Name: Ferritinophagy: 인간 섬유아세포에서 자가포식에 의한 철의 선택적 분해 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 배우세요 인간 피부 섬유아세포에서 페리티노파지를 평가하는 고처리량 면역형광 현미경법을 통해 세포 내 철 대사 메커니즘을 정량 분석하는 방법을. 이 기법은 BPAN의 철 항상성 이상 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI+proteins%3A+Essential+PtdIns3P+effectors+at+the+nascent+autophagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome.</a> Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Proikas-Cezanne, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI-1%CE%B1+%28WIPI49%29%2C+a+member+of+the+novel+7-bladed+WIPI+protein+family%2C+is+aberrantly+expressed+in+human+cancer+and+is+linked+to+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy.</a> Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).</li>
<li>Bakula, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WIPI3+and+WIPI4+%CE%B2-propellers+are+scaffolds+for+LKB1-AMPK-TSC+signalling+circuits+in+the+control+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy.</a> Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).</li>
<li>Hayflick, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Propeller+protein-associated+neurodegeneration%3A+A+new+X-linked+dominant+disorder+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation.</a> Brain. 36, 1708-1717 (2013).</li>
<li>Wilson, J. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+clinical+management+guideline+for+beta-propeller+protein-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Medicine+and+Child+Neurology%22%5BJournal%5D)">Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration.</a> Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).</li>
<li>Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+iron+metabolism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular iron metabolism and regulation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).</li>
<li>Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+NCOA4+as+the+cargo+receptor+mediating+ferritinophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy.</a> Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).</li>
<li>Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+oxidation+and+proteasomal+degradation%3A+Protection+by+antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants.</a> Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).</li>
<li>Schüssele, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+profiling+in+single+cells+with+open+source+CellProfiler-based+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis.</a> Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).</li>
<li>Goodwin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-independent+lysosomal+targeting+regulated+by+ULK1%2F2-FIP200+and+ATG9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9.</a> Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).</li>
<li>Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCOA4-mediated+ferritinophagy%3A+A+potential+link+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).</li>
<li>Zachari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+of+mitochondria+on+a+ubiquitin-endoplasmic-reticulum+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform.</a> Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><강>세포주</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일차 피부 유래 인간 섬유아세포&nbsp;</td><td>피부 생검, 건강한 인간 기증자, Biobank University Clinic T&uuml; bingen, 윤리적 승인 389/2019BO2</td><td>F-CO-60, 통로 9</td><td></td></tr><tr><td><강한>세포 배양 처리</강한></td><td></td><td></td><td><강한>최종 농도(화합물)</강한></td></tr><tr><td>대조 매체</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>(DMSO만 해당)</td></tr><tr><td>대조군 배지 + bafilomycinA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>100nM bafilomycin A1</td></tr><tr><td>대조군 배지 + deferasiox(DFX)</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 & 마이크로; M DFX</td></tr><tr><td>제어 매체 + DFX + bafilomycinA1</td><td>DMEM 10%FCS</td><td></td><td>30 &마이크로; M DFX, 100 nM bafilomycin A1</td></tr><tr><td>제어 배지 + 구연산 암모늄 철 (FAC)</td> <td>DMEM 10 % FCS</td><td></td><td>0.05 mg / mL FAC</td></tr><tr><td>제어 배지 + FAC + bafilomycinA1</td><td>DMEM 10 % FCS</td><td></td><td>0.05 mg / mL FAC, 100 nM bafilomycin A1</td></tr> <tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin [BSA] Fraction V</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 염소 토끼</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 546 염소 마우스</td><td>Life Technologies</td><td>A-11003</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>196000</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 세포 배양 처리 10cm 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td>A4099</td><td></td></tr><tr><td>Deferasiox (ICL-670)</td><td>Selleckchem</td><td>S1712</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 글루타맥스</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 칼슘이나 마그네슘 없음</td><td>Gibco 14190094</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>구연산 철 암모늄 (FAC)</td><td>Merck</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FERRITIN (Human Spleen)</td><td>Rockland</td><td>200-401-090-0100</td><td></td></tr><tr><td>LAMP2 (H4B4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-18822</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x Dulbecco' s</td><td>AppliChem</td><td>A0965</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (1,00U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%) with phenol red</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>96 well glass-bottom #0 plates</td><td>Cellvis</td><td>P96-0-N</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.7% 파라포름알데히드 (PFA)</td><td></td><td></td><td>PFA는 PBS에 용해, pH 7.5&nbsp;</td></tr><tr><td>Bafilomycin A1 100 mM 주식</td><td></td><td></td><td>Bafilomycin A1은 DMSO</td></tr><tr><td>Ferric ammonium citrate (FAC)에 희석되었습니다. 100 mg/mL 주식</td><td></td><td></td><td>FAC는 고압 멸균 이중 증류수</td></tr><tr><td>PBS/T</td><td></td><td></td> PBS에 희석되었으며<td>, 10% Tween20으로 보충되었습니다.</td></tr><tr><td>PBS/T + BSA</td><td></td><td></td><td>PBS, 10% Tween20, 1% BSA로 보충됨;</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 4.2.4</td><td>https://cellprofiler.org/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 버전 16.50</td><td>Microsoft Office Plus 365</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ferritinophagy: 인간 섬유아세포에서 자가포식에 의한 철의 선택적 분해 평가

Ferritinophagy: Assessing the Selective Degradation of Iron by Autophagy in Human Fibroblasts

건강한 기증자(그림 1A)의 인간 피부 유래 1차 섬유아세포(F-CO-60)는 바플로마이신 A1 처리를 사용한 후 내인성 페리틴 및 LAMP2의 면역염색, 자동 이미지 분석 및 CellProfiler 기반 분석을 사용하여 페리티노파지 평가를 위해 준비되었습니다(그림 1B).
내인성 페리틴과 LAMP2의 공동 국소화는 페리틴의 리소좀 분해가 바필로마이신 A1의 첨가에 의해 차단된 후 증가했으며, 이는 리소좀 V-ATPase 효소를 억제하여 페리티노파지를 차단하는 능력과 일치합니다7 (그림 2). 또한 소프트웨어 기반 세포 인식과 페리틴 및 LAMP2 인식이 예시로 나와 있습니다(그림 2).
이와 관련하여, 여기에 설명된 CellProfiler 파이프라인은 매우 다재다능하며, 기능적 단세포 마커 시스템의 맥락에서 세포 성장, 미토콘드리아 또는 기타 소기관에 대한 특정 BPAN 돌연변이의 영향을 평가하는 것과 같은 추가 및/또는 대체 판독에 적용할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig01.jpg"> 그림 1: 실험적 개요. 이 프로토콜에 설명된 대로 (A) 페리티노파지 과정 및 (B) 이 프로토콜에 설명된 대로 원발성 피부 유래 인간 섬유아세포에서 페리티노파지를 평가하기 위한 실험적 워크플로우를 그래픽으로 표현합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65110/65110fig02.jpg"> 그림 2: 대표 이미지. (A) bafilomycin A1이 없거나 (B) 존재하는 대조 배지(공급 조건)에서 1차 피부 유래 인간 섬유아세포는 항-페리틴 및 항-LAMP2 항체를 사용하여 간접 면역형광 분석을 받았고 세포핵은 DAPI로 염색되었습니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 자동화로 획득한 예시적인 형광 이미지가 제시됩니다(스케일 바: 10 μm). 페리틴 및 LAMP2 풍부도 및 공동 국소화의 변화는 바필로마이신 A1 투여에 대한 리소좀 억제 시 관찰될 수 있었습니다. 세포 인식(보라색), 핵(파란색), 페리틴(녹색), LAMP2(빨간색) 및 페리틴/LAMP2(노란색) 푼크타의 소프트웨어 파생 이미지 오버레이를 보여주는 CellProfiler 기반 분석도 표시됩니다. (C) 확대된 이미지 섹션(스케일 바 = 10μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/65110fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 이 연구에 사용된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 이 연구에 사용된 수치 CellProfiler 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Table%202.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 이 연구에 사용된 CellProfiler 파이프라인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: CellProfiler 파이프라인(보충 파일 1 참조)과 연속된 순서로 촬영한 스크린샷 표시(표 2 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65110/JoVE65110_.Supplemental%20FIle%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Ferritinophagy: 인간 섬유아세포에서 자가포식에 의한 철의 선택적 분해 평가

Mutations in the autophagy gene WDR45/WIPI4 are the cause of beta-propeller-associated neurodegeneration (BPAN), a subtype of human diseases known as ...

ferritinophagy-assessing-selective-degradation-iron-autophagy-human

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