Name: 3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 배우세요 3차원 현탁 생물반응기를 활용한 인간 유도만능줄기세포 유래 뉴런의 고효율 분화 프로토콜. 이 방법은 신경과학 연구 및 대규모 약물 스크리닝에 활용될 수 있습니다.

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EBiSC2 프로젝트는 보조금 계약 No 821362에 따라 Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU)으로부터 자금을 지원 받았습니다. JU는 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램과 EFPIA의 지원을 받습니다. 면역세포화학 및 유전자 발현 분석에 도움을 주신 Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters, Vanessa M. Nalewaja와 탁월한 기술 지원을 아끼지 않은 Heike Arthen에게 감사드립니다. 또한 생물 반응기 프로그램을 설립 한 Stephanie Bur에게 감사드립니다. 그림 2A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

참고: 모든 세포 조작과 배양 접시 및 배지 준비는 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 층류 후드는 사용 전과 가공 후에 모든 표면을 70% 에탄올로 닦아 철저히 청소해야 합니다. 설명된 프로토콜은 CERO 3D 인큐베이터 및 바이오리액터(이하 벤치탑 바이오리액터라고 함)의 신경 분화에 최적화되어 있습니다. 이 탁상용 바이오리액터는 각각 최대 용량이 50mL인 특수 바이오리액터 튜브를 위한 4개의 슬롯을 제공합니다. 온도 및CO2 수준은 연속적으로 제어되고, 배양 파라미터(예를 들어, 회전 속도 및 시간)는 각 튜브에 대해 독립적으로 조절된다. 모든 흡인 단계는 달리 명시되지 않은 경우 흡인 피펫과 진공 펌프를 사용하여 수행되었습니다.
1. hiPSC의 배양 및 확장
참고: 엔지니어링된 독시사이클린 유도성 NGN2 hiPSC 라인 BIONi010-C-13이 이 프로토콜에 사용됩니다. 여기에 제공된 확장 프로토콜은 6cm 페트리 접시에 최적화되어 있지만 원하는 경우 대체 배양 형식을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>차가운 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)/F12(-/-)에 최종 농도 0.083mg/mL/10cm2로 희석한 기저막 매트릭스로 6cm 페트리 접시를 코팅합니다. 코팅된 접시를 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다. 참고: 기저막 매트릭스 용액 준비에 대한 자세한 프로토콜은 제조업체의 지침에서 찾을 수 있습니다. hiPSC는 확장을 위해 대체 세포외 매트릭스에서 배양할 수 있습니다.</li>
	<li>EBiSC 세포주 사용자 프로토콜21 에 따라 냉동보존된 hiPSC를 피더가 없는 iPSC 유지 배지 + 10μM ROCK 억제제(Y-27632)에서 해동합니다. 60mm 접시 당 1 ×10 6 개의 생존 가능한 세포의 파종 밀도가 권장됩니다.</li>
	<li>다음날 배지를 ROCK 억제제가 없는 피더가 없는 iPSC 유지 배지로 변경하고 매일 배지 교체를 수행합니다.</li>
	<li>hiPSC 배양이 60%-80%의 합류점에 도달하면 계대배양을 시작합니다. 차별화된 영역을 확인하고 면적이 5%를 초과하는 경우 콜로니를 수동으로 청소합니다. 참고: 미분화 hiPSC는 두드러진 핵소체와 더 적은 세포질을 가진 둥근 세포로 나타납니다. 평평하고 빽빽하게 채워진 식민지는 해동 또는 통과 후 일찍 형성됩니다. hiPSC 배양의 예시적인 명시야 이미지는 그림 1에 나와 있습니다. 추가 정보는 EBiSC 세포주 사용자 프로토콜21에 제공됩니다. 통과를 위해 기저막 매트릭스 코팅 접시와 피더가 없는 iPSC 유지 관리 매체를 준비합니다.</li>
	<li>hiPSC 배양물로부터 배지를 흡인하고, Ca 2+ 및 Mg2+가 없는 1x 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS) 중의 0.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 세포를 2배 헹굽니다(DPS [-/-], 재료 표 참조).</li>
	<li>상층액을 제거하고 2cm 페트리 접시에 0.5x DPBS(-/-)에 1mM EDTA 6mL를 추가합니다. 세포를 인큐베이터에서 3분 동안 37°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>EDTA 용액 1.5mL를 흡인하고 3-5분 동안 계속 배양합니다.</li>
	<li>세포 분리를 용이하게 하기 위해 접시를 부드럽게 두드리십시오. 알림: 시각적 평가로 분리를 확인하십시오. hiPSC 콜로니는 5분 후에 분리되기 시작해야 하지만 더 높은 융합 hiPSC 배양에서는 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다. 콜로니가 분리되지 않으면 배양 시간을 10분까지 늘리되 이 시간을 초과하지 마십시오.</li>
	<li>5mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지를 6cm 페트리 접시에 추가하고 10mL 혈청학적 피펫 또는 광구경 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 2배 부드럽게 재현탁합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮깁니다. 참고: hiPSC는 기계적 응력에 매우 민감합니다. 따라서 여러 번 다시 일시 중단하는 것은 피해야 합니다. 최종 세포 현탁액은 작은 콜로니 단편 (50-200 μm)으로 구성되어야합니다.</li>
	<li>코팅된 배양 접시에서 상층액을 흡인하고 6cm 접시당 4mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지를 준비합니다.</li>
	<li>작은 콜로니 조각을 1:10에서 1:40의 분할 비율로 갓 준비된 배양 접시에 옮기고 매일 배지를 교체하면서 37°C 및 5%CO2 에서 배양합니다. 참고: 작은 집락은 통과 후 1-2시간 이내에 부착해야 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig01.jpg"> 그림 1: 인간 유도 만능 줄기 세포 배양의 형태. (A,B) 균질한 형태와 정의된 가장자리를 가진 압축된 hiPSC 콜로니를 보여주는 다양한 합류점의 양질의 hiPSC 배양. (c) 콜로니 가장자리 주위에 분화된 세포의 신흥 클러스터가 있는 hiPSC 배양(흰색 점선). 스케일 바 = 200 μm. 약어: hiPSC = 인간 유도 만능 줄기 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 벤치탑 바이오리액터 시스템에서 hiPSC의 사전 배양(2일차)
참고: hiPSC 배양이 60%에서 80% 사이의 합류점에 도달하면 사전 배양을 시작합니다. 차별화된 영역에 대한 hiPSC 콜로니를 확인합니다. 이 재배 전 단계에서 hiPSC는 피더가 없는 iPSC 유지 배지에서 2일 동안 유지됩니다.
<ol><li>피더가 없는 iPSC 유지 배지와 10μM ROCK 억제제(Y-27632)로 구성된 배양 배지를 준비합니다.</li>
	<li>hiPSC에서 배지를 완전히 흡인하고 1x DPBS(-/-)로 세포를 두 번 부드럽게 헹굽니다.</li>
	<li>예열된 트립신-EDTA 용액 2.0mL를 6cm 페트리 접시에 넣고 배양기에서 37°C에서 3분 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>세포 분리를 용이하게 하기 위해 접시를 부드럽게 두드리거나 1-2분 더 배양합니다.</li>
	<li>접시당 5mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지 + ROCK 억제제에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 15mL 또는 50mL 튜브로 옮기고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 세포 특이화를 보장합니다.</li>
	<li>앞서 설명한 바와 같이 자동 세포 계수기를 사용하여 100 μL의 세포 현탁액에서 세포 번호를 결정하십시오20. 바이오리액터 튜브당 15 ×10 6 셀에 해당하는 부피를 50 mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>세포를 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 2mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지 + ROCK 억제제에 세포를 재현탁합니다.</li>
	<li>각 50mL 튜브에 18mL의 배지(세포 파종 밀도 0.75 × 106 cells/mL)를 채웁니다. 세포 현탁액을 생물반응기 튜브(튜브당 20mL)에 분주합니다.</li>
	<li>튜브를 생물 반응기 시스템에 넣습니다. 다음 배양 파라미터를 설정한다: 2초 회전 주기, 60 rpm 회전 속도, 교반 휴지 없음, 37°C, 및 무제한 지속 시간동안 5%CO2 20.</li>
	<li>바이오리액터 디스플레이를 통해 배양 프로그램을 시작합니다.</li>
	<li>다음날 미디어를 교체하십시오. 응집체가 ~5분 동안 생물반응기 튜브에 가라앉도록 합니다. 상층액을 조심스럽게 흡인하십시오. 알림: 응집체가 서로 달라붙어 이질적인 골재 현탁액을 만들 수 있으므로 10분 이상 침전시키지 마십시오. 생물 반응기 튜브에 ~5mL의 배양 배지를 그대로 두는 것이 좋습니다.</li>
	<li>튜브당 ROCK 억제제가 없는 신선한 피더가 없는 iPSC 유지 배지 15mL를 추가하고 벤치탑 바이오리액터에서 24시간 동안 배양을 계속합니다.</li>
</ol>3. hiPSC의 초기 뉴런으로의 분화(0일)
<ol><li>신경기저 배지(NBM) 준비: 안정화된 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드가 포함된 50% DMEM/F-12, 50% 신경기저 배지, 0.5x 무혈청 보충제(50x), 0.5x 무혈청 보충제 보텐슈타인의 N-1 제형(100x), 0.5x 안정화된 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드, 0.5x MEM 비필수 아미노산 용액(100x), 500nM 피루브산나트륨(100mM), 50nM 2-메르캅토에탄올(50mM), 0.025% 인간 인슐린 용액 및 5U/mL 페니실린-스트렙토마이신. 알림: NBM은 4°C에서 보관해야 하며 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>hiPSC 배양에 독시사이클린(DOX)을 추가하여 신경 분화를 시작합니다. 이를 위해 응집체가 생물 반응기 튜브에 침전되도록하십시오. 튜브에 ~5mL를 남기고 세포에서 상층액을 조심스럽게 흡인하고 NBM과 2μg/mL DOX로 구성된 신경 유도 배지(NIM) 35mL를 추가합니다. 알림: DOX는 빛에 민감하므로 작업 중에는 조명을 끄는 것이 좋습니다.</li>
	<li>튜브를 벤치탑 생물반응기에 다시 넣고 배양을 계속합니다.</li>
	<li>3.2단계에 설명된 대로 2일 동안 매일 미디어 변경을 수행합니다. 참고: 현탁 배양에서 4일 후, 응집체는 해리될 수 있고, 초기 뉴런은 냉동 보존되거나 말단 성숙을 위해 직접 재도금될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 초기 뉴런의 냉동보존(2일차)
참고: 냉동 보존은 분화 과정에 필요하지 않으며 중요하지도 않지만 후속 성숙 및 분석을 위해 초기 뉴런의 대량 생산 및 저장이 가능하므로 적극 권장됩니다.
<ol><li>응집체가 생물 반응기 튜브에 침전되도록하십시오. 앞서 설명한 대로 상층액을 흡인합니다.</li>
	<li>응집체를 멸균된 15mL 또는 50mL 튜브로 옮기고 1x DPBS(-/-)로 응집체를 2배 부드럽게 헹굽니다. 응집체를 방해하지 않고 가능한 한 상층액을 조심스럽게 흡인하십시오.</li>
	<li>펠릿 크기에 따라 예열된 세포 해리 효소 2-5mL를 첨가하고 수조에서 37°C에서 약 10분 동안 세포를 배양합니다. 응집체가 해리될 때까지 2분마다 침전된 골재를 부드럽게 다시 부유시킵니다. 참고: 배양 7-10분 후에 거의 균질한 세포 현탁액을 얻어야 합니다.</li>
	<li>예열된 NBM 배지의 3배 부피를 추가하고 세포 특이화를 보장하기 위해 세포를 조심스럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>세포 번호를 결정하고 냉동 보존을 위해 해당 부피를 15mL 또는 50mL 튜브에 옮깁니다. 알림: 동결 배지의 5-10 ×10 6 cells/mL의 세포 밀도가 권장됩니다.</li>
	<li>세포를 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>상청액을 흡인하고 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 함유하는 해당 부피의 동결 배지에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.</li>
	<li>냉동 보존에 적합한 바이알(1mL/바이알)에 세포 현탁액을 분취합니다.</li>
	<li>바이알을 즉시 2-프로판올로 채워진 사전 냉장된 저속 냉동 용기로 옮기고 용기를 -80°C에서 밤새 두십시오. 장기 보관을 위해 다음날 바이알을 -150°C에 두십시오. 알림: 액체 2-프로판올은 가연성이 높으며 접촉 시 눈에 손상을 줄 수 있습니다. 열을 피하고 보호 장갑과 안경을 착용하십시오.</li>
</ol>5. 단층 배양에서 hiPSC 유래 뉴런의 성숙
<ol><li>hiPSC 유래 뉴런의 장기 배양을 위해 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 배양 접시를 준비합니다.<ol><li>폴리-L-오르니틴 원액을 1x DPBS(-/-)에서 0.001%로 희석하고 4°C에서 밤새 또는 37°C에서 4시간 동안 접시를 코팅합니다. 폴리-L-오르니틴 용액을 흡인하고 플레이트를 1x DPBS(-/-)로 한 번 세척합니다.</li>
		<li>라미닌 용액을 1x DPBS(-/-)에 최종 농도 10μg/mL로 희석하고 접시를 4°C에서 밤새 또는 37°C에서 4시간 동안 배양합니다. 알림: 코팅 절차에는 cm2당 0.1-0.15mL의 부피가 권장되고 모든 세척 단계에는cm2당 0.2mL가 권장됩니다. 대체 코팅 기질을 사용할 수 있지만 세포 부착 및 성숙에 대한 잠재적 영향을 평가해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>냉동보존된 세포를 해동합니다. 이를 위해 극저온 오빌을 수조(37°C로 설정)에 넣고 냉동 세포 현탁액의 작은 덩어리가 남을 때까지 약 1분 동안 소용돌이칩니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 10mL의 예열된 NBM으로 준비된 15mL 튜브에 조심스럽게 적가합니다. 1mL의 NBM으로 극저온 난을 헹구고 세포 현탁액을 동일한 15mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>세포를 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>상청액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 NIM 1-2mL를 추가합니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁하고 세포 번호를 결정하십시오.</li>
	<li>코팅된 세포 배양 접시에서 남은 라미닌 용액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 NIM에서 1× 5 cells/cm2 의 파종 밀도로 세포를 시딩합니다.</li>
	<li>24시간 후 배지를 ROCK 억제제 없이 NIM으로 전환합니다.</li>
	<li>4 일 동안 매일 매체 변경을 수행하십시오.</li>
	<li>NGN2 유도의 초기 단계 후, DOX를 생략하고 원하는 성숙 단계에 도달할 때까지 일주일에 2회 하프 배지를 교체하면서 NBM에서 세포를 배양합니다. 참고: iNGN2 뉴런과 성상교세포의 공배양은 세포 생존, 부착, 성숙 및 전기적 활동을 증가시키는 것이 좋습니다13,22.</li>
</ol>6. hiPSC 유래 뉴런의 특성화
참고: 뉴런 유도체로의 분화는 다음 기술로 평가할 수 있습니다.
<ol><li>면역세포화학 및 이미징<ol><li>hiPSC 유래 뉴런에서 배지를 흡인하고Ca2+ 및 Mg2+ (+/+)가 있는 1x DPBS로 세포를 한 번 세척합니다. 알림: 세포가 표면에서 매우 쉽게 분리될 수 있으므로 우선적으로 웰 가장자리에 조심스럽게 피펫을 끼우십시오. 0.2x DPBS(+/+)로 세포의 완전한 커버리지를 보장하기 위해 모든 세척 단계에 cm2 당 2mL의 부피가 권장됩니다.</li>
		<li>상온(RT)에서 15분 동안 DPBS 중 4% 파라포름알데히드(+/+)를 함유한 고정 용액을 사용하여 신경세포를 고정한다. cm2 당 0.1mL의 부피가 권장됩니다. 참고: DPBS의 파라포름알데히드(4%)는 급성 독성 및 잠재적인 발암성이 있는 유해하고 피부 자극적인 용액입니다. 열을 피하고 보호 장갑과 안경을 착용하고 흡입을 피하고 통풍이 잘되는 환경에서만 용액을 사용하십시오.</li>
		<li>세포를 1x DPBS(+/+)로 2배 부드럽게 헹구고 염색을 진행합니다. 알림: 고정 셀은 추가 처리가 있을 때까지 최대 4개월 동안 1°C에서 DPBS(+/+)에 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>샘플에서 DPBS(+/+)를 흡인합니다. RT에서 60분 동안 1% BSA 및 0.2% Triton-X-100을 포함하는 1x DPBS(+/+)로 세포를 투과시키고 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 참고: cm2 당 0.2mL의 부피를 권장합니다.</li>
		<li>상청액을 제거하고, 각각의 1차 항체를 염색 완충액(1% BSA를 함유하는 1x DPBS[+/+])에 희석하여 4°C에서 밤새 세포를 인큐베이션한다( 물질 표 참조). 세포가 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 참고: cm2 당 0.1-0.15mL의 부피가 권장됩니다.</li>
		<li>염색 완충액을 흡인하고 세포를 1x DPBS(+/+)로 3배 헹굽니다.</li>
		<li>해당 2차 항체( 재료 표 참조)를 염색 완충액에 1:1,000의 최종 농도로 희석합니다.</li>
		<li>어둠 속의 RT에서 1시간 동안 희석된 항체 용액에서 세포를 배양합니다. 세포가 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 참고: cm2 당 0.1-0.15mL의 부피가 권장됩니다.</li>
		<li>2차 항체 용액을 흡인하고 세포를 1x DPBS(+/+)로 2배 헹굽니다.</li>
		<li>RT에서 5분 동안 DPBS(+/+)로 희석한 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 핵을 반대 염색합니다. 참고: cm2 당 0.1-0.15mL의 작업 부피가 권장됩니다.</li>
		<li>세포를 2x DPBS(+/+)로 1배 헹굽니다.</li>
		<li>이미징될 때까지 4°C에서 DPBS(+/+)에 세포를 보관합니다. 참고: 명시야 영상은 형태학적 변화와 신경돌기 성장을 추적하는 데 적합합니다. 또한, 입체형 마커 발현은 형광 현미경에 의해 평가될 수 있다. 미분화 hiPSC는 OCT 3/4 및 NANOG를 발현하지만 베타-III-튜불린(TUBB3) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2)는 신경돌기 및 축삭을 시각화하기 위한 신경 마커 역할을 할 수 있습니다. 신경돌기 네트워크는 명시야 또는 형광 이미지에서 신경돌기 길이를 결정하여 추가로 평가할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)에 의한 유전자 발현 분석<ol><li>배지를 흡인하고 세포를 1x DPBS(-/-)로 한 번 헹굽니다. 참고: cm2 당 0.2mL의 부피를 권장합니다.</li>
		<li>차가운 RNA 용해 완충액을 추가하고 긁어서 세포를 수확합니다.</li>
		<li>적합한 컬럼 기반 키트를 사용하여 RNA를 분리하고, UV 광분광법으로 RNA 농도를 결정한다.</li>
		<li>총 RNA 250ng과 역전사에 적합한 키트를 사용하여 cDNA를 생성합니다.</li>
		<li>2.5ng의 cDNA를 이중으로 포함하는 분자 비콘 qPCR 반응을 준비합니다. 적절한 마스터 믹스 및 해당 프라이머 분석(20 )을 사용한다( 재료 표 참조).</li>
		<li>60°C에서 20초 동안 프라이머 어닐링과 함께 45 사이클을 적용하여 qPCR을 실행합니다.</li>
		<li>상대적 유전자 발현 수준을 하우스키핑 유전자 GAPDH, HPRT1 및 GUSB의 평균으로 정규화합니다. 미분화 hiPSC를 교정기로 사용하여 ΔΔCt 방법23을 적용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

뉴런 전사 인자 NGN2의 이소성 발현은 이전에 뉴런 분화의 초기 단계를 가속화하고 배양 후 1주일 이내에 hiPSC에서 뉴런 계통 투입을 유도하는 것으로 나타났습니다12,13,20. 이 연구는 벤치탑 바이오리액터를 사용하여 유전자 편집 BIONi010-C-13 hiPSC를 iNGN2 뉴런으로 분화하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
CERO 3D 바이오리액터는 각각 최대 용량이 50mL인 특수 튜브용 슬롯 4개가 있는 저용량 바이오리액터입니다. 온도 및CO2 수준은 지속적으로 제어되고 배양 매개변수(예: 회전 속도 및 시간)는 각 튜브에 대해 조절되어 사용자가 독립적으로 여러 차별화 접근 방식을 병렬로 실행할 수 있습니다. 내부 튜브 벽에 통합된 웨이브브레이커는 낮은 전단 응력으로 매체의 섭동을 허용하고 제어된 회전 중에 서스펜션에서 3D 응집체를 유지합니다. 영양분에 대한 제한된 접근과 강제적인 3D 세포-세포 및 세포-세포외 기질(ECM) 상호작용은 세포 분화 및 행동에 상당한 영향을 미칠 수 있다24,25,26,27.
현탁액에서 3D 응집체로 세포를 배양하면 이러한 세포 상호 작용이 증가하여 조직 또는 기관의 생체 내 환경을 보다 밀접하게 모방합니다28. 매질의 수반되는 섭동은 기계적 마찰로 인한 응집체 크기를 조절하고, 가스 교환을 개선하며, 응집체 내부의 생리학적 관련 구배를 유지하면서 튜브 내의 영양분과 폐기물의 구배를 감소시킵니다 29,30,31,32,33,34. 배지 변경은 수동으로 수행되지만 탁상용 바이오리액터는 정적 배양 플라스크에 비해 인건비와 운영 비용을 절감합니다. 바이오리액터는 또한 임펠러가 없는 설계가 응집체 표면의 유체역학적 전단 응력을 감소시켜 세포 생존을 개선할 뿐만 아니라 민감한 iPSC, 세포 분화 및 기능에 대한 전단 응력의 영향을 제한하기 때문에 완전 자동화된 교반 탱크 바이오리액터에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다(35,36,37,38).
대형 수직 임펠러에 의해 세포가 교반되는 수직 휠 바이오리액터와 전동 플랫폼에 부착된 팽창된 배양 백을 사용하는 락킹 모션 바이오리액터는 대체 3D 서스펜션 플랫폼을 나타냅니다. hiPSC 17,18,19,39,40 의 배양에 대해 과도하게 테스트되었지만, 신경 분화 접근법에서의 적용 가능성에 대해서는 알려진 바가 거의 없으며, 보고는 교반 탱크 생물반응기 41,42,43,44에서 포유류 및 인간 신경 전구체 세포의 성공적인 확장에 국한되며, 드문 수의 연구에 초점을 맞추고 있습니다. 성숙44,45. 일반적으로 자동화된 3D 서스펜션 플랫폼은 완전 자동화 및 컴퓨터 제어 매체 변경의 이점을 제공하여 취급 변동을 줄이고 오염 위험을 최소화합니다. 또한 젖산 및 포도당 농도와 같은 영양소 파라미터를 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 그러나 이러한 시스템을 구축하려면 상당한 초기 투자, 실험실 공간 및 자격을 갖춘 인력 교육이 필요한 경우가 많습니다. 탁상용 바이오리액터는 현탁액에서 세포를 배양하기 위한 작고 사용하기 쉬운 대안이지만 영양소의 동시 모니터링을 제공하지는 않습니다.
3D 현탁액 플랫폼에서 세포 배양에 사용되는 대부분의 프로토콜에서와 같이, 응집체의 초기 형성은 중요한 단계를 나타냅니다. hiPSC는 부착성 단층으로 배양된 후 단일 세포 현탁액으로 3D 환경으로 옮겨집니다. 이 단계에서 세포 손실을 최소화하려면 몇 가지 측면을 고려해야 합니다. 통합 웨이브브레이커가 있는 튜브의 설계는 최적의 배지 섭동을 보장하기 위해 튜브당 최소 10mL의 배양 부피가 필요하다는 것을 의미합니다. 따라서 임계 볼륨이 장기간에 걸쳐 감소해서는 안 됩니다. 또한, 배양 부피 10mL당 750만 개의 세포와 60rpm의 회전 속도의 시작 파종 밀도는 세포주에 따라 적응이 필요할 수 있지만 단기간에 안정적인 응집체를 형성하는 데 적극 권장됩니다.
hiPSC를 현탁액으로 옮긴 후 24시간 이내에 응집체를 형성해야 합니다. 첫 번째 중간 변화는 응집체가 작고 제대로 정착되지 않을 수 있으므로 중요합니다. 응집체의 침전 시간은 연장될 수 있지만 응집체가 이질적인 방식으로 뭉치고 성장하기 시작할 수 있으므로 10분을 초과해서는 안 됩니다. 흡인하는 동안 튜브에 최소 5mL의 배양 부피를 남겨 두어야 하며 배지의 섭동을 피해야 합니다. 그럼에도 불구하고 초기 단계에서 세포와 응집체의 손실이 예상됩니다. 세포 수는 배양 첫 2일 동안 일정한 세포 수율을 나타내며, 이는 hiPSC의 높은 증식 능력이 초기 세포 손실을 보상한다는 것을 나타냅니다. 일단 현탁 상태에 들어가면 부드러운 재배와 섭동으로 인해 시간이 지남에 따라 성장하기 시작하는 균일한 크기의 응집체가 생성됩니다.
뉴런 분화는 독시사이클린 유도 NGN2 과발현13에 기초하여 이전에 발표된 프로토콜에 따라 수행되었고, 개별 단계는 3D 배양을 위해 최적화되었다. 뉴런 전사 인자 NGN2는 뉴런 분화에서 잘 설명된 동인이며 뉴런 유도를 유의하게 가속화합니다11,13,46. 정의된 성장 인자를 사용한 기존의 패터닝은 몇 주에서수개월이 걸리지만 7,8,9, NGN2 발현은 수일 내에 신경 세포의 운명을 유도합니다. 단축된 배양 시간 외에도 프로토콜은 초기 현탁 배양을 위해 값비싼 성장 인자나 코팅 매트릭스에 의존하지 않으므로 재배 비용을 추가로 절감할 수 있습니다.
또한, 부착 및 현탁 배양에서 NGN2 구동 미성숙 뉴런 생성을 직접 비교한 결과, 벤치탑 바이오리액터20을 사용한 배양에서 4일 후 세포가 1.36배 증가한 반면, 100만 개의 세포 생성에 필요한 배지의 부피는 절반으로 줄어들 것으로 예상됩니다. 따라서 iNGN2 뉴런 생성을 위해 벤치탑 바이오리액터를 사용하는 것이 더 낮은 처리 시간과 비용으로 더 많은 수의 세포를 생산할 수 있기 때문에 도움이 될 수 있습니다. 이전 보고서와 일치하여 뉴런 혈통 헌신이 초기에 관찰되었습니다. NGN2 유도 2일 후, TUBB3, MAP2 및 MAPT와 같은 고전적인 신경 마커의 심오한 발현이 분명했으며, 이는 신경 유도를 위한 벤치탑 생물반응기의 적용 가능성을 뒷받침합니다. 이 프로토콜에 따라 배양 4일 이내에 100만 개의 hiPSC에서 약 620만 개의 미성숙 iNGN2 뉴런을 얻을 수 있습니다. 그러나 출력 용량은 배치에 따라 다를 수 있으며 파종 시 현탁 배양량에 따라 달라질 수 있습니다.
수확량을 더 증가시키기 위해, 재배 시간을 추가로 3 일 연장 하였다; 그러나 응집체가 커졌음에도 불구하고 매우 조밀해졌으며 냉동 보존 또는 재도금을 위해 적절하게 해리될 수 없었습니다. 3D 배양 접근법의 발전에도 불구하고 부착성 2D 신경 배양은 여전히 미세 전극 어레이 또는 칼슘 이미징과 같은 기능 분석의 황금 표준입니다. 따라서 세포 특이화는 균질하게 분포된 뉴런 단층 및 신경돌기 네트워크를 위한 중요한 전제 조건입니다. 세포의 더 강력한 기계적 분리 또는 가혹한 해리 시약은 특이화를 보장하기 위해 사용될 수 있지만 세포 생존력, 생리학 및 재부착 능력에 잠재적인 영향을 미칠 수 있습니다47,48. 추가 분석 및 성숙을 위한 단일세포의 필요성과 관련하여, 응집체는 현탁액에서 4일 후에 해리되었고, (2일째) iNGN2 뉴런을 냉동보존하였다. iNGN2 뉴런의 해동 후 분화 및 특성화는 뉴런 배양의 성숙도 증가와 조밀한 신경암 네트워크의 형성을 확인했습니다.
제공된 프로토콜은 많은 수의 iNGN2 뉴런을 생성합니다. 그러나 몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 대부분의 현탁 배양 플랫폼의 경우, 2D 부착 배양에서 3D 환경으로 hiPSC를 전달하는 것이 중요하며 종종 심각한 세포 손실과 관련이 있습니다. 배지 교체 중에 더 많은 셀 및 응집체 손실이 예상됩니다. 자동화된 플랫폼과 비교할 때, 벤치탑 바이오리액터를 사용하는 경우 배지 교체를 수동으로 수행해야 하기 때문에 처리 시간과 오염 위험이 증가합니다. 자동화 부족 외에도 벤치탑 바이오리액터는 영양소를 모니터링할 수 있는 가능성을 제공하지 않으며 튜브당 최대 용량이 50mL이므로 프로토콜의 업스케일링 가능성이 제한됩니다. 마지막으로, NGN2가 신경 계통 약속을 가속화하지만 말단 성숙 기간은 단축되지 않으며 여전히 몇 주에 걸친 장기 배양이 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 신경 기능, 부착 및 생존에 대한 성상세포 지원의 중요성을 감안할 때 49,50,51, 공동 배양 접근법을 고려해야 하며 장기 배양에 필수적일 수도 있습니다.
요약하면, 2D 분화 프로토콜은 벤치탑 바이오리액터를 구현하여 iNGN2 뉴런의 빠르고 재현 가능한 생성을 위해 3D 환경으로 성공적으로 변환되었습니다. 설명된 프로토콜은 복잡한 모델 테스트, 고처리량 약물 스크리닝 및 대규모 독성 분석의 시작점이 될 수 있는 양질의 iPSC 유래 뉴런을 다량 생성합니다.

신경계 장애는 전 세계적으로 장애의 주요 원인입니다1. 6 명 중 1 명이 영향을 받고 발병률은 계속 증가하고 있습니다. 사회와 의료 시스템에 대한 재정적 부담은 엄청납니다. 2010년 유럽 30개국을 대상으로 한 평가에서 정신 및 신경 장애와 관련된 연간 비용은 8,000억 유로로 추산되었습니다2. 사회경제적 부담이 증가함에 따라 효과적인 치료 전략이 필요하며, 질병 병태생리학에 대한 이해가 크게 증가했지만 클리닉으로의 번역은 종종 불충분합니다. 일반적으로 의약품의 12%만이 임상 시험에 들어가며, 그 중 80% 이상이 주로 비효능 또는 예상치 못한 독성으로 인해 후기 단계에서 실패합니다 3,4. 그 이유는 다양하지만, 전임상 단계의 동물 실험에서 인간 실험으로의 제한된 이전 가능성이 점점 더 전면에 등장하고 있습니다5. 인간 체외 세포 및 조직 모델은 종간 번역의 격차를 해소할 수 있으며, 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC) 기술의 발전은 이와 관련하여 큰 잠재력을 가지고 있습니다. hiPSC는 기초 연구에 널리 사용되며, 배아 파괴와 관련된 윤리적 문제를 피하면서 거의 무제한의 자가 재생 능력과 3개의 생식층6으로 분화할 수 있는 능력과 같은 배아 줄기 세포(hESC)와 필수적인 특성을 공유한다.
hESC와 나중에 hiPSC에서 신경 세포의 유도는 뇌 연구의 이정표를 세웠습니다. 초기 분화 프로토콜은 배발생 동안 중요한 단계를 모방하는 성장 인자의 적용을 기반으로 했으며, 대부분은 현탁액 또는 부착 배양에서 이중 SMAD 억제를 포함합니다 7,8,9. 성숙한 뉴런은 성공적으로 생성되었지만 생성된 뉴런의 낮은 수율 및 높은 배치 간 가변성, 긴 배양 시간과 관련된 광범위한 작업량과 같은 이러한 프로토콜의 몇 가지 단점이 여전히 약물 개발에서의 광범위한 사용을 방해합니다. 신경 발생에 결정적으로 관여하는 전사 인자의 강제 발현에 의해 개선이 이루어졌으며, 뉴로제닌(neurogenin, NGN) 계열의 구성원, 특히 NGN2가 효과적인 동인으로 확인되었다10. hiPSC에서 NGN2의 렌티바이러스 매개 이소성 발현은 뉴런 분화의 초기 단계를 유의하게 가속화시켰고, 단 1주일 이내에 뉴런 세포의 운명을 유도했다11. 성상교세포와의 공동 배양에서의 후속 말단 성숙은 재현 가능한 특성을 가진 고순도 및 양의 기능적 뉴런을 생성했습니다. 그런 다음 아데노 관련 바이러스 통합 부위 1(AAVS1) 세이프 하버 유전자좌의 부위 지정 유전자 편집을 적용하여 NGN212,13에 대한 안정적이고 독시사이클린 유도성 발현 카세트가 있는 hiPSC 라인을 생성하여 렌티바이러스 전달의 원치 않는 부작용을 최소화했습니다.
독시사이클린 유도성 뉴로제닌 2(iNGN2) 뉴런의 강력하고 효율적인 분화는 고처리량 표현형 약물 스크리닝 및 독성 분석에 대한 큰 잠재력을 가지고 있습니다10,14,15; 지난 10년 동안 확장 가능한 세포 확장 및 분화를 위한 생물반응기를 구현하여 바이오프로세싱에서 상당한 진전이 이루어졌습니다16,17,18,19. 그러나 대부분의 차별화 프로토콜은 부착 문화에 최적화되어 있으며 3차원(3D) 환경으로의 변환에는 종종 필수적인 수정이 필요합니다. 최근에, hiPSCs의 확장 및 간세포, 심근세포 및 뉴런으로의 재현 가능한 분화를 위해 감소된 전단 응력 특징을 갖는 벤치탑 3D 생물반응기의 성공적인 사용이 보고되었다20. 여기서, iNGN2 뉴런의 생성 및 특성화를 위한 상세한 프로토콜은 동일한 벤치탑 3D 바이오리액터를 사용하여 제공된다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올 50 mM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11528926</tr><tr><td>60 mm Nunclon Delta Surface</td><td>Nunc</td><td>734-2040</td><td></td></tr><tr><td>Anti-beta III Tubulin 항체 [TU-20] (희석 1:1,000)</td><td>Abcam&nbsp; &nbsp;</td><td>AB7751&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>어플라이드 바이오시스템&nbsp; 고용량 cDNA 역전사 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10400745</tr><tr><td>B-27 보충제 (50개)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530536</td><td>무혈청 보충제 (50개)</td></tr><tr><td>BIONi010-C-13 hiPSC line</td><td>European Bank for induced pluripotent Stem Cell (EBiSC), BIONEER as Depositor</td><td>SAMEA103988285</td><td>Bioneer는 EBiSC의 예금자이자 hiPSC 라인의 소유자입니다.</td></tr><tr><td>바이오렌더&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Biorender.com</tr><tr><td>BSA 세포 배양 등급</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12330023</tr><tr><td>CERO 3D 인큐베이터 & Bioreactor</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800000</td><td></td></tr><tr><td>CEROtubes 세포 배양 튜브 50 mL</td><td>OLS OMNI 생명 과학</td><td>2800005</td><td></td></tr><tr><td>Citavi 6</td><td>스위스 학술 소프트웨어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stemcell</td><td>7930</td><td>동결 매체 10% DMSO</td></tr><tr><td>Cytofix 고정 솔루션</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>554655</td><td>4% 파라포름알데히드를 함유한 고정 용액&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (NUCBLUE 고정 세포 염색제)&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12333553</tr><tr><td>Doxycycline hydrochloride (DOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3447</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 칼슘 및 마그네슘 없음 (DPBS -/-)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 및 마그네슘 함유 DPBS (DPBS +/+)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11580456</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-/-)</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL 코어 세포 이미징 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) 고교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td>35050-038</td><td>안정화된 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드</td></tr><tr><td>이미지J 1.51v&nbsp;</td><td>국립 건강</td><td></td><td></td></tr><tr><td>연구소 인슐린 솔루션 인간</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278l</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant 분석기</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 단클론 항체 (희석 1: 300)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>13-1500년&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 성장 인자 감소, 페놀-레드 프리&nbsp;</td><td>코닝 생명과학&nbsp;</td><td>356231</td><td>베이스먼트 멤브레인 매트릭스</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 솔루션 (100x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11140035</tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름 키트&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10095714</tr><tr><td>mTeSR1</td><td>스템셀</td><td>85850</td><td>피더가 필요 없는 iPSC 유지 관리 매체&nbsp;</td></tr><tr><td>N-2 보충제 (100개)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Bottenstein 기반 무혈청 보충제 s N-1 제형</td></tr><tr><td>: Neurobasal 매체</td><td>Gibco</td><td>11570556</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2</td><td>Nikon Instruments Europe BV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter-NC200</td><td>ChemoMetec A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 2021</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>펌/워시 버퍼&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>프라이머 어세이 TUBB3(Hs00801390_s1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 어세이 GAPDH (Hs99999905_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 어세이 GUSB (Hs99999908_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 어세이 HPRT1 (Hs99999909_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 어세이 MAP2 (Hs00258900_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 어세이 MAPT (Hs00902194_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 어세이 POU5F1 (Hs04260367_gH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴 0.01%</td><td>Merck</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit (50)-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>컬럼 기반 RNA 분리 키트</td></tr><tr><td>RLT 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>세포 용해 버퍼</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>12539059</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>11599686</td>세포 <td>해리 효소</td></tr><tr><td>TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>11380912</td><td>qPCR 마스터 믹스</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Trypsin-EDTA 용액</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Via1-Cassette</td><td>ChemoMetec A/S</td><td>941-0012</td><td></td></tr><tr><td>와이드 보어 필터 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher 과학</td><td>10088880</td><td></td></tr><tr><td>X20 광학 96WELL 빠른 클리어 반응 플레이트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206343</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드, Rho kinase inhibitor(ROCK inhibitor)</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr></tbody></table>

3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 뉴런 계통 세포의 유도는 뇌 연구의 이정표를 세웠습니다. 프로토콜은 처음 등장한 이래로 지속적으로 최적화되어 왔으며 현재 연구 및 약물 개발에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 이러한 기존 차별화 및 성숙 프로토콜의 매우 긴 기간과 고품질 hiPSC 및 신경 유도체에 대한 수요 증가로 인해 대규모 생산에 대한 이러한 프로토콜의 채택, 최적화 및 표준화의 필요성이 높아졌습니다. 이 연구는 벤치탑 3차원(3D) 현탁액 바이오리액터를 사용하여 유전자 변형된 독시사이클린 유도성 뉴로제닌 2(iNGN2) 발현 hiPSC를 뉴런으로 분화하기 위한 빠르고 효율적인 프로토콜을 제시합니다.
간단히 말해서, iNGN2-hiPSC의 단일 세포 현탁액은 24시간 이내에 응집체를 형성하도록 허용되었고, 독시사이클린의 첨가에 의해 뉴런 계통 투입이 유도되었습니다. 응집체는 유도 2일 후에 해리되었고, 세포는 냉동보존되거나 말단 성숙을 위해 재도금되었다. 생성된 iNGN2 뉴런은 초기에 고전적인 뉴런 마커를 발현하고 재도금 후 1주일 이내에 복잡한 뉴라이트 네트워크를 형성하여 뉴런 배양의 성숙도가 증가하고 있음을 나타냅니다. 요약하면, 질병 모델링, 표현형 고처리량 약물 스크리닝 및 대규모 독성 테스트의 시작점으로서 큰 잠재력을 지닌 3D 환경에서 hiPSC 유래 뉴런의 빠른 생성을 위한 상세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다.

초기 단계에서 hiPSC의 부착성 배양은 분리, 특이화 및 현탁액으로 옮겨집니다(그림 2). 응집체는 24 시간 이내에 형성되며 지속적으로 크기가 커집니다. 이식유전자 유도 2일 후, 초기 뉴런은 후속 실험을 위해 냉동보존될 수 있습니다.
현탁액의 초기 며칠 동안의 지속적인 증식은 세포 수의 증가를 초래하여 유도 2일 후에 최고점에 도달합니다(그림 3A, B). 확산과 함께 응집체가 증가하기 시작합니다. 0일과 비교하여 직경은 2일째에 50% 증가했으며 5일째에는 거의 두 배가 되었습니다(그림 3D). 직경이 증가하면 응집체 내부의 영양소 공급이 제한되지만 세포의 생존력은 분화 2일차 또는 분화 5일차에 영향을 받지 않습니다(그림 3C). 그러나, 현탁액에서 4일 이상 장기간 배양하는 것은 응집체가 효소적 특이화에 점점 더 내성을 갖기 때문에 세포 수율을 더 이상 향상시키지 못한다(그림 3B).
냉동 보존 시, 2일째 세포를 해동하고 말단 성숙을 위해 폴리-L-오르니틴(PLO)-라미닌 코팅 접시에 도말합니다. 일반적으로 세포는 해동 후 매우 잘 부착되어 조기에 신경돌기를 확장하기 시작합니다. 측두엽 유전자 발현 프로필과 뉴런 마커 TUBB3 및 MAP2에 대한 면역세포화학적 염색은 뉴런 세포 동일성을 확인합니다(그림 4A, B). TUBB3 및 MAP2의 상승 수준 외에도, 뉴런 배양은 축삭 안정화에 관여하는 뉴런 단백질을 암호화하는 미세소관 관련 단백질 타우 전사체(MAPT)가 풍부하고, 다능성 조절 전사 인자 POU5F1의 발현이 수반되는 감소를 보여줍니다. 또한, 해동 후 첫 주 이내에 조밀 한 신경염 네트워크가 형성됩니다 (그림 4C). 이러한 형태학적 변화는 전사 프로파일과 함께 신경 배양의 성숙이 증가하고 있음을 시사합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig02.jpg"> 그림 2: 벤치탑 바이오리액터를 사용한 hiPSC 유래 iNGN2 뉴런 생성. (A) 분화 패러다임의 개략도, 세포 배양의 주요 단계를 강조합니다. (BF) 명시야 이미지는 (B) hiPSC 및 (C,D) 벤치탑 바이오리액터에서 응집체 형성을 시각화합니다. (E,F) iNGN2 뉴런은 신경돌기를 확장하고 분화 과정에서 형태학적 변화를 겪습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: BMM = basement membrane matrix; iPSC-MM = iPSC 유지 매체; PLO = 폴리-L-오르니틴. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig03.jpg"> 그림 3: 응집체 형성 및 성장 중 세포 수율 및 생존력. (A) 명시야 이미지는 벤치탑 바이오리액터에서 배양 후 2일 이내에 응집체가 형성되고 시간이 지남에 따라 응집체 크기가 증가하는 것을 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm. (B) 분화 과정에 걸친 세포 수율 및 (C) 생존력의 정량화. 막대 그래프는 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 + SD를 나타낸다. (D) 응집체의 크기를 나타내는 직경은 오픈 소스 소프트웨어 ImageJ(버전 1.53)를 사용하여 반자동으로 결정되었습니다. 먼저 명시야 이미지를 이진 이미지로 변환한 다음 입자 분석 도구를 사용하여 크기 &gt; 2,500μm2, 원형도 0.45-1, 가장자리 제외 및 구멍 포함 매개변수를 적용하여 추가로 평가했습니다. 수평선은 5개의 독립적인 미분의 평균 ± SD를 나타냅니다. 단일 점은 시점당 최소 20개의 응집체가 있는 개별 분화 실험의 평균을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig04.jpg"> 그림 4: hiPSC 유래 iNGN2 뉴런의 특성화. 신경 유전자 TUBB3, MAP2 및 MAPT와 만능 줄기 세포 관련 유전자 POU5F1에 대한 시간적 유전자 발현 프로필. 상대적 발현 수준은 참조 유전자 GAPDH, HPRT1 및 GUSB로 표준화되었습니다. 미분화 hiPSC(day-2)가 교정기로 선택되었습니다. 기하학적 기호는 4개의 독립적인 미분의 평균± SD를 나타냅니다. (B) 해동 후 7일째(day-2 + 7)에 iNGN2 뉴런의 대표 이미지, 베타-III-튜불린(TUBB3, 마젠타) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2, 청록색)에 대해 염색됨. 세포핵은 DAPI로 대조염색하였다. 스케일 바 = 100 μm. (C) 해동 후 신경 배양의 명시야 이미지에서 신경염 네트워크 평가. 신경돌기의 총 길이는 ImageJ(버전 1.53)를 사용하여 930.82 × 698.11μm2의 영역에서 결정되었습니다. 밝기와 대비를 조정한 후 이미지를 8비트 이미지로 변환하고 색상을 반전했습니다. 신경돌기는 이후 골격화한 다음 ImageJ 플러그인 'Skeletonize' 및 'Analyze Skeleton'을 사용하여 각각 분석되었습니다. 신경돌기의 총 길이를 관심 영역의 소마 수로 나누어 평균 신경돌기 길이/세포를 산출했습니다. 막대 그래프는 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 + SD를 나타낸다. 약어: DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 기사에서는 벤치탑 3D 현탁액 바이오리액터에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...

바이오리액터를 사용하여 유도 만능 줄기 세포 또는 IPSC 배양 프로토콜을 2D에서 3D로 변환하면 고처리량 스크리닝과 같은 대규모 응용 분야에서 많은 수의 세포를 생성할 수 있습니다. 생리학적 3D 환경에서 이 빠른 신경 분화 프로토콜은 스타터 세포 상호 작용을 개선하고 낮은 배치-=배치 변동으로 더 짧은 기간 동안 높은 세포 수율을 제공하여 비용과 시간을 줄입니다. 유럽유도만능줄기세포은행(European Bank of Induced Pluripotent Stem Cells)은 다른 뇌세포와 심근세포를 포함한 여러 계통에 걸쳐 분화된 세포를 빠르고 비용 효율적으로 생성하기 위해 유사한 접근법을 적용하고 있습니다.인간 유도 만능 줄기 세포 또는 인간 iPSC 배양이 60-80% 융합될 때 사전 배양을 시작합니다. 인간 iPSC에서 배지를 완전히 흡인하고 1X DPBS로 세포를 두 번 부드럽게 헹굽니다. 예열 된 트립신 EDTA 용액 2 밀리리터를 6 센티미터 페트리 접시에 넣고 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 3 분 동안 세포를 배양한다.그런 다음 접시를 부드럽게 두드려 세포 분리를 용이하게 하거나 세포가 분리되지 않는 경우 1-2분 더 배양합니다. 그런 다음, ROCK 억제제와 함께 5밀리리터의 피더가 없는 IPSC 유지 배지를 추가하여 각 접시에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 15밀리리터 또는 50밀리리터 튜브로 옮기고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 세포 특이화를 보장합니다.자동 세포 계수기를 사용하여 100 마이크로 리터의 세포 현탁액에서 세포 수를 결정하고 원하는 부피의 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포를 300G에서 3분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 상청액을 흡인하고, 세포를 ROCK 억제제를 사용하여 2밀리리터의 피더-프리 IPSC 유지 배지에 재현탁시킨다.각 50 밀리리터 튜브에 18 밀리리터의 매체를 채 웁니다. 그런 다음 20 밀리리터의 세포 현탁액을 각 생물 반응기 튜브에 분배합니다. 튜브를 생물 반응기 시스템에 넣고 무제한 기간 동안 배양 매개 변수를 설정하십시오.생물 반응기 디스플레이를 통해 사전 재배 프로그램을 시작합니다. 다음날 배지를 교체하려면 응집체를 약 5분 동안 생물반응기 튜브에 침전시킨 후 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 튜브당 ROCK 억제제가 없는 신선한 피더가 없는 IPSC 유지 배지 15ml를 추가하고 벤치탑 바이오리액터에서 24시간 동안 배양을 계속합니다.신경 분화를 시작하려면 응집체가 생물 반응기 튜브에 침전되도록하고 세포에서 상청액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 5 밀리리터의 상청액을 남깁니다. 그런 다음 신경 기저 배지와 독시사이클린 밀리리터당 2마이크로그램으로 구성된 신경 유도 배지 35밀리리터를 추가합니다. 튜브를 벤치 탑 생물 반응기에 다시 넣고 재배를 계속하십시오.앞에서 설명한 대로 이틀 동안 매일 미디어 변경을 수행합니다. 앞서 표시된 대로 상청액을 흡인한 후 응집체를 멸균된 15밀리리터 또는 50밀리리터 튜브로 옮기고 응집체를 DPBS로 두 번 부드럽게 헹굽니다. 응집체를 방해하지 않고 가능한 한 상층액을 조심스럽게 흡인하십시오.그런 다음 펠릿 크기에 따라 2-5 밀리리터의 예열 된 세포 해리 효소를 펠릿에 첨가하고 수조에서 섭씨 37도에서 약 10 분 동안 세포를 배양합니다. 응집체가 해리될 때까지 2분마다 침전된 골재를 부드럽게 다시 부유시킵니다. 이전에 첨가된 세포 해리 효소 부피의 3배인 예열된 신경기저 배지를 추가하고 세포 특이화를 보장하기 위해 세포를 조심스럽게 재현탁합니다.세포 번호를 결정하고 냉동 보존을 위해 해당 부피의 세포 현탁액을 15밀리리터 또는 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포를 300 G에서 3분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡인하고 10% 디메틸 설폭사이드를 함유한 동결 배지의 해당 부피에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.동결 보존을 위해 적절한 바이알에 세포 현탁액을 분취합니다. 바이알을 즉시 2-프로판올로 채워진 미리 냉각된 저속 냉동 용기에 옮기고 용기를 밤새 섭씨 영하 80도에 두십시오. 장기 보관을 위해 다음날 바이알을 섭씨 영하 150도에 두십시오.인간 iPSC의 부착 배양이 분리, 특이화 및 현탁액으로 옮겨진 후, 응집체는 24시간 이내에 형성되어 계속 성장했습니다. 이식유전자 유도 이틀 후, 초기 뉴런은 후속 성숙을 위해 냉동보존될 수 있습니다. 현탁액에서 초기 며칠 동안 인간 iPSC의 지속적인 증식이 관찰되었고, 세포 배양 수는 유도 2일 후에 최고조에 달했습니다.그러나, 현탁액에서 4 일 이상 장기간 배양은 응집체가 효소 특이화에 점점 더 내성을 갖게됨에 따라 세포 수율을 향상시키지 못했다. 또한, 0일차에 비해 골재 직경은 2일차에 50% 증가했고 5일차에는 거의 두 배가 되었습니다. 직경이 증가하면 응집체로의 영양소 공급이 제한되지만 세포의 생존력은 분화 2일차 또는 5일차에 영향을 받지 않았습니다.측두엽 유전자 발현 프로필과 뉴런 마커 베타 3 튜불린 및 미세소관 관련 단백질(MAP2)에 대한 면역화학적 염색을 통해 2일째 냉동보존된 세포의 뉴런 세포 동일성을 확인했습니다. 추가로, 뉴런 배양은 미세소관 관련 단백질 타우 전사체(MAPT)에서 농축되었고, 다능성 조절 전사 인자 POU5F1의 발현에서 수반되는 감소를 나타내었고, 이는 또한 해동 후 첫 주 이내에 조밀한 신경돌기 네트워크가 형성되었으며, 이는 또한 뉴런 배양의 성숙 증가를 시사했다. 이 프로토콜은 대규모 및 완전 자동화된 바이오리액터로의 변환을 위한 토대를 마련하며, 이는 향후 대규모 응용 분야를 위한 세포 출력 용량의 추가 증가를 보여줍니다.뉴로제닌 2로 입증된 분화를 가속화하기 위한 선형 결정 전사 인자의 사용은 iPSC 모델링을 용이하게 하기 위해 다양한 세포 유형 및 질병에 적용되었습니다.

production-human-neurogenin-2-inducible-neurons-three-dimensional

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

이 비디오는 파킨슨병 연구를 위한 모델을 제공하기 위해 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 도파민 뉴런으로 분화하는 방법을 보여줍니다. hESC는 마이크로웰 플레이트의 신경 유도 매체에서 배양되어 3D 신경구를 형성합니다. 그런 다음 이들은 도파민 전구 뉴런으로의 분화를 촉진하기 위해 신경 유도 배지에서 배양됩니다. 뉴런의 최종 성숙은 공기-액체 계면 조건의 배양 삽입물에서 발생하여 성숙한 도파민 뉴런으로 구성된 3D 오가노이드가 생성됩니다.

인간 배아 줄기 세포에서 도파민 신경 세포 오가노이드 생성

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

직접 신경 프로그래밍 시작 체세포의 나이 유지 하는 신경 세포 생성 합니다. 여기, 우리는 성인 인간 기증자 로부터 얻은 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경 세포를 생성 하는 단일 벡터 기반 방법을 설명 합니다.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

이 연구는 1) 인간 에서독점적으로 인간 신경 유기 체 내 인간 교모세포종 개발 및 2) 뉴런 도파민성 연구를 위한 관련 및 정확한 모델로 두 개의 특정 인간 신경 오르가노이드를 도출하는 프로토콜을 소개하고 기술합니다. 3차원 오르가노이드를 생성하는 분화.

뇌암과 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 인간의 신경 오르가노이드

이 프로토콜은 조직 배양 칩에서 스페로이드에서 확장 된 축축의 강력한 번들의 자발적인 조립을 통해 인간 iPS 세포 유래 모터 신경 오르가노이드를 제조하는 포괄적 인 절차를 제공합니다.

3차원 모터 신경 오르간성 생성

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

여기서는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양을 생산하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서 96웰 또는 384웰 형식으로 생성된 이 공동 배양 모델은 7일 이내에 높은 인쇄 후 생존율과 신경돌기 성장을 입증하고 두 세포 유형 모두에 대한 성숙 마커의 발현을 보여줍니다.

스크리닝 응용 분야를 위한 인간 iPSC 유래 뉴런-성상세포 공동 배양의 3차원 바이오프린팅

배우세요 3차원 현탁 생물반응기를 활용한 인간 유도만능줄기세포 유래 뉴런의 고효율 분화 프로토콜. 이 방법은 신경과학 연구 및 대규모 약물 스크리닝에 활용될 수 있습니다.

3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산

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