Name: CLON-G 및 In Vitro Spontaneous Death Assay를 통한 호중구 수명 연장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 배우세요 CLON-G 배양액을 이용하여 호중구 수명을 5일 이상 연장하고 기능을 유지하는 방법을. 유세포 분석기와 공초점 형광 현미경으로 세포 사멸을 평가하는 프로토콜입니다.

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이 프로젝트는 하이허 세포 생태계 혁신 기금 연구소(22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), 중국 의학원(CAMS) 의료 과학 혁신 기금(2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), 중앙 대학 특별 연구 기금, 북경 연합 의과 대학(3332022062) 및 쓰촨성 과학 기술 지원 프로그램(NO. 2021YJ0480).

Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology(SKLEH) 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 절차를 승인하고 모니터링했습니다. 도 1 은 CLON-G를 이용한 호중구 배양 및 시험관 내 사멸 분석의 흐름도를 나타낸 것이다.
1. CLON-G를 이용한 호중구 수명 연장
알림: 언급된 모든 작업 및 재료는 멸균되어야 합니다. 모든 솔루션이 잘 혼합되고 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
<ol><li>CLON-G 구성품 보존<ol><li>973.7 μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 50 mg의 Q-VD-oph( 재료 표 참조)를 100 mM의 최종 농도로 용해시키고, 혼합물이 투명해질 때까지 액체를 피펫팅한다. 튜브당 50 μL를 분취하고, -20°C에서 보존한다. 주의 : DMSO는 유해한 약액입니다. 피부 접촉, 눈 접촉 및 흡입을 피하기 위해 실험복, 고글 및 마스크를 착용하십시오.</li>
		<li>Hsp70( 재료 표 참조)을 4°C에서 해동하고 바이알의 내용물을 회전시킵니다. 얼음 위의 튜브당 Hsp70 1μL를 분취하고 -80°C에서 보존합니다. 참고: Hsp70은 단백질입니다. 안정적으로 유지하려면 초저온 보관이 필요합니다. 동결-해동 주기를 피하십시오.</li>
		<li>1mg의 DFO( 재료 표 참조)를 7.61mL RPMI 1640에 용해시켜 튜브당 200μM의 스톡을 얻습니다. 분취량 500μL, -20°C에서 보존합니다.</li>
		<li>0.1 g의 NAC( 재료 표 참조)를 2.5 mL의 RPMI 1640과 함께 15 mL 원심분리기 튜브에 녹이고 NaOH로 pH를 7-7.4로 조정합니다. RPMI 1640을 최종 부피 3.06mL에 추가하여 200mM NAC 스톡을 만듭니다. 0.2μm 필터링 장치로 필터링합니다. 튜브당 분취량 500 μL, -20°C에서 보존. 참고: 이 고농도에서 NAC를 용해하는 것은 쉽지 않으며 소용돌이가 용해하는 데 도움이 될 수 있습니다. RPMI 1640의 페놀 레드는 pH의 완벽한 표시입니다. NAC가 방금 용해되면 색상이 황색을 띠게 됩니다. 분홍빛이 날 때까지 조정하십시오. NAC 원액은 -20°C에서 최대 1개월 동안 안정적입니다.</li>
		<li>10mg의 Nec-1s( 재료 표 참조)를 1.8mL의 DMSO와 함께 20mM에 용해시키고 투명해질 때까지 혼합물을 피펫팅합니다. 튜브당 50 μL를 분취하고, -20°C에서 보존한다. 빛으로부터 보호하십시오.</li>
		<li>250 μg의 G-CSF( 재료 표 참조)를 1.25 mL의 RPMI 1640과 함께 200 μg/mL로 용해시킵니다. 튜브당 분취액 50 μL를 4°C에서 보존한다.</li>
	</ol></li>
	<li>2x CLON-G 배지의 제조<ol><li>기본 매체를 준비하십시오. RPMI 1640 39.5mL, 소 태아 혈청(FBS) 10mL, pen-strep(항생제) 0.5mL를 50mL 튜브에 넣어 20% FBS 및 1% PS를 기본 배지로 사용하여 RPMI 1640을 만듭니다. 참고: 이 고농도의 FBS는 5일 이상일 수 있는 호중구의 장기간 배양을 제공하는 데 사용됩니다. 배양 시간이 1-2일이면 10%-15% FBS이면 충분합니다.</li>
		<li>CLON-G 구성품의 모든 원액을 얼음 위에서 해동합니다.</li>
		<li>염기성 배지 606 μL를 첨가하여 Hsp70 1 μL를 20 μM으로 희석한다. 염기성 배지 9μL를 추가하여 200μg/mL G-CSF 1μL를 20μg/mL로 희석합니다.</li>
		<li>976 μL의 염기성 배지를 15 mL 원심분리기 튜브에 추가합니다. Q-VD-oph (100 mM) 1 μL, DFO (200 μM) 10 μL, Hsp70 (20 μM) 1 μL, NAC (200 mM) 10 μL, Nec-1s (20 mM) 1 μL, G-CSF (20 μg/mL) 1 μL를 넣어 1 mL의 2x CLON-G 배지를 만든다. 알림: 2x CLON-G 배지는 준비된 직후에 사용해야 합니다. 2x CLON-G를 4°C에서 임시로 보관할 수 있다. 남은 20μM Hsp70은 폐기해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>호중구 배양<ol><li>이전 보고서25에 따른 구배 원심분리에 의해 마우스 호중구를 분리합니다. 분리된 마우스 호중구를 염기성 배지(100만 세포/100μL)에 재현탁합니다. 알림: 호중구를 부드럽게 다루어 활성화하지 마십시오. 전체 과정에서 거품이 생기지 않도록 하십시오.</li>
		<li>2x CLON-G 배지 500μL, 염기성 배지 400μL, 세포 현탁액 100μL를 24웰 비조직 배양 배양 플레이트(표 표 참조)에 넣고 3-4회 부드럽게 피펫팅합니다. 참고: 2x CLON-G 배지의 성분 농도가 높으면 호중구가 손상될 수 있습니다. 기본 매체 없이 함께 추가하지 마십시오. 비조직 배양 배양 플레이트는 호중구 부착을 피하기 위해 필요하다.</li>
		<li>배양 접시를 37°C 및 5%CO2 배양기에 넣고 원활하게 한다. 참고: 7일 이내에 세포 배지를 교환할 필요가 없습니다. CLON-G 조성물의 최종 농도는 50μM Q-VD-Oph, 1μM DFO, 10pM Hsp70, 1mM NAC, 10μM Nec-1s 및 10ng/mL G-CSF입니다.</li>
		<li>배양된 호중구를 라이트김사 화합물로 염색하고(표 재료 표 참조), 광학 현미경으로 분석한다(도 2A-D). 대안적으로, APC-CD11b 및 PE-Cy7-Ly6G 항체로 염색하고, 앞서 설명한 바와 같이 유세포 분석기 (도 2E-I)로 분석한다(도 26).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 호중구의 시험관 내 자발적 사망 분석
<ol><li>유세포 분석<ol><li>분리된 호중구를 37°C 및 5%CO2의 염기성 배지에서 100만 cells/mL의 밀도로 배양했습니다. 24-웰 배양 플레이트는 비-조직 배양된다. 웰 당 1 mL의 세포 배지를 첨가한다.</li>
		<li>1 g의 CaCl2를 45 mL의 식염수와 함께 녹여 200 mMCaCl2를 만든다. 0.2μm 필터링 장치로 필터링합니다. 4 °C에서 보존.</li>
		<li>염색 혼합물을 준비합니다. 1.5mL 튜브에 시료당 7μL의 식염수를 추가하고 시료당 각각 1μL씩 0.4mg/mL FITC-Annexin-V, 0.5mg/mL 요오드화 프로피듐(PI) 및 200mMCaCl2 용액을 각각 1μL씩 추가합니다. 잘 섞다. 준비 직후에 용액을 사용하십시오.</li>
		<li>세포 배지를 5 내지 7회 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞은 다음, 원하는 시점에 100 μL를 유세포 분석 튜브에 옮겼다. 알림: 전체 과정에서 거품이 생기지 않도록 하십시오.</li>
		<li>소용돌이 계산 구슬 ( 재료 표 참조)을 잘 혼합합니다. 잘 혼합된 계수 비드 10 μL를 단계 2.1.4에서와 동일한 유세포 분석 튜브에 피펫팅한다.</li>
		<li>제조된 염색 혼합물(단계 2.1.3)을 유세포 분석 튜브에 10 μL를 첨가한다. 빛을 피해 실온에서 5분간 배양한다.</li>
		<li>100 μL의 식염수를 튜브에 넣고 잘 섞어 계수 비드와 세포의 균일한 분포를 보장합니다.</li>
		<li>세포 배지의 유세포 분석을 수행합니다. ~400 events/s로 낮은 속도로 세포를 수집합니다. APC-PE-Cy7-세포를 FSC-A 및 SSC-A로 게이트하고, 배지 FSC-A 및 SSC-A 위치를 갖는 온전한 세포를 FITC-Annexin-V 및 PE-PI로 게이트하고; Annexin-V−PI− 집단은 건강한 세포로 분류됩니다. 참고: 다음 방정식은 샘플당 건강한 세포의 총 수와 호중구의 생존력을 결정합니다. 시료당 건강한 세포의 총 수27 = (1,000/계수 비드 수) × Annexin-V−PI− 모집단 수 × 10 호중구의 생존력 = 표시된 시간의 총 건강한 세포 수/시간 0의 총 건강한 세포 수</li>
	</ol></li>
	<li>형광 이미지 분석<ol><li>분리된 호중구를 37°C의 염기성 배지에서 100만 cells/mL의 밀도로 배양하고 플레이트당 2mL의 세포 배지를 갖는 공초점 플레이트에서 5%CO2 로 배양했습니다. 참고: 컨포칼 형광 현미경은 최상의 이미지 품질을 제공하지만 488/561/DIC 채널이 있는 형광 현미경은 이 실험을 지원하기에 충분합니다.</li>
		<li>표시된 시점에 접시를 부드럽게 꺼냅니다. 0.4mg/mL FITC-Annexin-V, 0.5mg/mL PI 및 200mMCaCl2 를 각각 10μL씩 플레이트에 골고루 추가합니다. 실온에서 5분간 얼룩지게 한다. 알림: 전체 과정에서 흔들리지 마십시오. 염색제를 고르고 부드럽게 첨가하십시오.</li>
		<li>20x 대물 렌즈가 장착된 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 488(Annexin-V)/561(PI)/DIC 채널에서 형광 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조). 488 채널의 노출 시간을 500ms로, 561 채널을 200ms로, DIC 채널을 100ms로 설정합니다. 각 플레이트에 대해 5-10개의 무작위 영역을 선택합니다. 세포 유형은 이전에 발표된 보고서14에 정의되어 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 연구가 이해 상충없이 수행되었다고 선언합니다.

호중구는 선천성 면역과 후천성 면역에 중요한 역할을 하며, 호중구의 항상성은 엄격하게 조절됩니다. 호중구는 인간의 말초 혈액에서 가장 풍부한 백혈구이며 강력하고 빠른 회전율을 가지고 있습니다. 건강한 성인은 매일 1 x 109 호중구/kg을 골수에서 배출할 수 있다28. 따라서 호중구의 죽음은 이 분야의 수수께끼 같은 수수께끼 중 하나가 되었으며, 호중구를 더 잘 이해하기 위해 많은 노력을 기울였습니다. 카스파제 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33, 괴사 34,35,36,37 및 괴사 18,38은 이러한 이질적인 과정...

호중구는 풍부한 세포질 과립, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH) 산화효소, 항균 효소 및 침입하는 미생물을 방어하는 다양한 세포 기관의 무기고를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 또한, 그들은 운동성이 높고 염증 부위에 모집 된 첫 번째 세포이며, 이는 호중구가 선천성 면역계의 첫 번째 방어선임을 의미합니다 1,2. 따라서 과립구 수혈 요법은 호중구 면역을 일시적으로 증가시키기 위해 호중구 감소증 관련 감염에 대한 유망한 임상 치료법이 되었다 3,4,5. 최근의 발견은 호중구가 많은 생리병리학적 시나리오에서 다면적 효과기로도 기능한다는 것을 분명히 보여주었다6. 호중구의 평균 수명은 24시간 미만이며, 따라서 호중구에 대한 기초 연구와 호중구 연구의 적용은 안정적인 유전자 조작 및 장기 저장과 관련된 한계로 인해 매우 어렵습니다 7,8,9,10,11 . HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 및 유도만능줄기세포(12)와 같은 일부 호중구 기능을 부분적으로 나타낼 수 있는 세포주가 있다. 이러한 세포주는 효과적인 유전자 편집 및 냉동 보존을 달성할 수 있습니다. 그러나 그것들은 여전히 일차 호중구와 상당히 다르기 때문에 호중구 기능을 충실하게 요약할 수 없다13. 따라서 이 분야의 대부분의 연구는 여전히 새로 분리된 1차 호중구에 의존합니다. 이 분야는 여전히 호중구의 특정 유전자 기능을 조사하기 위해 비용과 시간이 많이 소요되는 조건부 녹아웃 마우스를 생성하는 데 의존하지만 현재 인간 모델은 존재하지 않습니다.
호중구 사멸과 관련된 이질적인 과정과 이러한 과정을 조절하는 여러 경로를 탐구하기 위해 노력한 결과,14,15, CLON-G(카스파제-리소좀 막 투과화-산화제-괴사 억제 및 과립구 집락 자극 인자)라는 새로운 치료법이 최근 보고되었다16. CLON-G는 Q-VD-oph(퀴놀릴-발릴-O-메틸아스파르틸-[-2,6-디플루오로페녹시]-메틸 케톤), Hsp70(열충격 단백질 70), DFO(데페록사민), NAC(N-아세틸시스테인), Nec-1s(네크로스타틴-1s) 및 G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자). 호중구 자연사는 세포자멸사, 괴사증 및 파이롭토시스를 포함한 여러 경로에 의해 매개됩니다. Q-VD-oph는 카스파아제 1, 카스파아제 3, 카스파아제 8, 카스파아제 9를 표적으로 하여 pan-카스파아제 억제제로서 호중구의 세포자멸사를 억제한다17. 호중구 괴사는 수용체 상호작용 단백질 키나아제-1(RIPK1) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사 단백질(MLKL)18을 포함하는 신호 전달 경로에 의존합니다. RIPK1 억제제로서 Nec-1s는 호중구의 괴사를 억제합니다. Hsp70 및 DFO는 리소좀 막 투과화(LMP)를 억제할 수 있으며, 이는 호중구 세포자멸사(hotrophil apoptosis)19 및 파이롭토시스(pyroptosis)20를 유도할 수 있다. 활성산소종(ROS)은LMP19와 세포자멸사를 매개하고 생존 신호(22)를 억제함으로써 호중구 사멸에 중요한 역할을 한다. ROS 축적을 줄일 수 있는 항산화제인 NAC는 호중구 사멸을 지연시킵니다. 성장 인자로서 G-CSF는 호중구 생존 신호를 활성화하고 칼파인 유도 세포 사멸을 억제합니다23,24. 여러 호중구 자발적 사망 경로를 동시에 표적으로 삼음으로써 호중구 수명을 기능 저하 없이 5일 이상으로 효과적으로 연장할 수 있습니다. CLON-G 치료는 호중구 보존, 수송 및 유전자 조작의 가능성을 확장하여 호중구 군집에서의 연구를 가속화할 수 있습니다. 한편, 호중구 사멸에 대한 지식에 기초하여, 세포 사멸 분석을 위해 현재 승인된 프로토콜은 호중구(14)에 예기치 않은 손상을 일으킬 수 있으므로, 이들 프로토콜은 호중구 연구에 더 적합하도록 개선되었다. 이 보고서는 CLON-G를 사용한 호중구 배양과 유세포 분석 및 형광 이미징을 사용한 마우스 호중구의 시험관 내 세포 사멸 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. CLON-G는 마우스와 인간 호중구 모두에 효과적입니다. 그러나 이 프로토콜을 단순화하기 위해 마우스 샘플이 여기에 설명되어 있습니다. NAC의 농도는 마우스 호중구의 경우 1mM이고 인간 호중구의 경우 10μM입니다. Hsp70은 종 특이적이므로 호중구의 공급원에 따라 활용되어야 합니다. 이 프로토콜의 경우 호중구가 말초 혈액 또는 골수에서 분리되는지 여부와 분리 방법은 중요하지 않습니다.
본 연구를 위해, 호중구는 실험을 위한 충분한 호중구를 달성하기 위해 마우스 골수로부터 분리되었는데, 이는 약 1 x 10 7-1.5 x 107 호중구가 골수로부터 얻어질 수 있는 반면, 단지 1 x 10 6 호중구만이 단일 8-12주령 C57BL/6 마우스(성별 모두)의 말초 혈액으로부터 분리될 수 있기 때문이다. 구배 원심분리는 FACS 분류 또는 MACS 분류의 기계적 자극으로부터 가능한 손상 및 활성화를 피하기 위해 수행되었다.

<table><tbody><tr><td>0.2 & 마이크로; m 주사기 필터</td><td>Pall Corporation</td><td>4612</td><td>여과액은 CLON-G 구성 요소를 준비했습니다.</td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>LABSELECT</td><td>MCT-001-150</td><td>실험실 소모품.</td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>LABSELECT</td><td>CT-002-15</td><td>실험실 소모품.</td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td><td>Falcon</td><td>351147</td><td>호중구 배양 플레이트.</td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>LABSELECT</td><td>CT-002-50</td><td>실험실 소모품.</td></tr><tr><td>BD LSRII</td><td>BD</td><td></td><td>호중구 사멸의 유세포 분석을 위한 기기.</td></tr><tr><td>염화칼슘 (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>Annexin-V 결합의 보조제&nbsp; 포스파티딜세린.</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Perkinelmer</td><td>UltraVIEW VOX</td><td>호중구 사멸의 형광 분석을 위한 기기.</td></tr><tr><td>형광 이미지 분석을 위한</td> <td>공초점 플레이트</td><td>NEST</td><td>801001-20mm</td> 실험실 소모품.</tr><tr><td>카운팅 비드</td><td>Thermo Fisher</td><td>C36950</td><td>호중구 사멸의 유세포 분석 정량화.</td></tr><tr><td>DFO</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D9533</td><td>CLON-G의 구성 요소. LMP 억제제.</td></tr><tr><td>디메틸 설폭시드 (DMSO)</td> <td>Q-VD-oph 및 Nec-1 용</td> <td>시그마 Aldrich</td><td>D2650</td> 용제.</tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td>호중구 배양 기본 배지의 구성 요소. 영양 공급.</td></tr><tr><td>FITC-Annexin-V</td><td>BD</td><td>51-65874X</td><td>Annexin-V는 노화된 세포의 포스파티딜세린에 결합할 수 있습니다. 이것은 FITC 채널에 있습니다.</td></tr><tr><td>Hsp70</td><td>Abcam</td><td>ab113187</td><td>CLON-G의 구성 요소. LMP 억제제.</td></tr><tr><td>NAC</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A9165</td><td>CLON-G의 구성 요소. 항 산화.</td></tr><tr><td>Nec-1s</td><td>EMD Millipore</td><td>852391-15-2</td><td>CLON-G의 구성 요소. 괴사억제제.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액(PS)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>호중구 배양 기본 배지의 구성 요소. 박테리아 오염으로부터 세포를 보호하기 위한 항생제.</td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물(PI)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td>호중구 사멸 분석용. DNA에 결합하는 작은 형광 분자&nbsp; 그러나 온전한 원형질막을 가진 세포를 수동적으로 횡단할 수 없습니다.</td></tr><tr><td>Q-VD-oph</td><td>Selleck chem</td><td>S7311</td><td>CLON-G의 구성 요소. Pan-caspase 억제제.</td></tr><tr><td>주사를 위한 재조합 인간 과립구 콜로니 자극 인자(CHO 세포)(G-CSF)</td><td>Chugai Pharma China</td> CLON-G의 <td>GRANOCYTE</td><td>구성 요소&nbsp; Akt 경로를 통해 호중구 생존을 촉진합니다.</td></tr><tr><td>둥근 바닥 폴리스티렌 튜브</td><td>Falcon</td><td>100-0102</td><td>유세포 분석을 위한 실험실 소모품.</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>호중구 배양 기본 매체의 구성 요소.</td></tr><tr><td>식염수</td><td>LEAGENE</td><td>R00641</td><td>호중구 사멸의 유세포 분석을 위한 솔루션.</td></tr><tr><td>수산화 나트륨 (NaOH)</td> <td>FENG CHUAN</td><td>13-011-00029</td><td>NAC의 pH 조정.</td></tr><tr><td>Wright-Giemsa 염색 용액</td><td>Solarbio</td><td>G1020</td><td>호중구 사이토스핀 염색.</td></tr></tbody></table>

clon-g 및 in vitro spontaneous death assay를 통한 호중구 수명 연장

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

호중구의 평균 수명은 24시간 미만으로 호중구에 대한 기초 연구와 호중구 연구의 적용을 제한합니다. 우리의 이전 연구는 여러 경로가 호중구의 자발적인 죽음을 매개할 수 있음을 나타냅니다. 카스파제-리소좀 막 투과-산화제-괴사 억제와 과립구 집락 자극 인자(CLON-G)와 같은 경로를 동시에 표적으로 삼아 칵테일을 개발하여 호중구 기능을 크게 손상시키지 않으면서 호중구 수명을 5일 이상으로 연장했습니다. 동시에 호중구 사망을 평가하고 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 안정적인 프로토콜도 개발되었습니다. 본 연구에서는 CLON-G가 시험관 내에서 호중구의 수명을 5일 이상으로 연장할 수 있음을 보여주고, FACS 및 공초점 형광현미경을 통해 호중구의 수명을 연장하는 것을 보여줍니다. 이 보고서는 CLON-G 준비 절차를 소개하고 호중구 연구 및 후속 호중구 사멸 조사에 사용할 수 있는 호중구의 시험관 내 자연 사망 분석을 보여줌으로써 호중구 커뮤니티에 신뢰할 수 있는 리소스를 제공합니다.

CLON-G 처리된 호중구의 Wright-Giemsa-염색 형태(도 2A-D) 및 FACS 표현형(도 2E-J)은 영향을 받지 않았습니다. 24시간에서 CLON-G 처리된 호중구의 생존율은 유세포 분석 분석(그림 3) 및 형광 이미지 분석(그림 4)을 기반으로 약 90%+였습니다. 낮은 생존율은 부적절한 보관, CLON-G 성분의 부적절한 농도 또는 시작 분리된 호중구의 품질 저하로 인해 발생할 수 있습니다. 24시간 동안 염기성 배지로 배양된 처리되지 않은 호중구의 유세포 분석 결과, 이들 호중구는 아넥신-V-양성 집단을 갖는 것으로 나타났다(도 3B</str...

이 프로토콜은 호중구 수명을 5일 이상으로 연장하기 위한 CLON-G의 준비를 자세히 설명하고 유세포 분석 및 공초점 형광 현미경으로 호중구 사멸을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 절차를 제공합니다.

CLON-G 및 In Vitro Spontaneous Death Assay를 통한 호중구 수명 연장

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

우리의 프로토콜은 호중구 기능을 손상시키지 않으면서 호중구 수명을 5일 이상으로 연장하는 칵테일 배지를 제공합니다. 또한 호중구에 대한 신뢰할 수 있는 체외 투석을 제공합니다. CLON-G 치료는 호중구 보존, 수송 및 유전자 조작의 가능성을 확장하여 호중구 군집에서의 연구를 가속화할 수 있습니다.시작하려면 RPMI 1640 FBS와 펜 스트렙을 50밀리리터 튜브에 추가하여 기본 배지를 준비합니다. 동시에 CLON-G 구성품의 모든 원액을 얼음 위에서 해동합니다. 그런 다음 기본 배지에서 G-CSF 밀리리터당 HSP 70 및 200 마이크로 그램을 희석하십시오.976마이크로리터의 기본 매체를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 여기에 CLON-G 구성 요소를 추가하여 원고에 설명된 대로 1밀리리터의 2x CLON-G 배지를 준비합니다. 다음으로, 분리된 마우스 호중구를 염기성 배지에 현탁하여 호중구 배양물을 준비한다.CLON-G 배지를 첨가하고, 염기성 배지를 24웰 비조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 그런 다음 준비된 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 넣고 부드럽게 3-4 회 피펫합니다. 배양 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 공급으로 배양합니다.배양된 호중구를 사이토스핀으로 염색하고 광학 현미경을 사용하여 분석합니다. 유세포 분석을 위해, 하룻밤 동안 성장한 호중구 세포 배양액에 1밀리리터의 세포 배지를 첨가한다. 세포 배양 배지를 5-7회 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 이 혼합물 100마이크로리터를 원하는 시점에 유세포 분석 튜브에 옮깁니다.동시에, 계수 비드 및 10 마이크로리터의 비드 용액을 함유하는 동일한 세포 배지를 함유하는 동일한 유세포 분석 튜브에 와동시킨다. 미리 준비된 염색 혼합물 10마이크로리터를 이 유세포 분석 튜브에 넣고 어두운 곳에서 냉장고에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 식염수를 튜브에 넣고 계수 비드와 세포의 균일한 분포를 위해 잘 혼합합니다.마지막으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 세포 현탁액의 유세포 분석을 수행합니다. 형광 이미지 분석의 경우 컨포칼 플레이트당 2밀리리터의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 한편, 45 밀리리터의 식염수에 1 그램의 염화칼슘을 녹이고 0.2 마이크로 미터 여과 장치로 여과한다.필요한 시점에서 컨포칼 플레이트를 부드럽게 제거합니다. 실온에서 5분 동안 10마이크로리터의 FIT

neutrophil-lifespan-extension-with-clon-g-an-vitro-spontaneous-death

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜에서 우리는 측정하는 방법을...

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

생식 가능성을 평가하기위한 clonogenic 분석의 응용은 이상의 50 년 동안 설립되었습니다. 여기 자기편 세포와 clonogenic 분석을 수행하기위한 일반적인 절차를 보여줍니다.

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

모델 유기체인 Caenorhabditis elegans에서 미토콘드리아 억제제의 효과를 생체 내에서 검출하고 잠재적인 강화 화합물을 식별하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능을 조절하는 화합물에 대한 약물 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

Screenable<em&gt; 생체</em&gt; 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

우리는 여기서 획득 및 호중구 유래 거 식세포의 새로운 특징 모집단을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 세포는 신선한 인간의 혈액 호중구에서 문화를 개발하고, 식균 작용, 자식 작용, 상당히 큰 크기, 확장 된 수명을 특징으로한다. 이 방법은 또한 독특한 호중구 유래 모집단을 조사하기 위해 필수적이다.

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별 체외

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

다음은 Saccharomyces cerevisiae에서증가 된 복사 번호 억제기 화면을 통해 유전 적 상호 작용을 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 단명한 효모 돌연변이체에서 억제제를 식별, 복제 및 테스트할 수 있습니다. 우리는 autophagy null 돌연변이의 수명에 SIR2의 복사 수 증가의 효과를 테스트합니다.

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

여기에서 우리는 평생 생리학적 매개변수 추적 및 형광 정량화를 위해 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양 시스템에는 동물이 도망가는 것을 방지하기 위해 단일 벌레 우물 주위에 팔미트산 장벽이 포함되어 있어 병원성 박테리아 및 화학적 스트레스 요인을 포함한 혐오적인 개입을 사용할 수 있습니다.

Longitudinal Fluorescence Monitoring and Averseive Interventions를 위한 고체 배지에서 개별 Caenorhabditis elegans 의 장기 배양

이 프로토콜은 MEDUSA 분석법을 사용하여 각 유전자 knockout의 사멸 조절 효과를 정량화하는 방법을 설명합니다. 여기에는 감도를 최적화하는 실험 조건을 결정하는 방법에 대한 지침과 분석 수행에 대한 단계별 자습서가 포함되어 있습니다.

화학유전학 프로파일링 데이터에서 사망 조절 유전자를 식별하기 위한 MEDUSA

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans의 배아 치명률을 정량화하는 간단하고 저비용의 절차를 제공합니다. 전문 장비나 벌레 제거 전문성 없이도 집단 전체에서 배아 이상을 쉽게 감지할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜은 유전적 돌연변이, RNA 간섭 매개 유전자 노크다운, 식이의 효과를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 치명률 정량화

배우세요 CLON-G 배양액을 이용하여 호중구 수명을 5일 이상 연장하고 기능을 유지하는 방법을. 유세포 분석기와 공초점 형광 현미경으로 세포 사멸을 평가하는 프로토콜입니다.

CLON-G 및 In Vitro Spontaneous Death Assay를 통한 호중구 수명 연장

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