닭 배아에서 Intracelomic Transplantation을 통한 신장 오가노이드의 효율적인 혈관 형성

시험관 내에서 배양된 신장 오가노이드는 미성숙 상태로 남아 있어 적용 가능성이 제한됩니다. 그리고 이 체금내 이식 방법은 혈관 형성을 유도하고 오가노이드의 성숙을 향상시킵니다. 이 절차는 매우 효율적이어서 한 번의 실험에서 많은 수의 오가노이드를 이식하고 분석할 수 있습니다.

HIPSC에서 유래한 신장 오가노이드를 준비하고 수정된 레그혼 알을 배양한 후 배양 3일째에 달걀 껍질에 창을 만듭니다. 달걀의 뾰족한 끝에 작은 투명 테이프를 붙입니다. 투명 테이프 중간의 달걀 껍질에 작은 구멍을 뚫어 해부 가위의 날카로운 끝으로 두드려주세요.

그런 다음 5 밀리리터 주사기에 19 게이지 바늘을 45도 각도로 구멍에 삽입합니다. 난자에서 2-3 밀리리터의 알부민을 흡인하여 난자 내부의 배아를 낮 춥니 다. 두 번째 투명 테이프로 구멍을 숨긴 다음 달걀의 위쪽을 향한 면이 위로 표시된 연필에 큰 투명 테이프를 붙입니다.

투명 테이프 중간에 달걀 껍질에 구멍을 뚫어 해부 가위의 날카로운 끝으로 두드려주세요. 구부러진 해부 가위를 사용하여이 구멍에서 달걀 껍질에 작은 원형 창을 자릅니다. 이 창을 통해 배아를 찾으십시오.

그런 다음 배아에 대한 접근을 최적화하기 위해 창을 확대하십시오. 집게를 사용하여 배아 위에 떨어졌을 수 있는 큰 달걀 껍질 조각을 제거합니다. 플라스틱 이식 피펫으로 배아에 칼슘과 마그네슘이 함유된 DPBS 몇 방울을 떨어뜨린 다음 달걀 껍질이 있는 DPBS를 피펫으로 흡인하여 더 작은 조각을 제거합니다.

플라스틱 이송 피펫을 사용하여 0.5% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DPBS 3방울을 계란에 추가합니다. 부화 4일째까지 알을 인큐베이터에 다시 넣기 전에 큰 투명 테이프로 창을 조심스럽게 밀봉하십시오. 구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다.

고무 홀더 또는 달걀 상자의 해부 현미경 아래에 달걀을 놓습니다. 닭 배아는 현재 햄버거-해밀턴 스테이지 23-24에 있으며 왼쪽으로 누워 오른쪽이 시청자를 향하고 있습니다. 배아의 오른쪽 날개와 다리 새싹을 찾으면 이 두 개의 사지 새싹 사이에서 coelom이 평가됩니다.

오른쪽 날개와 다리 봉오리 사이의 영역에서 두 쌍의 해부 집게로 잡고 부드럽게 반대 방향으로 당겨 vitelline 막, chorion 및 양막에 연속적으로 구멍을 만듭니다. 체강에 방해받지 않는 접근이 있는지 확인하십시오. 한 쌍의 해부 집게로 날개와 사지 새싹 사이의 체벽 가장자리를 부드럽게 잡고 보는 사람쪽으로 약간 당깁니다.

체강은 명확하게 보여야 합니다. 뭉툭하지만 가느다란 기구를 체강 구멍에 조심스럽게 삽입합니다. 경막 해부기를 사용하여 알란토스 위에 계란 안에 오가노이드 반을 놓습니다.

해부 집게를 사용하여 체벽의 가장자리를 조심스럽게 잡고 관찰자 쪽으로 약간 당겨 coelum의 개구부가 보이도록 합니다. 뭉툭한 텅스텐 와이어와 마이크로 메스 홀더를 사용하여 오가노이드를 체벽의 구멍을 통해 코엘럼으로 부드럽게 움직입니다. 오가노이드를 약간 두개골로 밀어 섬토 내부에 넣습니다.

이제 날개 봉오리 바로 뒤에서 볼 수 있습니다. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 계란에 DPBS 3 방울을 첨가하십시오. 부화 12 일까지 알을 인큐베이터에 다시 넣기 전에 큰 투명 테이프로 창을 조심스럽게 밀봉하십시오.

구부러진 해부 가위로 창에서 테이프를 자릅니다. 고무 홀더의 해부 현미경 아래에 계란을 놓습니다. 혈관 구조를 평가하고 약간 더 밝은 붉은 색으로 동맥과 구별 할 수있는 정맥을 찾습니다.

혈관 구조에 대한 접근성을 높이려면 구부러진 해부 가위로 창을 잘라서 조심스럽게 확대하십시오. 정맥을 선택한 후 미세 모세관 바늘의 끝을 0도에서 20도 각도로 정맥에 삽입합니다. 팁을 좌우로 부드럽게 움직여 바늘이 정맥에 있는지 확인합니다.

렌즈 culinaris 응집소를 주입하기 위하여 주입 체계로 온화하게 그리고 꾸준히 불어. 그리고 계란을 인큐베이터에 10분 동안 다시 넣어 순환시킵니다. 계란을 벤치의 고무 홀더에 넣으십시오.

그런 다음 구부러진 해부 가위로 배아를 둘러싼 막을 자릅니다. 구멍이 뚫린 숟가락으로 난자에서 배아를 긁어 내고 즉시 가위를 사용하여 배아를 참수하십시오. 해부 현미경 아래에서 배아의 몸을 페트리 접시에 넣습니다.

배아를 페트리 접시에 넣고 팔다리를 펼칩니다. 집게를 사용하여 세로축을 따라 배아의 복벽을 조심스럽게 엽니 다. 배아 내부에서 오가노이드를 찾습니다.

오가노이드는 가장 자주 코들 끝 또는 두개골의 흉곽 바로 아래 오른쪽 간엽에 부착됩니다. 따라서 이러한 위치를 살펴보는 것부터 시작하는 것이 좋습니다. 오가노이드를 찾으면 미세 가위로 주위를 잘라 배아에서 제거합니다.

필연적으로 부착 된 닭 조직에 오가노이드를 해부 현미경으로 페트리 접시에 넣습니다. 양날의 스테인리스 스틸 면도날로 닭 티슈를 최대한 많이 제거합니다. 이식되지 않은 신장 오가노이드와 이식된 신장 오가노이드의 면역형광 이미지는 모두 사구체 및 관형 구조를 포함합니다.

이식되지 않은 오가노이드에는 일부 인간 내피 세포가 존재합니다. 이식된 오가노이드에서는 관류된 혈관 네트워크가 오가노이드 전체에서 볼 수 있습니다. 박스형 영역의 확대된 이미지는 이식된 오가노이드에서 구별할 수 있는 세 가지 유형의 내피 세포(관류된 인간 내피 세포, 관류되지 않은 인간 내피 세포 및 관류된 닭 유래 내피 세포)를 보여줍니다.

이식되지 않은 오가노이드에서 내피 세포는 사구체 구조를 둘러싸고 있지만 침범하지는 않습니다. 그러나 이식된 오가노이드에서 사구체 구조는 관류된 모세혈관에 의해 혈관화됩니다. 이식된 오가노이드는 실험의 목적에 따라 다양한 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

이식되지 않은 대조군과의 직접적인 비교는 혈관 형성 및 성숙 과정에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.