로 인한 수축을 분리하고 촬영 중 수축 인공물을 방지합니다. 그런 다음 빨간색 손전등을 사용하여 심장을 검사하여 수축이 완전히 멈췄는지 확인합니다. 여기 수축을 분리한 후 Langendorff 관류 시스템에서 15분 동안 Rhod-2 AM 작업 용액으로 심장을 관류합니다.세포 내 칼슘 염료 로딩 중에 산소 공급을 유지합니다. 플루로닉 F-127로 인한 기포 형성을 방지하려면 관류 시스템에 기포 트랩을 삽입하십시오. 10 마이크로 리터의 RH 237 원액을 50 밀리리터의 관류수에 희석하고 10 분 동안로드합니다.이중 염료 로딩이 완료되면 일련의 사진을 캡처합니다. 전압 및 칼슘 신호가 분석에 적합한지 확인합니다. 여기 조명을 위해 두 개의 LED를 켜고 강도를 적절한 범위로 조정합니다.심장을 감지 장치 아래에 놓고 광점 직경을 2cm로 조정하는 두 개의 LED로 심장이 잘 비추어지도록 합니다. 렌즈와 심장 사이의 작동 거리를 10cm로 설정하여 원하는 샘플링 속도와 공간 해상도를 얻을 수 있습니다. 신호 샘플링 소프트웨어를 열어 카메라를 동시에 제어하고 전압 및 칼슘 신호를 캡처할 수 있습니다.MyoPacer Field Stimulator를 시작하고 페이싱 패턴을 펄스당 2밀리초의 페이싱 지속 시간으로 트랜지스터 트랜지스터 로직으로 설정합니다. 초기 강도를 0.3볼트로 설정합니다. 좌심실 정점의 심외막에 부착된 한 쌍의 백금 전극을 배치합니다.ECG 기록 소프트웨어를 사용하여 심장의 이완기 전압 임계값을 테스트하기 위해 30회 연속 10Hz S1 자극을 적용합니다. 일대일 캡처가 이루어질 때까지 전압 진폭을 점차적으로 증가시킵니다. S1-S1 프로토콜을 구현하여 칼슘 또는 활동 전위 대체 물질 및 복원 특성을 측정합니다.100밀리초의 기본 주기 길이에서 시작하여 연속적으로 심장 페이스를 조절합니다. 주기 길이가 50밀리초에 도달할 때까지 각 후속 시퀀스에서 10밀리초씩 줄입니다. 자극 전에 광학 매핑을 동시에 시작합니다.S1-S2 자극 프로토콜을 사용하여 심실 유효 불응 기간을 측정하려면 100밀리초의 S1-S1 페이싱 주기 길이로 시작합니다. S2를 60밀리초에 결합하고 S2가 이소성 QRS 복합파를 포착하지 못할 때까지 2밀리초 스텝 감소로 감소시킵니다. 부정맥 유도를 위해 영구적인 50Hz 버스트 페이싱을 투여하고 2초 휴식 간격을 기다린 후 동일한 페이싱 에피소드를 수행합니다.지속적인 고주파 페이싱 기간 동안 심전도 기록을 주의 깊게 모니터링하여 흥미로운 부정맥이 생성될 때 즉시 동시 광학 매핑 기록을 시작합니다. 전자 곱셈 전하 결합 장치 카메라를 사용하여 이미지 캡처를 진행합니다. 이미지 수집 소프트웨어에서 폴더 선택을 누르고 이미지를 로드하여 반자동 대용량 비디오 데이터 분석 프로세스를 시작합니다.분석을 위해 올바른 표본 추출 매개 변수를 입력합니다. 이미지 임계값을 수동으로 설정하고 관심 영역을 선택합니다. 3x3 픽셀의 가우스 공간 필터, 사비츠키-골레이 필터, 모자 기준선 보정을 적용합니다.그런 다음 이미지 처리를 눌러 베이스라인을 제거하고 APD-80 및 CATD-50과 같은 전기생리학적 파라미터를 계산합니다. APD-80을 계산하기 위해 피크와 터미널 포인트에서 활동 전위 지속 시간의 시작 시간을 80% 재분극으로 설정합니다. 마찬가지로 칼슘 과도 지속 시간의 시작 시간을 터미널 포인트가 80% 이완인 피크로 정의합니다.APD-80 및 CATD-80의 히트 맵에 있는 일반적인 트레이스가 표시됩니다. 이소프로테레놀은 APD-80과 야생형 및 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥 또는 CPVT 마우스를 단축시키지만 이소프로테레놀 챌린지 후 차이는 발견되지 않았습니다. CATD-80 및 CPVT 마우스는 이소프로테레놀 챌린지 후 야생형보다 더 길었지만 처리 전에는 유의성이 없었습니다.전압 신호에 따르면, 야생형 심장과 CPVT 심장은 기준선과 이소프로테레놀 중재 후 심외막을 가로질러 동일한 전도 능력을 가졌습니다. 히트 맵은 CPVT 마우스가 이소프로테레놀 챌린지 전후에 야생형 마우스와 동일한 전도 능력을 가지고 있음을 보여주었습니다. 칼슘 진폭 대체 분석은 야생형 심장의 칼슘 신호가 14.29 및 16.67 헤르츠에서 연속적인 S1-S1 페이싱 동안 기준선에서 안정적으로 유지된 반면, CPVT 심장은 주파수 의존적 대체를 보였다는 것을 보여주었습니다.이소프로테레놀 챌린지 후, CPVT 심장은 S1-S1 페이싱 동안 주파수 의존적 대체 및 칼슘 신호를 나타낸 반면, 야생형 심장은 영향을 받지 않았습니다. 빈틈없는 부정맥 분석은 야생형 심장과 CPVT 심장 모두 기준선에서 50헤르츠 버스트 페이싱 동안 정상적인 전도를 나타낸다는 것을 시사했습니다. 이소프로테레놀을 투여한 후 CPVT 심장은 50헤르츠 버스트 페이싱 후 고주파 로터를 보인 반면, 야생형 심장은 정상적인 전도를 유지했습니다.이 절차에 따라, 아도겐형 및 야생형 마우스는 이러한 모델 또는 의약품의 발명에서 전기생리학적 및 기능적 특성을 설명하기 위해 사용됩니다. 광학 매핑은 심장 부정맥 연구를 위한 강력한 도구이지만 여기 수축 분리 하에서 형광 염료의 제한으로 인해 임상적으로 사용할 수 없습니다. 고혁명 계산 기술의 발전에 따라 다양한 표적 분자에 적합한 형광등이 개발됨에 따라 심장 광학 매핑 기술은 응용 분야만 달성할 수밖에 없습니다.

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생물학

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인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

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