3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산

바이오리액터를 사용하여 유도 만능 줄기 세포 또는 IPSC 배양 프로토콜을 2D에서 3D로 변환하면 고처리량 스크리닝과 같은 대규모 응용 분야에서 많은 수의 세포를 생성할 수 있습니다. 생리학적 3D 환경에서 이 빠른 신경 분화 프로토콜은 스타터 세포 상호 작용을 개선하고 낮은 배치-=배치 변동으로 더 짧은 기간 동안 높은 세포 수율을 제공하여 비용과 시간을 줄입니다. 유럽유도만능줄기세포은행(European Bank of Induced Pluripotent Stem Cells)은 다른 뇌세포와 심근세포를 포함한 여러 계통에 걸쳐 분화된 세포를 빠르고 비용 효율적으로 생성하기 위해 유사한 접근법을 적용하고 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 또는 인간 iPSC 배양이 60-80% 융합될 때 사전 배양을 시작합니다. 인간 iPSC에서 배지를 완전히 흡인하고 1X DPBS로 세포를 두 번 부드럽게 헹굽니다. 예열 된 트립신 EDTA 용액 2 밀리리터를 6 센티미터 페트리 접시에 넣고 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 3 분 동안 세포를 배양한다.

그런 다음 접시를 부드럽게 두드려 세포 분리를 용이하게 하거나 세포가 분리되지 않는 경우 1-2분 더 배양합니다. 그런 다음, ROCK 억제제와 함께 5밀리리터의 피더가 없는 IPSC 유지 배지를 추가하여 각 접시에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 15밀리리터 또는 50밀리리터 튜브로 옮기고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 세포 특이화를 보장합니다.

자동 세포 계수기를 사용하여 100 마이크로 리터의 세포 현탁액에서 세포 수를 결정하고 원하는 부피의 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포를 300G에서 3분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 상청액을 흡인하고, 세포를 ROCK 억제제를 사용하여 2밀리리터의 피더-프리 IPSC 유지 배지에 재현탁시킨다.

각 50 밀리리터 튜브에 18 밀리리터의 매체를 채 웁니다. 그런 다음 20 밀리리터의 세포 현탁액을 각 생물 반응기 튜브에 분배합니다. 튜브를 생물 반응기 시스템에 넣고 무제한 기간 동안 배양 매개 변수를 설정하십시오.

생물 반응기 디스플레이를 통해 사전 재배 프로그램을 시작합니다. 다음날 배지를 교체하려면 응집체를 약 5분 동안 생물반응기 튜브에 침전시킨 후 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 튜브당 ROCK 억제제가 없는 신선한 피더가 없는 IPSC 유지 배지 15ml를 추가하고 벤치탑 바이오리액터에서 24시간 동안 배양을 계속합니다.

신경 분화를 시작하려면 응집체가 생물 반응기 튜브에 침전되도록하고 세포에서 상청액을 조심스럽게 흡인하여 튜브에 약 5 밀리리터의 상청액을 남깁니다. 그런 다음 신경 기저 배지와 독시사이클린 밀리리터당 2마이크로그램으로 구성된 신경 유도 배지 35밀리리터를 추가합니다. 튜브를 벤치 탑 생물 반응기에 다시 넣고 재배를 계속하십시오.

앞에서 설명한 대로 이틀 동안 매일 미디어 변경을 수행합니다. 앞서 표시된 대로 상청액을 흡인한 후 응집체를 멸균된 15밀리리터 또는 50밀리리터 튜브로 옮기고 응집체를 DPBS로 두 번 부드럽게 헹굽니다. 응집체를 방해하지 않고 가능한 한 상층액을 조심스럽게 흡인하십시오.

그런 다음 펠릿 크기에 따라 2-5 밀리리터의 예열 된 세포 해리 효소를 펠릿에 첨가하고 수조에서 섭씨 37도에서 약 10 분 동안 세포를 배양합니다. 응집체가 해리될 때까지 2분마다 침전된 골재를 부드럽게 다시 부유시킵니다. 이전에 첨가된 세포 해리 효소 부피의 3배인 예열된 신경기저 배지를 추가하고 세포 특이화를 보장하기 위해 세포를 조심스럽게 재현탁합니다.

세포 번호를 결정하고 냉동 보존을 위해 해당 부피의 세포 현탁액을 15밀리리터 또는 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 세포를 300 G에서 3분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡인하고 10% 디메틸 설폭사이드를 함유한 동결 배지의 해당 부피에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.

동결 보존을 위해 적절한 바이알에 세포 현탁액을 분취합니다. 바이알을 즉시 2-프로판올로 채워진 미리 냉각된 저속 냉동 용기에 옮기고 용기를 밤새 섭씨 영하 80도에 두십시오. 장기 보관을 위해 다음날 바이알을 섭씨 영하 150도에 두십시오.

인간 iPSC의 부착 배양이 분리, 특이화 및 현탁액으로 옮겨진 후, 응집체는 24시간 이내에 형성되어 계속 성장했습니다. 이식유전자 유도 이틀 후, 초기 뉴런은 후속 성숙을 위해 냉동보존될 수 있습니다. 현탁액에서 초기 며칠 동안 인간 iPSC의 지속적인 증식이 관찰되었고, 세포 배양 수는 유도 2일 후에 최고조에 달했습니다.

그러나, 현탁액에서 4 일 이상 장기간 배양은 응집체가 효소 특이화에 점점 더 내성을 갖게됨에 따라 세포 수율을 향상시키지 못했다. 또한, 0일차에 비해 골재 직경은 2일차에 50% 증가했고 5일차에는 거의 두 배가 되었습니다. 직경이 증가하면 응집체로의 영양소 공급이 제한되지만 세포의 생존력은 분화 2일차 또는 5일차에 영향을 받지 않았습니다.

측두엽 유전자 발현 프로필과 뉴런 마커 베타 3 튜불린 및 미세소관 관련 단백질(MAP2)에 대한 면역화학적 염색을 통해 2일째 냉동보존된 세포의 뉴런 세포 동일성을 확인했습니다. 추가로, 뉴런 배양은 미세소관 관련 단백질 타우 전사체(MAPT)에서 농축되었고, 다능성 조절 전사 인자 POU5F1의 발현에서 수반되는 감소를 나타내었고, 이는 또한 해동 후 첫 주 이내에 조밀한 신경돌기 네트워크가 형성되었으며, 이는 또한 뉴런 배양의 성숙 증가를 시사했다. 이 프로토콜은 대규모 및 완전 자동화된 바이오리액터로의 변환을 위한 토대를 마련하며, 이는 향후 대규모 응용 분야를 위한 세포 출력 용량의 추가 증가를 보여줍니다.

뉴로제닌 2로 입증된 분화를 가속화하기 위한 선형 결정 전사 인자의 사용은 iPSC 모델링을 용이하게 하기 위해 다양한 세포 유형 및 질병에 적용되었습니다.