Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

이 방법은 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥과 같은 질병과 관련된 심실 정지 도말의 전기 생리학적 특성과 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술을 사용하면 CPVT와 같은 심장 부정맥 질환의 기본 메커니즘과 역학을 탐구하는 데 특히 적합한 다양한 프로그래밍된 전기 페이싱 프로토콜에서 막 전위와 세포 간 칼슘 신호를 동시에 얻을 수 있습니다. 이 실험을 성공적으로 수행하려면 심장이 잘 관류되고, 염료가 적절하게 로딩되고, 여기-수축 분리가 이루어지고, 카메라가 세심하게 설정되어야 합니다.

시작하려면 광학 매핑 시스템을 설정하고 영하 50도에서 안정적인 샘플링 온도를 위해 카메라를 켜십시오. 채취한 쥐의 심장을 차가운 CREB 용액에 넣어 신진대사를 늦추고 심장을 보호합니다. 대동맥의 주변 조직을 제거합니다.

맞춤형 캐뉼레이션 바늘을 사용하여 캐뉼레이션하고 4-0 실크 봉합사로 고정합니다. 이제 분당 3.5-4.0밀리리터의 일정한 속도로 랑겐도르프 시스템으로 심장을 관류하십시오. 작은 플라스틱 튜브를 좌심실에 삽입하여 챔버의 용액 혼잡을 풀어 과부하를 방지하고 플라스틱 튜브를 캐뉼레이션 바늘에 고정합니다.

그런 다음 두 개의 리드를 수조의 관류액에 넣고 심전도 증폭기 상자와 전기 자극 컨트롤러의 전원을 켭니다. 그런 다음 참조된 심전도 또는 ECG 소프트웨어를 시작하고 ECG를 지속적으로 모니터링합니다. 심장이 안정된 상태에 도달하면 어둠 속에서 후속 단계를 수행하십시오.

블레비스타틴 CREBs 용액 혼합물을 10분 동안 심장에 지속적으로 관류하여 흥분으로 인한 수축을 분리하고 촬영 중 수축 인공물을 방지합니다. 그런 다음 빨간색 손전등을 사용하여 심장을 검사하여 수축이 완전히 멈췄는지 확인합니다. 여기 수축을 분리한 후 Langendorff 관류 시스템에서 15분 동안 Rhod-2 AM 작업 용액으로 심장을 관류합니다.

세포 내 칼슘 염료 로딩 중에 산소 공급을 유지합니다. 플루로닉 F-127로 인한 기포 형성을 방지하려면 관류 시스템에 기포 트랩을 삽입하십시오. 10 마이크로 리터의 RH 237 원액을 50 밀리리터의 관류수에 희석하고 10 분 동안로드합니다.

이중 염료 로딩이 완료되면 일련의 사진을 캡처합니다. 전압 및 칼슘 신호가 분석에 적합한지 확인합니다. 여기 조명을 위해 두 개의 LED를 켜고 강도를 적절한 범위로 조정합니다.

심장을 감지 장치 아래에 놓고 광점 직경을 2cm로 조정하는 두 개의 LED로 심장이 잘 비추어지도록 합니다. 렌즈와 심장 사이의 작동 거리를 10cm로 설정하여 원하는 샘플링 속도와 공간 해상도를 얻을 수 있습니다. 신호 샘플링 소프트웨어를 열어 카메라를 동시에 제어하고 전압 및 칼슘 신호를 캡처할 수 있습니다.

MyoPacer Field Stimulator를 시작하고 페이싱 패턴을 펄스당 2밀리초의 페이싱 지속 시간으로 트랜지스터 트랜지스터 로직으로 설정합니다. 초기 강도를 0.3볼트로 설정합니다. 좌심실 정점의 심외막에 부착된 한 쌍의 백금 전극을 배치합니다.

ECG 기록 소프트웨어를 사용하여 심장의 이완기 전압 임계값을 테스트하기 위해 30회 연속 10Hz S1 자극을 적용합니다. 일대일 캡처가 이루어질 때까지 전압 진폭을 점차적으로 증가시킵니다. S1-S1 프로토콜을 구현하여 칼슘 또는 활동 전위 대체 물질 및 복원 특성을 측정합니다.

100밀리초의 기본 주기 길이에서 시작하여 연속적으로 심장 페이스를 조절합니다. 주기 길이가 50밀리초에 도달할 때까지 각 후속 시퀀스에서 10밀리초씩 줄입니다. 자극 전에 광학 매핑을 동시에 시작합니다.

S1-S2 자극 프로토콜을 사용하여 심실 유효 불응 기간을 측정하려면 100밀리초의 S1-S1 페이싱 주기 길이로 시작합니다. S2를 60밀리초에 결합하고 S2가 이소성 QRS 복합파를 포착하지 못할 때까지 2밀리초 스텝 감소로 감소시킵니다. 부정맥 유도를 위해 영구적인 50Hz 버스트 페이싱을 투여하고 2초 휴식 간격을 기다린 후 동일한 페이싱 에피소드를 수행합니다.

지속적인 고주파 페이싱 기간 동안 심전도 기록을 주의 깊게 모니터링하여 흥미로운 부정맥이 생성될 때 즉시 동시 광학 매핑 기록을 시작합니다. 전자 곱셈 전하 결합 장치 카메라를 사용하여 이미지 캡처를 진행합니다. 이미지 수집 소프트웨어에서 폴더 선택을 누르고 이미지를 로드하여 반자동 대용량 비디오 데이터 분석 프로세스를 시작합니다.

분석을 위해 올바른 표본 추출 매개 변수를 입력합니다. 이미지 임계값을 수동으로 설정하고 관심 영역을 선택합니다. 3x3 픽셀의 가우스 공간 필터, 사비츠키-골레이 필터, 모자 기준선 보정을 적용합니다.

그런 다음 이미지 처리를 눌러 베이스라인을 제거하고 APD-80 및 CATD-50과 같은 전기생리학적 파라미터를 계산합니다. APD-80을 계산하기 위해 피크와 터미널 포인트에서 활동 전위 지속 시간의 시작 시간을 80% 재분극으로 설정합니다. 마찬가지로 칼슘 과도 지속 시간의 시작 시간을 터미널 포인트가 80% 이완인 피크로 정의합니다.

APD-80 및 CATD-80의 히트 맵에 있는 일반적인 트레이스가 표시됩니다. 이소프로테레놀은 APD-80과 야생형 및 카테콜아민성 다형성 심실 빈맥 또는 CPVT 마우스를 단축시키지만 이소프로테레놀 챌린지 후 차이는 발견되지 않았습니다. CATD-80 및 CPVT 마우스는 이소프로테레놀 챌린지 후 야생형보다 더 길었지만 처리 전에는 유의성이 없었습니다.

전압 신호에 따르면, 야생형 심장과 CPVT 심장은 기준선과 이소프로테레놀 중재 후 심외막을 가로질러 동일한 전도 능력을 가졌습니다. 히트 맵은 CPVT 마우스가 이소프로테레놀 챌린지 전후에 야생형 마우스와 동일한 전도 능력을 가지고 있음을 보여주었습니다. 칼슘 진폭 대체 분석은 야생형 심장의 칼슘 신호가 14.29 및 16.67 헤르츠에서 연속적인 S1-S1 페이싱 동안 기준선에서 안정적으로 유지된 반면, CPVT 심장은 주파수 의존적 대체를 보였다는 것을 보여주었습니다.

이소프로테레놀 챌린지 후, CPVT 심장은 S1-S1 페이싱 동안 주파수 의존적 대체 및 칼슘 신호를 나타낸 반면, 야생형 심장은 영향을 받지 않았습니다. 빈틈없는 부정맥 분석은 야생형 심장과 CPVT 심장 모두 기준선에서 50헤르츠 버스트 페이싱 동안 정상적인 전도를 나타낸다는 것을 시사했습니다. 이소프로테레놀을 투여한 후 CPVT 심장은 50헤르츠 버스트 페이싱 후 고주파 로터를 보인 반면, 야생형 심장은 정상적인 전도를 유지했습니다.

이 절차에 따라, 아도겐형 및 야생형 마우스는 이러한 모델 또는 의약품의 발명에서 전기생리학적 및 기능적 특성을 설명하기 위해 사용됩니다. 광학 매핑은 심장 부정맥 연구를 위한 강력한 도구이지만 여기 수축 분리 하에서 형광 염료의 제한으로 인해 임상적으로 사용할 수 없습니다. 고혁명 계산 기술의 발전에 따라 다양한 표적 분자에 적합한 형광등이 개발됨에 따라 심장 광학 매핑 기술은 응용 분야만 달성할 수밖에 없습니다.