Name: 인간 복재 정맥 내피 세포 분리 및 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레칭에 대한 노출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 배우세요 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 콜라게나아제로 분리하고 전단 응력 및 주기적 스트레칭을 적용하여 기계적 스트레스 반응을 연구하는 방법을. 혈관 생물학 및 내피 기능 연구에 필수적인 기술입니다.

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JEK는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 및 2013/17368-0] 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 및 309179/2013-0)의 보조금으로 지원됩니다. AAM은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP 2015/11139-5) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq(Universal - 407911/2021-9)의 보조금으로 지원됩니다.

<ol><li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery%3A+the+intimal+hyperplastic+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li>
<li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+responses+to+mechanical+stress%3A+where+is+the+mechanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li>
<li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li>
<li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-%CE%BAB+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133(2020).</li>
<li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li>
<li>Girão-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493(2021).</li>
<li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li>
<li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery%3A+an+exploratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+II.+Representative+vascular+beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li>
<li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413(2020).</li>
<li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt%2FeNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li>
<li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li>
<li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes%2C+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+%28KLF2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li>
<li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li>
<li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype%3A+implications+for+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li>
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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

복재 정맥 분절은 hSVEC를 성공적으로 분리하기 위해 최소 2cm가 되어야 합니다. 작은 세그먼트는 다루기가 어렵고 세포를 분리하기 위해 콜라게나제 용액을 유지하기 위해 혈관의 끝을 묶습니다. 감소된 내강 표면적은 배양을 확장하기에 충분한 세포를 생성하지 않습니다. 비 EC로 인한 오염 위험을 최소화하려면 복재 정맥 부분의 조작이 전체 절차 동안 매우 부드럽게해야합니다. 혈액을 제거하기 위해 피펫 팁을 내강 표면에 도입 할 때와 콜라게나제 용액을 도입 할 때는주의해야합니다. 효소 용액에 대한 노출은 비 EC에 의한 배양의 오염을 줄이기 위해 매우 잘 제어되어야 합니다(1시간 이내). 성장 인자 칵테일이 보충된 특정 EC 배지의 사용은 hSVEC 배양 성장에 매우 중요합니다. 배양 첫날 동안 헤파린을 추가로 섭취하면 정맥 분절에서 적혈구가 잔류하는 것을 줄이고 평활근 세포 증식을 억제하는 데 중요하다15. 실험을 위해 또는 배양을 유지하기 위해 세포를 통과시킬 때 40% 이상의 합류점으...

내피 세포 (EC) 기능 장애는 복재 정맥 이식 실패 1,2,3,4에서 핵심적인 역할을 한다. 전단 응력과 주기적 스트레칭의 지속적인 증가는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 전염증 표현형을 유도합니다3,4,5,6. 기본 분자 경로는 아직 완전히 이해되지 않았으며 시험관 내 연구를 위한 표준화된 프로토콜은 해당 분야의 새로운 통찰력을 위한 노력을 활용할 수 있습니다. 여기에서는 hSVEC를 분리, 특성화 및 확장하는 간단한 프로토콜과 정맥 및 동맥 혈역학적 조건을 모방하여 다양한 수준의 전단 응력 및 주기적 스트레치에 hSVEC를 노출시키는 방법을 설명합니다.
hSVEC는 콜라게나제 배양에 의해 분리되며 계대 8까지 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이용가능한 다른 프로토콜7에 비해 혈관 조작이 덜 필요하며, 이는 평활근 세포 및 섬유아세포에 의한 오염을 감소시킨다. 반면에 효율적인 EC 추출을 위해서는 최소 2cm의 더 큰 용기 세그먼트가 필요합니다. 문헌에서, 대형 용기로부터의 EC는 또한 기계적 제거에 의해서도 얻어질 수 있다고 보고되었다 7,8. 효과적이기는 하지만, 물리적 접근법은 낮은 EC 수율 및 더 높은 섬유아세포 오염의 단점을 갖는다. 순도를 높이려면 마그네틱 비드 또는 세포 분류를 사용하는 추가 단계가 필요하며, 비드 및 항체 획득으로 인한 프로토콜 비용이 증가합니다 7,8. 효소 방법은 EC 순도 및 생존력과 관련하여 더 빠르고 더 나은 결과를 나타냅니다 7,8.
내피 기능 장애를 연구하기 위해 가장 자주 사용되는 EC는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)입니다. EC 표현형은 상이한 혈관 층에서 변화하는 것으로 알려져 있으며, 조사중인 혈관을 나타내는 방법을 개발하는 것이 필수적이다 9,10. 이와 관련하여, hSVEC를 분리하고 기계적 스트레스 하에서 배양하기 위한 프로토콜의 확립은 정맥 이식 질환에서 hSVEC 기능 장애의 기여를 이해하는 데 유용한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-0.02% EDTA 용액</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>15 &마이크로; 슬라이드 I 0.4 Luer&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 등축방향 로딩 스테이션 25 mm&nbsp;</td><td>플렉셀 인터내셔널 코퍼레이션</td><td>LS-3000B25. VJW</td><td></td></tr><tr><td>8웰 챔버 슬라이드, 탈착식 웰</td><td>포함 Thermo Fisher Scientific</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid (Glacial)</td><td>Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 시트 1cm 두께</td><td>의 플렉시글라스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 항체</td><td>Abcam</td><td>ab24590</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31, FITC 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD3101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VE-cadherin 항체</td><td>Cell Signaling</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>Bioflex plates collagen I</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>BF3001C</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td><td>Brasuture</td><td>AP524</td><td></td></tr><tr><td>Cyclophilin forward primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Custom 설계된</td><td></td></tr><tr><td>사이클로필린 리버스 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>맞춤형 설계</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 기초 매체</td><td>Lonza</td><td>CC3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuots 보충제</td><td>Lonza</td><td>CC4176</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2657-029</td><td></td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000 장력 시스템</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX-5000T</td><td></td></tr><tr><td>플루오로마운트 수성 장착 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>돼지 껍질의 젤라</td>틴 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 토끼 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>돼지 장 점막의 헤파린 나트륨 5000 IU/mL</td><td>Blau Farmac&ecirc; utica</td><td>SKU 68027</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi 펌프 시스템(펌프 + 유체 장치)</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr><tr><td>KLF2 포워드 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>맞춤형 KLF2</td><td></td></tr><tr><td>리버스 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>맞춤형 KLF4</td><td></td></tr><tr><td>포워드 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>맞춤형 KLF4</td><td></td></tr><tr><td>리버스 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>맞춤형 NOA</td><td></td></tr><tr><td>280 산화질소 분석기</td><td>시버 기기</td><td>NOA-280i-1</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 포워드 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 리버스 프라이머</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>관류 세트 15cm, ID 1.6mm, 빨간색, 10mL 리저브</td><td>Ibidi</td><td>10962</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>요오드화</td> <td>칼륨Sigma-Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>QuanTitec SYBR 녹색 PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12K 플렉스 플랫폼&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471087</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 마이크로 키트&nbsp;</td><td>Quiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 유리(24mm x 60mm)</td><td>니트 유리</td><td>VD12460Y1D.01</td><td></td></tr><tr><td>아질산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31443</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV 1차 가닥 합성 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18091200</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td>의 II형 콜라겐분해효소</tr></tbody></table>

인간 복재 정맥 내피 세포 분리 및 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레칭에 대한 노출

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

관상동맥우회술(CABG) 수술은 허혈성 심근을 혈관재생시키는 절차입니다. 복재 정맥은 동맥 도관에 비해 감소된 장기 개통성에도 불구하고 CABG 도관으로 계속 사용됩니다. 이식편 동맥화와 관련된 혈역학적 스트레스의 급격한 증가는 복재 정맥 이식편(SVG)의 낮은 개통성에 영향을 미칠 수 있는 혈관 손상, 특히 내피를 초래합니다. 여기에서 우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 분리, 특성화 및 확장에 대해 설명합니다. 콜라게나제 분해에 의해 분리된 세포는 전형적인 조약돌 형태를 나타내고 내피 세포 마커인 CD31 및 VE-cadherin을 발현합니다. 기계적 응력 영향을 평가하기 위해 이 연구에서 동맥화된 SVG에 대한 두 가지 주요 물리적 자극인 전단 응력과 스트레치를 조사하기 위해 프로토콜을 사용했습니다. hSVEC는 평행판 유동 챔버에서 배양되어 전단 응력을 생성하여 유동 방향으로의 정렬과 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현 증가를 보여줍니다. hSVEC는 또한 정맥(저) 및 동맥(고) 스트레칭을 모방하여 제어된 세포 스트레치를 허용하는 실리콘 멤브레인에서 배양될 수 있습니다. 내피 세포의 F-액틴 패턴과 산화질소(NO) 분비는 동맥 스트레칭에 의해 그에 따라 조절됩니다. 요약하면, 우리는 내피 표현형에 대한 혈역학적 기계적 스트레스의 영향을 연구하기 위해 hSVEC를 분리하는 자세한 방법을 제시합니다.

일반적으로 부착된 EC는 추출 후 3-4일 후에 관찰할 수 있습니다. hSVEC는 초기에 세포 클러스터를 형성하고 전형적인 "조약돌" 형태를 나타냅니다(그림 1B). 이들은 EC 마커 CD31(그림 1C,D) 및 VE-카데린(그림 1D)을 발현합니다. hSVEC는 코팅되지 않은 처리된 세포 배양 접시에서 쉽게 증식할 수 있으며 최대 8계대 배양에서 내피 표현형을 유지합니다.
hSVEC는 전단 응력 하에서 배양될 때 유동 방향으로 정렬됩니다(그림 2A). 72시간 동안 20dyn/cm2의 전단 응력은 전형적인 기계 민감성 유전자인 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현을 유도하여 hSVEC에서 전단 자극의 효과를 나타냅니다(<strong c...

우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 hSVEC의 기계적 응력을 연구하기 위해 전단 응력과 스트레치를 생성하는 자세한 방법을 제공합니다.

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

복재 정맥은 관상 동맥 우회 수술 후 갑자기 동맥 상태에 노출됩니다. 기계적 스트레스에 대한 적응 반응을 이해하면 정맥 이식 실패를 예방하기 위한 치료 도구를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 내피 세포 분리 프로토콜은 매우 간단하며 콜라게나제와 함께 배양하기만 하면 됩니다.최소한의 혈관 조작으로 평활근 세포와 섬유아세포의 오염을 줄일 수 있습니다. 인간 SVEC를 분리하고 전단 응력 및 주기적 스트레칭 하에서 배양하기 위한 프로토콜은 복재 정맥 이식 실패와 관련된 내피 세포 기능 장애에서 기계적 힘의 기여를 이해하는 데 필수적입니다. 이전의 내피 세포 배양은 세포 배지 보충제 측면에서 매우 까다롭습니다.배양물인 인간 SVEC를 성공적으로 분리하기 위해서는 성장 인자를 추가하는 것이 필수적입니다. 일차 인간 복재 정맥 내피 세포 또는 인간 SVEC를 분리하기 위해 최소 2-3cm 길이의 복재 정맥 세그먼트를 수집합니다. 멸균 층류 후드 아래에서 작업하면서 정맥 세그먼트를 예열 된 PBS로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.내강 내부의 모든 혈액을 제거하려면 피펫에 부착되고 PBS로 채워진 피펫 팁을 정맥의 한쪽 끝에 삽입하고 부드럽게 씻어냅니다. 세탁 흐름이 완전히 깨끗해질 때까지 세척하십시오. 그런 다음 멸균 면봉사로 정맥의 한쪽 끝을 막습니다.용기에 밀리리터 콜라게나제 유형 2 용액 1 밀리그램을 조심스럽게 채우고 면봉사로 용기의 다른 쪽 끝을 닫습니다. 콜라게나제 용액으로 용기를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소의 가습 분위기에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용기의 한쪽 끝을 15밀리리터 튜브 위로 절단하여 다른 쪽 끝을 절단하기 전에 콜라게나제 용액을 수집합니다.1-2 밀리리터의 PBS로 내강 표면을 플러시하여 콜라겐 분해 효소로 튜브 내부의 모든 분리 된 내피 세포를 수집합니다. 튜브를 실온에서 400G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거한 후, 추가 헤파린 용액을 함유하는 3 내지 4 밀리리터의 완전한 내피 세포 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시킨다.부피당 3% 중량의 젤라틴으로 미리 코팅된 60mm 세포 배양 접시에 세포를 플레이트합니다. 배지를 변경하지 않고 4일 동안 가습된 분위기에서 세포를 배양합니다. 그 후, 헤파린 보충제를 추가하지 않고 격일로 배지를 변경하십시오.적혈구가 제거되었는지 확인하기 위해 현미경으로 플레이트를 검사합니다. 추출 후 1-4일 후, 정맥 세그먼트의 크기와 직경에 따라 위상차 현미경으로 인간 SVEC를 시각화하여 합류 정도와 조약돌 형태를 평가합니다. 세포가 70%에서 80%의 밀도에 도달할 때까지 이틀에 한 번씩 배지를 계속 교체합니다.유량 챔버 슬라이드를 부피당 0.1% 중량 젤라틴으로 코팅하고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다. 유체 유닛 및 10 밀리미터 저장조를 갖는 멸균 관류 세트를 평형화시키기 위해, 이들을 가습된 대기에서 밤새 배양한다. 전단 응력 실험을 위해, 200, 000 내피 세포를 100 마이크로리터의 배양 배지에 현탁시켜 젤라틴이 코팅된 유동 챔버 슬라이드 내로 시드하였다.세포를 배양 표면에 부착시키기 위해, 세포를 4시간 동안 배양한다. 유체 장치에 관류 세트를 놓습니다. 저장소와 관류 세트를 약 12 밀리리터의 예열 된 완전한 내피 세포 배지로 채 웁니다.관류 세트에서 기포를 제거하여 두 저장소의 수위를 5밀리리터로 평형을 이룹니다. 인큐베이터의 챔버 슬라이드 없이 장착된 관류 세트에 유체 장치를 놓고 전기 케이블을 컴퓨터 조절 펌프에 연결합니다. 펌프 제어 소프트웨어에서 사전 정의된 프로토콜을 실행하여 저장소와 관류 세트에서 모든 기포를 제거합니다.층류 후드에 장착된 관류 세트가 있는 유체 장치를 취하여 합류 셀 단층을 갖는 슬라이드를 부착합니다. 인큐베이터에 슬라이드가있는 전체 장치를 배치 한 후 전기 케이블을 펌프에 연결하십시오. 펌프 제어 소프트웨어에서 슬라이드 유형을 선택하고 매체의 점도를 설정하여 유체 장치 설정을 조정합니다.흐름 매개변수(Flow Parameters)에 전단 응력 값을 입력하고 사이클 지속 시간과 흐름 유형을 설정합니다. 그런 다음 재생 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다. 정적 대조군과 같은 흐름에 노출되지 않고 동일한 매체로 처리된 세포로 슬라이드를 유지하는 것을 잊지 마십시오.실리콘 기반 윤활유를 25mm 6웰 등이축 로딩 스테이션의 상단과 측면에 도포합니다. 종자 400, 000 세포를 콜라겐으로 코팅된 6-웰 유연 바닥 배양 플레이트의 각 웰에 3 밀리리터에 현탁시켰다. 세포가 100% 합류도에 도달할 때까지 가습된 공기에서 세포를 배양합니다.스트레치 프로토콜을 시작하기 전에, 예열된 PBS로 세포를 한 번 세척하고, 웰 당 3밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가한다. 인큐베이터에 윤활된 모든 로딩 스테이션이 있는 베이스 플레이트를 삽입하고 튜브를 텐션 셀 스트레칭 바이오리액터 시스템의 컨트롤러 장비와 적절하게 연결합니다. 각 배양 플레이트를 바이오리액터 시스템에서 제공하는 하나의 빨간색 개스킷에 부착합니다.그런 다음 인큐베이터의베이스 플레이트에 넣으십시오. 적절한 진공 및 스트레칭 부하를 얻기 위해 4개의 배양 플레이트를 모두 베이스 플레이트에 놓습니다. 컨트롤러 장비와 컴퓨터 시스템을 켭니다.FlexCell 제어 소프트웨어를 열고 연신율, 파형 모양, 주파수 및 시간의 백분율을 포함하여 원하는 요법을 구성합니다. 요법을 저장하십시오. 진공 시스템을 켠 다음 요법을 선택하고 컴퓨터 화면에서 시작을 클릭하여 스트레칭을 실행합니다.실리콘 멤브레인이 움직이고 셀을 늘리고 있는지 확인하십시오. 부착된 내피세포는 추출 후 4 내지 10일 후에 관찰할 수 있었다. 그들은 처음에 전형적인 조약돌 형태를 나타내는 세포 클러스터를 형성합니다.그들은 EC 마커 CD31과 VE-cadherin을 발현했습니다. hSVECs는 전단 응력 하에서 배양될 때 유동 방향으로 정렬된다. 72시간 동안 제곱센티미터당 20 다인의 전단 응력은 전형적인 기계 감응 유전자인 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현을 유도하여 전단 자극의 효과를 나타냅니다.주기적 스트레칭 결과는 인간 SVEC에 적용되는 강도에 따라 다릅니다. 낮은 스트레치 하의 세포는 정적 세포와 유사한 피질 F-액틴 패턴을 보였다. 최대 72시간 동안 산화질소 방출의 변화 없이, 우리의 동맥 스트레치 수준은 24시간 후에 액틴 세포 골격을 리모델링하고 72시간 후에 NO 방출을 감소시켰습니다.기계적 스트레스 연구 외에도 연구자들은 분리된 세포를 사용하여 내피 세포 기능 및 기능 장애에 대한 지식을 확장하기 위한 다양한 방법을 수행할 수 있습니다. 입증된 프로토콜에 따라 전단 응력 및 스트레칭 하에서 다른 유형의 내피 세포를 연구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

내막 증식증 (IH) 및 정맥 이식 실패의 개발로 이어지는 메커니즘은 아직 제대로 이해하고 있습니다. 이 연구는 제어 흐름과 압력 하에서 인간의 혈관을 관류하는 생체 시스템을 설명합니다. 또한 외부 메쉬 보강 효율 IH의 개발 평가 하였다 제한한다.

인간 복재 정맥 절차 전의 VIVO 관류 및 외부 보강

유체 전단의 다양한 수준과 패턴은 내피 유전자 발현, 표현형 및 질병에 대한 감수성을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 '전단 고리'의 조립과 사용에 대해 논의합니다: 단방향, 주기적인 전단 응력 패턴을 생성하는 모델입니다. 전단 링은 조립이 간단하고 경제적이며 높은 세포 수율을 생성할 수 있습니다.

총회와 &#39;전단 반지&#39;의 응용 프로그램 : 궤도, 단방향 및 정기 유체 흐름 및 전단 응력에 대한 소설 내피 모델

여기, 유체 전단 응력에서 내 피 세포의 문화 및 유전자 표정 분석에 대 한 워크플로 제공 됩니다. 포함 된 동시에 주택 및 제어 환경에 양이 많은 PCR에 대 한 참조 외 인 RNA 사용 하 여 여러 흐름 챔버 모니터링에 대 한 물리적 배열이입니다.

가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석

이 프로토콜의 목적은 전단 응력에 의한 메카노민성 이온 채널의 실시간 활성화를 조사하는 데 사용하기 위해 변형된 병렬 플레이트 플로우 챔버를 설명하는 것이다.

잘 정의된 전단 응력 하에서 단세포 이온 전류의 전기 생리학적 기록

본 프로토콜은 궤도 셰이커 모델을 사용하여 전단 응력 응용을 위한 6웰 플레이트의 특정 영역으로 내피 세포 성장을 제한하는 코팅 방법을 설명한다.

메카노생물학적 연구를 위한 궤도 셰이커에 6웰 플레이트에서 내피 세포의 분할 성장

여기서, 병리학및 생리학적 유체 전단 응력 조건에 노출된 내피 세포에서 근접 계각 분석(PLA)을 사용하여 여러 SMAD 복합체를 동시에 시각화하고 분석하는 프로토콜을 수립합니다.

근접-리깅-분석기 사용 이체 유체 전단 응력 조건 하에서 TGFβ/BMP/SMAD 신호의 시각화 및 정량화

여기에서는 인간 대동맥 벽에서 평활근 세포의 생체 내 생체 역학적 변형을 복제하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델을 개발했습니다.

대동맥 벽의 생체 역학적 변형을 요약하기 위한 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델 구축

여기에는 내피 세포와 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 간단한 워크플로우와 기계적 자극에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이를 통해 내피 세포의 발달 역학을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 기계적 자극 후 배양 칩에서 수집된 살아있는 세포의 다운스트림 분석과 호환됩니다.

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

배우세요 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 콜라게나아제로 분리하고 전단 응력 및 주기적 스트레칭을 적용하여 기계적 스트레스 반응을 연구하는 방법을. 혈관 생물학 및 내피 기능 연구에 필수적인 기술입니다.

인간 복재 정맥 내피 세포 분리 및 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레칭에 대한 노출

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