Name: 마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 배우세요 마이코박테리아의 천연 및 재조합 세포외 소포체 농축 방법을 Mycobacterium smegmatis를 이용하여. 이 기술은 백신 후보 개발과 세포외 소포체 기능 연구에 활용됩니다.

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저자는 M. smegmatis mc2155 주식을 친절하게 공유해 주신 Sarah M. Fortune 교수에게 진심으로 감사드립니다. 또한 그림 1의 몇 가지 기본 요소를 제공한 Servier Medical Art(smart.servier.com)를 인정합니다. 그들은 mEV 농축을 위해 인큐베이터 쉐이커, 원심분리기 및 초원심분리기를 장기간 사용하는 동안 환자 조정에 대한 나머지 실험실 구성원의 지원에 진심으로 감사드립니다. 또한 실험실 조교인 Surjeet Yadav 씨가 필요한 유리 제품과 소모품을 항상 사용할 수 있고 편리하게 사용할 수 있도록 해준 것에 대해 감사를 표합니다. 마지막으로, 그들은 프로젝트의 원활한 실행에 대한 지속적인 지원과 도움에 대해 THSTI의 관리, 구매 및 재무 팀에 감사드립니다.

모든 저자는 이 연구 작업이 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계/이해관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.

BCG보다 우수하고 BCG를 대체할 수 있는 새로운 결핵 백신을 개발하는 것은 여전히 만만치 않은 과제로 남아 있기 때문에, 대안으로 여러 그룹에서 BCG의 효능을 높이고 보호 기간을 연장할 수 있는 다양한 소단위 결핵 백신의 발견을 추구하고 있습니다48,49. 박테리아 EV(bEV)가 잠재적인 소단위체(subunit) 및 천연 보조제(natural adjuvants)50,51)로서 증가함에 따라, 다운스트림 테스트/분석을 위해 충분한 양의 mEV를 지속적으로 농축하는 것이 중요한 단계가 되었습니다. 이러한 연구 질문을 고려하여 이 프로토콜은 액센 배양과 재조합 버전의 mEV를 농축하는 것을 목표로 합니다.
Msm EV의 상세한 질량 분광 단백질체 분석 중에 Prados-...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

전염병에 대한 광범위한 백신의 개발 및 투여에도 불구하고 오늘날까지도 모든 인간 사망의 ~30%는 여전히 전염병으로 인해 발생합니다1. 결핵(TB) 백신인 Bacillus Calmette Guerin(BCG)이 등장하기 전에는 결핵이 사망 원인 1위였습니다(~10,000명에서 15,000명/100,000명)2. BCG의 투여와 1차 및 2차 항결핵제에 대한 쉬운 접근으로 2022년까지 결핵 관련 사망은 2022년까지 ~100만명/년으로 급격히 감소했다(즉, ~15-20/100,000 인구1). 그러나 전 세계 결핵 풍토병 인구에서 결핵 관련 사망자는 인구 100,000명당 ~100-550명에 머물고있다 1. 전문가들은 이러한 왜곡된 수치를 초래하는 몇 가지 이유를 인정하지만, BCG에 의한 보호가 생후 첫 10년 동안도 지속되지 않는 것이 3,4,5,6,7의 주된 원인인 것으로 보인다. 결과적으로, UN의 '지속가능발전목표'와 WHO의 '결핵 퇴치 전략'이 새로워짐에 따라, 결핵으로부터 평생 보호해 줄 수 있는 BCG보다 훨씬 우수한 백신을 개발하기 위한 전 세계적인 공동의 노력이 이루어지고 있습니다.

이 목표를 달성하기 위해 여러 그룹에서 현재 변형/재조합 BCG 균주, BCG 이외의 비병원성 및 약독화 마이코박테리아 종, 서브유닛 후보 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18을 평가하고 있습니다 . 일반적으로 서브유닛 백신은 병원체의 정제된(~1-6) 전장 또는 절단된 면역원성 단백질이 거의 없는 리포좀입니다. 그러나, 비-네이티브(non-native) 형태로의 가짜 접힘 및/또는 로드된 단백질 사이의 무작위적인 비기능적 상호작용으로 인해, 서브유닛은 종종 네이티브 및 게르만 에피토프(germane epitope)가 부족하여 면역계를 충분히 프라이밍하지 못한다14,19,20.

결과적으로, 박테리아의 세포외 소포체(EV)는 유망한 대안으로 속도를 내고 있습니다 21,22,23,24,25,26. 전형적으로, 박테리아 EV(bEV)는 핵산, 지질, 수백 개의 대사 산물 및 단백질의 일부를 포함하는 세포 구성 요소의 하위 집합을 포함합니다27,28. 몇 가지 정제된 단백질이 인위적으로 로드되는 리포솜과 달리, bEV는 특히 보조제 및 톨 유사 수용체(TLR) 작용제의 부스트/보조 없이 면역 체계를 프라이밍하는 더 나은 성향을 가진 수백 개의 자연적으로 로드되고 자연스럽게 접힌 단백질을 포함합니다27,28,29. 이러한 연구 분야에서 당사와 다른 연구자들은 BCG30에 대한 잠재적인 서브유닛 부스터로서 마이코박테리아 EV의 유용성을 탐구했습니다. bEV가 균일한 항원 부하가 부족하다는 우려에도 불구하고, 약독화된 Neisseria meningitidis의 EV는 혈청군 B 수막구균으로부터 인간을 성공적으로 보호했습니다31,32.
적어도 이론적으로는 BCG를 잘 부스트할 수 있는 최고의 EV는 병원성 박테리아가 농축된 EV입니다. 그러나 병원성 마이코박테리움에 의해 생성된 EV를 농축하는 것은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 위험합니다. 또한 병원체에서 생성된 EV는 보호 기능보다 독성이 더 강할 수 있습니다. 잠재적인 위험을 감안하여, 여기에서는 독성이 강한 마이코박테리움인 축삭 배양 Msm에 의해 생성된 EV의 농축에 대해 잘 테스트된 프로토콜을 보고합니다.
그러나, 여러 병원체 단백질 ortholog를 암호화하고 있음에도 불구하고, 독성 마이코박테리아는 면역 체계를 보호하기 위해 충분히 준비시키는 데 필요한 몇 가지 백신 항원/병원성 단백질 에피토프가 부족하다33. 따라서 분자 공학을 통해 Msm의 재조합 EV를 구성하고 농축하여 Msm에서 발현되고 번역된 관심 병원성 단백질의 상당 부분이 EV에 도달해야 하는 연구도 수행했습니다. 우리는 Msm EV의 상위 10개 풍부한 단백질 중 하나 이상이 관심 단백질에 융합될 때 이러한 전좌에 도움이 될 것이라는 가설을 세웠습니다.
실험실에서 마이코박테리아 EV(mEV)의 농축을 표준화하기 시작했을 때, 2011년 Prados-Rosales et al.은 시험관 내 mEV의 시각화 및 농축을 처음으로 보고했습니다 30. 이후 2014년에 같은 그룹이 2011년 방법34의 수정된 버전을 발표했습니다. 2015년에 Lee et al.은 또한 mycobacteria35의 액센 배양에서 mEV 농축을 위한 독립적으로 표준화된 방법을 보고했습니다. 두 프로토콜 34,35를 결합하고 철저한 표준화 후 몇 가지 수정 사항을 통합하여, 마이코박테리아36의 액센 배양으로부터 mEV를 일상적으로 농축하는 데 도움이 되는 프로토콜을 설명합니다.
여기에서, 우리는 일반적으로 마이코박테리아 EV의 농축을 위해 발표된 프로토콜36의 확장인 Msm-특이적 EV의 농축에 대해 특히 자세히 설명합니다. 또한 mCherry 단백질(적색 형광 리포터)과 Mycobacterium tuberculosis의 우세한 면역원이자 잠재적인 하위 단위 백신물질인 EsxA(Esat-6)37,38,39를 포함하는 재조합 mEV(R-mEV)를 구성하는 방법에 대해서도 자세히 설명합니다. R-mEV를 강화하기 위한 프로토콜은 Msm의 기본 EV를 강화하기 위해 설명한 프로토콜과 동일합니다.

<table><tbody><tr><td>A2 유형 생물 안전 캐비닛</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td>1300 시리즈</td></tr><tr><td>벤치 탑 원심 분리기</td><td>Eppendorf, 미국</td><td></td><td>5810 R</td></tr><tr><td>BstB1, HindIII, HpaI</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB</td></tr><tr><td>세포 농도계</td><td>GE Healthcare, 미국</td><td></td><td>Ultraspec 10</td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, 미국</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>이염기성 인산칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich, Merck, 미국</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>이중 증류수</td><td>Merck, USA</td><td></td><td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td></tr><tr><td>Electroporation 큐벳</td><td>Bio-Rad, 미국</td><td></td><td>2 mm</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad, 미국</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>EsxA 특이적 Ab</td><td>Abcam, 영국</td><td></td><td>토끼 폴리 클로날</td></tr><tr><td>철 암모늄 구연산</td><td>염 Sigma-Aldrich, Merck, 미국</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>바닥 모델 원심 분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td>Sorvall RC6 plus</td></tr><tr><td>유리 제품</td><td>Borosil, INDIA</td><td></td><td>1L 삼각 플라스크</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, 미국</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>HEPES 및 염화</td><td>나트륨Sigma-Aldrich, Merck, 미국</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>인큐베이터 쉐이커</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td>MaxQ 6000 & 8000</td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, 미국</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td><td>Hi Media, INDIA</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Tarsons, INDIA</td><td></td><td>Tarsons</td></tr><tr><td>mCherry 특정 Ab</td><td>Abcam, 영국</td><td></td><td>토끼 단클론</td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>LG, 인도</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC3286BLT Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD, 미국</td><td></td><td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td></tr><tr><td>Middlebrook ADC 농축</td><td>BD, 미국</td><td></td><td>BBL Middlebrook ADC 농축</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td>Spectronic 200 UV-Vis</td></tr><tr><td>NEB5a</td><td>NEB, 미국</td><td></td><td>DH5a</td></tr><tr><td>Optiprep(Iodixanol)</td>의 유도체<td>Merck, 미국</td><td></td><td>60% 원액으로 사용 가능(물에서)</td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>Hi Media, 인도</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Mettler Toledo, 미국</td><td></td><td>Mettler Toledo</td></tr><tr><td>플라스미드 DNA 미니 키트</td><td>Hi Media, 인도</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>Plate incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>새로운 시리즈</td></tr><tr><td>Plasmid pMV261</td><td>Addgene, USA * *The&nbsp; &nbsp; 플라스미드&nbsp; &nbsp; 이다&nbsp; &nbsp; 아니요&nbsp; &nbsp; 이 플라스미드 뱅크</td><td></td>에서 더 사용 가능 <td>셔틀 벡터</td></tr><tr><td>교정 DNA 중합효소</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td>Phusion DNA Plus 중합효소</td></tr><tr><td>Q5 교정 DNA 중합효소</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB</td></tr><tr><td>냉장 순환 수조</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td>R20</td></tr><tr><td>Middlebrock 7H11 한천 베이스</td><td>BD, 미국</td><td></td><td>BBL Seven H11 Agar base</td></tr><tr><td>SOC broth</td><td>Hi Media, INDIA</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td></td><td>Optima L100K</td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 - 14 mL</td><td>Beckman Coulter, 미국</td><td></td><td>폴리알로머 타입 &ndash; SW40Ti 로터의 초투명 타입</td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 - 38 mL</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td></td><td>폴리프로필렌 타입&ndash; SW28 로터용 흐린 타입</td></tr><tr><td>초음파 세척 수조 초음파 발생기</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>초음파 발생기 - 벤치 탑 모델</td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; m 일회용 필터</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td></td><td>Nunc-Nalgene</td></tr><tr><td>30-kDa 센트리콘 농축기</td><td>Merck, USA</td><td></td><td>Amicon 울트라 원심 필터 - Millipore</td></tr><tr><td>3X FLAG 항체</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>400 mL 원심분리기 병</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Nunc-Nalgene</td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>미국</td><td></td> 코닝<td>무균, 사전 포장</td></tr> <tr><td>< 강한> 박테리아 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< 강> 균주 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< > 대장균 </td><td>NEB, 미국</td><td></td><td>NEB 5- 알파 (DH5 &alpha의 유도체).</td></tr><tr><td>Msm 표현 cfp29::mCherry</td><td>이 연구</td><td></td><td>MC2&nbsp; 155</td></tr><tr><td>Msm 표현 cfp29::esxA</td><td>이 연구</td><td></td><td>MC2&nbsp; 155</td></tr><tr><td>Msm 표현 cfp29::esxA::3X FLAG</td><td>이 연구</td><td></td><td>MC2&nbsp; 155</td></tr><tr><td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td><td>미국 하버드 대학교</td><td></td> Sarah M. Fortune 교수<td>&nbsp; MC2&nbsp; 155</td></tr></tbody></table>의

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

마이코박테리아를 포함한 대부분의 박테리아는 세포외 소포체(EV)를 생성합니다. 박테리아 EV(bEV)에는 대사 산물, 지질, 단백질 및 핵산을 포함한 세포 구성 요소의 하위 집합이 포함되어 있기 때문에 여러 그룹에서 서브유닛 백신 후보로서의 보호 효능에 대해 bEV의 네이티브 또는 재조합 버전을 평가했습니다. 네이티브 EV와 달리 재조합 EV는 하나 이상의 관심 면역원을 포함하도록 분자 공학적으로 설계되었습니다. 지난 10년 동안 여러 그룹에서 재조합 bEV를 생성하기 위한 다양한 접근 방식을 탐구했습니다. 그러나 여기서는 마이코박테리아에서 재조합 마이코박테리아 EV(mEV)의 설계, 구성 및 농축을 보고합니다. 이를 위해 우리는 무독성 토양 마이코박테리움인 Mycobacterium smegmatis (Msm)를 모델 시스템으로 사용합니다. 먼저 Msm의 네이티브 EV의 생성과 강화에 대해 설명합니다. 그런 다음 적색 형광 리포터 단백질인 mCherry 또는 Mycobacterium tuberculosis의 저명한 면역원인 EsxA(Esat-6)를 포함하는 재조합 mEV의 설계 및 구성에 대해 설명합니다. mCherry와 EsxA N-말단을 작은 Msm 단백질 Cfp-29의 C-말단과 별도로 융합하여 이를 달성합니다. Cfp-29는 MsmEV에 풍부하게 존재하는 몇 안 되는 단백질 중 하나입니다. Msm에서 재조합 mEV를 생성하고 농축하는 프로토콜은 Msm의 네이티브 EV의 생성 및 농축과 동일하게 유지됩니다.

M. smegmatis(Msm)를 모델 마이코박테리움으로 사용하여 네이티브 및 재조합 mEV(R-mEV)의 농축을 입증합니다. 이 개략적으로 요약된 mEV 농축 프로토콜(그림 1)은 Msm의 R-mEV 및 Mtb의 네이티브 EV의 농축에도 작동합니다(1.2의 프로토콜 노트에서와 같이 약간의 수정 포함). 농축된 mEV를 시각화하려면 투과 전자 현미경(36)으로 음성으로 염색해야 합니다(그림 2A). 일반적으로 Msm 특이적 EV는 13mL 6-60% 밀도 구배의4th-6th 1mL 분획에서 분리됩니다(그림 2B). EV에 해당하는 약 80-100μg의 단백질은 Msm의 중간 로그 액상 배양 2L에서 일상적으로 얻어집니다. 직경은 일반적으로 20nm에서 250nm 사이입니다(...

이 프로토콜은 Mycobacterium smegmatis(Msm)의 액센 배양에서 천연 마이코박테리아 세포외 소포체(mEV)의 농축과 mCherry(적색 형광 리포터) 함유 재조합 MsmEV를 설계하고 농축할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 EsxA 단백질을 함유한 MsmEV의 농축을 통해 새로운 접근법을 검증합니다.

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

마이코박테리아 EV를 강화하면 내용물을 설명하고, 파벌을 해독하고, 주로 백신 후보를 활용하는 재조합 EV를 구성하고 생성하는 방법을 설계하는 데 도움이 됩니다. 6개의 계열은 박테리아 표면의 다른 위치에서 생성됩니다. 보존된 마커가 없습니다.따라서 모든 선호도 기반 접근 방식은 EV의 하위 집합만 강화할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 방법은 생성된 모든 마이코박테리아 EV를 포착합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Mohd Ilyas입니다.먼저 예열된 10H9 육수가 들어 있는 50밀리리터 원심분리 튜브에 야생형 또는 재조합 Mycobacterium smegmatis의 글리세롤 스톡 1밀리리터를 추가합니다. 뚜껑을 닫고 튜브를 휘젓고 섭씨 37도에서 200-220RPM 사이의 배양액을 밤새 배양합니다. 다음날 600 나노 미터의 광학 밀도가 약 1에 도달하면 실온에서 3, 200 G에서 10 분 동안 배양 물을 원심 분리하고 상층액을 액체 폐기 용기에 버립니다.미리 예열된 Sautons 매체 1밀리리터를 추가하고 균일한 현탁액을 얻기 위해 부드럽게 재현탁합니다. Sautons 매체를 사용하여 부피를 10밀리리터로 구성하십시오. 다시 원심분리하고 상층액을 버립니다.세척 후 박테리아 세포를 재현탁하십시오. 20 밀리리터의 사전 데워진 Sautons 매체에 넣고 600 나노 미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 필요한 양의 박테리아 현탁액을 330 밀리리터의 Sautons 배지가 들어있는 1-2 리터의 삼각 플라스크에 접종하고 광학 밀도가 0.3에 도달 할 때까지 섭씨 37도에서 200 RPM으로 배양합니다.다음 날, 앞서 설명한 대로 세포를 한 번 세척하고 1/10 트윈 80을 포함하는 330밀리리터의 Sautons에 펠릿을 재현탁시킵니다. 셀 현탁액 50밀리리터를 1리터 플라스크 6개에 분배하고, 각 플라스크에는 1/10 트윈 80이 들어 있는 280밀리리터의 예열된 소우톤이 들어 있습니다. 섭씨 37도에서 200RPM으로 배양물을 2-2.5에 도달할 때까지 배양합니다.6개의 400 밀리리터 병에 중간 지수 단계 배양액 2리터를 추가하고 섭씨 4도에서 20분 동안 8, 000G에서 원심분리합니다. 상층액 및 사전 냉각된 오토클레이브 플라스크 또는 비커를 수집하고 분석 절차를 위해 펠릿의 부분 표본을 저장합니다. 펠릿은 EV가 mCherry에 대해 재조합 된 경우 착색되고 야생형 인 경우 갈색이거나 비 형광 단백질에 대해 재조합 된 경우 갈색입니다.0.45미크론 폐기 필터를 통해 배양 상층액을 여과한 다음 0.22미크론 필터를 통해 여과하여 박테리아의 모든 흔적을 제거합니다. 다음에, 4에 두 배 증류한 물의 15 밀리리터를 가진 30 킬로달톤 막 집중 장치를 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 G를 전 세척하십시오. 그런 다음 동일한 조건을 사용하여 사전 여과된 15ml의 차가운 Sautons 매체로 세척하여 모든 화학 물질의 흔적을 제거합니다.세척 후에, 집중 장치로 걸러진 경작한 상층액의 15 밀리리터를 추가하고 4, 4 섭씨 온도에 20 분 동안 000 G에 집중하십시오. 농축액을 차가운 40밀리리터의 Oak Ridge 원심분리기 튜브 또는 50밀리리터의 새 Falcon 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 2리터의 배양 여과액 전체가 농축되면 농축액을 이중 증류, 세척 및 사전 냉각된 50밀리리터 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 옮기고 2단계 원심분리를 실시합니다.첫째로 4, 000 G에, 그리고 그 후에 15에, 000 G.Transfer 전 식힌 38.5 밀리리터 ultracentrifuge 관으로 분리한 농축액은 100, 4 섭씨 온도에 4 시간 동안 000 G를 회전시킨다. 미리 냉각된 50밀리리터의 신선한 Falcon 원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다. 초원심분리기 튜브를 보푸라기가 없는 신선한 흡수성 종이에 뒤집어 상층액의 흔적을 제거하고 펠릿을 600마이크로리터의 HEPES 완충액에 다시 현탁시킵니다.13밀리리터의 사전 냉각된 UltraClear 폴리프로필렌 초원심분리기 튜브의 바닥에 재현탁 펠릿을 겹쳐 놓고 4밀리리터의 불활성 60% 밀도 구배 요오딕산올 용액과 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 40 % 30 % 20 % 및 10 %의 요오드화 산올 각각 1 밀리리터를 오버레이합니다. 상단에 4ml의 6% 요오딕산올을 추가하여 튜브를 채웁니다.주의깊게 유리제 비커 또는 대에 있는 관의 무게를 달기 후에, 4 섭씨 온도에 141, 16 시간 동안 000 G에 ultracentrifugation를 위한 진동 물통 회전자에 그리고 그 후에 진동하는 물통 회전자에 온화하게 그것을 옮기십시오. 초원심분리 후 튜브를 조심스럽게 제거하고 1밀리리터 분획을 오토클레이브 마이크로 원심분리기 튜브에 수집합니다. TEM 분석은 마이코박테리아 EV가 원형임을 보여주었고 나노 추적 분석은 직경이 20나노미터에서 250나노미터 사이인 다양한 크기의 EV를 확인했습니다.mCherry의 N-말단 말단이 CFP-29의 C-말단 말단에 번역적으로 융합되었을 때, Msm의 농축된 mEV의 일부가 분홍색으로 변했는데, 이는 cf-29가 관심 있는 외부 단백질을 운반할 수 있는 능력을 나타냅니다. 그런 다음 CFP-29를 사용하여 Msm EV에 대한 EsxA 제공을 평가했습니다. Mtb의 EsxA는 Msm EV에서 소량으로 관찰되었습니다.CFP-29 EsxA 3X FLAG는 더 안정적이었고 mEV에서 더 높은 수준으로 축적되었습니다. 생리학적으로 다양한 조건에서 자란 마이코박테리아에서 EV를 농축하면 지속적인 감염성, 발병 기전 및 병원균 확산을 지시하는 변경된 내용물과 수정된 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

enrichment-native-recombinant-extracellular-vesicles

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. 철 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 분리 및 특성화. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 숙주 환경을 모방하는 철분 제한 조건에서 배양된 Mycobacterium tuberculosis 에서 세포외 소포(EV)를 단계적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. EV 함유 분획을 농축하고 식별하기 위해 한외여과, 차등 원심분리 및 밀도 구배 분리를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.

Mycobacterium tuberculosis에서 Siderophore 함유 세포외 소포의 분리

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

이 비디오는 한외여과를 사용하여 박테리아 세포외 소포체를 포함하는 박테리아 배양 여과액 단백질의 분리 및 농축을 보여줍니다. 농축된 세포외 소포체는 질병 감지를 위한 진단 마커 역할을 합니다.

한외여과 장치를 사용한 박테리아 배양 여과 단백질 농도 여과

이 동영상은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)의 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포체(EV)를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술을 보여줍니다. 이 기술은 다공성 수지 충전 컬럼을 사용하여 EV의 정제된 분획을 얻습니다. 다공성 입자는 더 작은 단백질이 기공으로 들어가도록 선택적으로 허용하여 용리 속도를 늦춥니다. 동시에 EV는 크기가 크기 때문에 모공으로 들어가는 것이 배제되고 먼저 용출됩니다.

Mycobacterial Extracellular Vesicles를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 기술

세균성 표면에 급속 한 항 원 디스플레이 대 한 새로운 기술, 표면 biotinylation 단위체 avidin와 퓨전에 관심사의 단백질에 노출에 의해 다음을 포함 하 제공 됩니다. 선택 된 항으로 BCG를 성공적으로 로드 표면 장식 전통적인 유전 접근을 대체할 수 있는 제안 그것의 immunogenicity를 향상 시킵니다.

외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현

결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

이 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 배양 상청액으로부터 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포를 풍부하게하기 위한 용이하고 재현 가능한 기술을 기술한다.

마이코박테리움 결핵 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포 농축

본 프로토콜은 세포외 막 결합 소포 내부에 포장된 전형적으로 불용성 또는 이황화 결합 함유 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 박테리아 생산을 위한 상세한 방법을 설명합니다. 이것은 응용 생명 공학 및 의학을 포함한 과학 연구의 다양한 영역에 적용될 가능성이 있습니다.

E. coli의 재조합 단백질 충전 소포의 최적화된 생산 및 분석

플라스미드 DNA의 인플루엔자 바이러스의 구조는 독감 연구자 인플루엔자 바이러스의 생물학의 여러 측면을 연구하는 재조합 바이러스를 생성하고, 잠재적인 벡터 또는 백신으로 사용할 수있는 기본적인 필수 실험 기법입니다.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

배우세요 마이코박테리아의 천연 및 재조합 세포외 소포체 농축 방법을 Mycobacterium smegmatis를 이용하여. 이 기술은 백신 후보 개발과 세포외 소포체 기능 연구에 활용됩니다.

마이코박테리아의 native and recombinant extracellular vesicles 농축

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