Name: Drosophila melanogaster를 사용한 휘발성 물질의 고처리량 조사를 위한 직렬 마취 어레이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster를 이용한 직렬 마취 어레이(SAA)로 휘발성 마취제의 약리학을 고처리량으로 조사하는 방법입니다. 유전적 다양성을 활용하여 독성 및 보호 효과를 탐구할 수 있습니다.

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SAA 프로토타입 제작에 대해 위스콘신-매디슨 대학교 마취과 피어스 연구소의 Mark G. Perkins에게 감사드립니다. 이 연구는 R01GM134107을 사용하는 NIGMS (National Institute of General Medical Sciences)와 위스콘신 - 매디슨 대학교 (University of Wisconsin-Madison)의 마취과의 R & D 기금에 의해 지원됩니다.

참고: 프로토콜에 사용된 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. SAA의 건설
<ol><li>나무를 자르고 그림 1A의 치수를 사용하여 프레임을 조립하여 프레임을 만듭니다.</li>
	<li>50mL 원뿔형 튜브 캡을 수정합니다.<ol><li>9/32인치 드릴 비트로 각 캡에 두 개의 구멍을 뚫습니다. 울퉁불퉁 한 플라스틱을 청소하기 위해 구멍을 샌딩하십시오. 캡 상단을 샌딩하여 표면을 거칠게 만듭니다(접착제 접착에 도움이 됨).</li>
		<li>5mL 혈청학적 피펫을 크기(유입의 경우 3인치, 유출의 경우 1.5인치)로 플라스틱에 점수를 매긴 다음 점수가 매겨진 라인에서 깨끗하게 분해하여 절단합니다. 절단/파손된 피펫의 끝을 샌딩합니다.</li>
		<li>튜브에 그물을 붙입니다(접착제의 적절한 건조 시간 허용). 접착제가 마르면 그물망을 튜브 크기로 자릅니다.</li>
		<li>두 튜브가 캡 위로 확장(3/4인치)된 상태에서 원뿔형 캡의 구멍에 튜브를 삽입합니다. 유입 튜브가 유출 튜브보다 튜브 안으로 더 오래 확장되는지 확인하십시오(그림 1B).</li>
		<li>튜브 주위의 캡 상단에 접착제를 바르고 부품을 함께 고정합니다(계속하기 전에 접착제의 적절한 건조 시간을 허용하십시오).</li>
	</ol></li>
	<li>캡을 프레임에 부착하고 튜브를 배선합니다(그림 1C).<ol><li>접착 케이블 고정 장치를 프레임에 부착합니다(3.25인치 간격, 중앙에서 중심으로).</li>
		<li>지퍼 타이를 사용하여 캡을 프레임에 부착하십시오. 지퍼 타이 태그 끝을 짧게 자릅니다.</li>
		<li>Tygon 튜브의 길이(9인치)를 절단하여 수정된 각 캡의 유입/유출 튜브에 연결합니다(그림 1D). 상류 끝에서 시작하여 먼저 유입구에 부착 한 다음 유출구에서 다음 위치의 유입구로 튜브를 부착하십시오.</li>
		<li>가장 다운스트림 "유입"에 흐름 표시기를 추가합니다(위치 10, 그림 1E).</li>
		<li>첫 번째 위치에 50mL 원뿔형 튜브를 놓고 유입 튜브 바로 아래까지 물을 채웁니다(그림 1F).</li>
	</ol></li>
	<li>기화기의 인터페이스를 준비합니다. 플런저를 제거하고 두 개의 10mL 디스펜싱 주사기(깊이 1/2인치 x 너비 1/4인치, 그림 1G)에서 노치를 잘라낸 다음 노치가 기화기 전면을 향하도록 하여 기화기 유입 및 유출에 삽입합니다. 선택 사항: 수정된 주사기를 제자리에 붙입니다. 저렴한 경우 상업용 매니폴드를 사용하십시오(한 가지 옵션은 재료 표 참조).</li>
	<li>전체 시스템을 연결합니다. Tygon 튜브를 사용하여 다음 순서로 구성 요소를 함께 부착하십시오: 조절기가 있는 운반 가스 탱크 &gt; 가스 특정 유량계 &gt; 기화기 &gt; SAA(그림 1C).</li>
	<li>어레이의 빈 위치를 빈 50mL 원뿔형 튜브로 채웁니다. 가스 탱크를 켜고 유량계를 ~2L/min으로 열고 기화기를 0%로 켭니다. 기화기 상류의 유량계와 SAA의 마지막 챔버 하류의 유량 표시기를 확인하여 시스템을 통한 가스 흐름을 확인합니다. 또는 다운스트림 튜브 끝을 물에 삽입하고 기포가 있는지 확인합니다. 알림: 시스템에 압력이 가해지지 않기 때문에 몇 센티미터보다 높은 물기둥이 흐름을 멈춥니다. 어레이의 다운스트림 끝에 흐름이 없으면 다음을 확인하십시오: 흐름을 허용하려면 기화기가 켜져 있어야 합니다. 탱크 조절기와 유량계가 유량을 허용하는지 확인하십시오. 어레이 위치를 확인하여 튜브가 단단히 조여졌는지 확인하십시오. 수정된 캡의 접착제 주위에 누출이 있는지 확인하십시오.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65144/65144fig01.jpg"> 그림 1: SAA의 구성 . (A) SAA를 지지하는 나무 프레임의 측정값이 포함된 개략도. (B) 5mL 혈청학적 피펫으로 만들어진 유입 및 유출 튜브가 있는 수정된 캡의 측정과 함께 도식화된 단면. (C) 조립된 SAA(Olufs et al.5에서 재현) (D) 유입 및 유출 튜브를 보여주는 수정된 50mL 원추형 캡의 세부 정보. (E) 흐름 표시기가 있는 다운스트림(위치 10) 유출. (F) 상류(위치 1) 운반 가스를 가습하기 위한 물이 채워진 튜브. 빨간색 화살표는 수위를 나타냅니다. (G) 임시 매니폴드를 위한 수정된 10mL 분배 주사기. 빨간색 원은 8mL와 10mL 표시(또는 1/2인치 x 1/4인치) 사이에 있는 컷아웃 노치를 강조 표시합니다. (H) 수정된 주사기의 삽입 및 방향을 보여주는 Tec7 기화기의 후면 모습. 이 보기에는 수정된 주사기의 노치와 정렬해야 하는 구멍(빨간색 화살표)을 왼쪽에 표시하기 위해 하나의 주사기만 있습니다. 참고: 이 컷아웃 노치와 유출구부의 정렬 불량은 마취 투여를 방해합니다. 이 부분은 이 맞춤형 시스템의 잠재적인 약점입니다. 자금이 있는 경우 상업용 매니폴드를 사용해야 합니다. 약어: SAA = 직렬 마취 어레이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65144/65144fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 마취 노출 전
<ol><li>마취제 노출 24시간 이상전에, 바람직한 방법(예를 들어,CO2 또는 에테르)을 사용하여 실험에 필요한 파리 코호트를 분류한다.</li>
</ol>3. SAA의 운영
<ol><li>식품 바이알에서 파리를 빈 50mL 원뿔형 튜브(CO2 제외)로 옮깁니다.<ol><li>노출되기 전에 죽은 파리를 세고 기록하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>파리가 있는 50mL 원뿔형 튜브의 캡을 풀고 SAA에 나사로 고정합니다.</li>
	<li>캐리어 가스를 켜고 원하는 유량으로 설정합니다. 참고: 일반적으로 1-2L/min을 사용합니다.</li>
	<li>마취 기화기를 원하는 농도로 설정하십시오. 참고: 이소플루란은 2%, 세보플루란은 3.5%를 사용하는데, 이는 포유류에서 동등한 용량이다10.</li>
	<li>원하는 기간 동안 파리를 노출시킵니다 (최소 : 15 분). 알림: SAA 위치 전반에 걸쳐 평형의 변동을 방지하기 위해 최소 노출 시간 15분이 권장됩니다. 이 시스템에서는 마취제가 모든 위치에서 평형을 이루는 데 2-3분이 걸립니다.</li>
	<li>노출이 끝나면 총 SAA 부피의 약 0배 부피에 해당하는 1.5분 동안 5L/min의 신선한 가스 흐름(기화기로 설정된 10%)으로 시스템을 세척합니다.</li>
</ol>4. 실험을 시작하기 전에 체크리스트
<ol><li>고압 조절기(공기 탱크 상단)를 완전히 연 다음 반 바퀴 돌려 닫아 캐리어 가스 흐름을 보장합니다.</li>
	<li>각 라인의 튜브를 따라 i) 유량계 및 ii) 기화기(유입/유출이 올바르게 연결되었는지 확인), iii) 기화기의 마취 수준을 확인합니다.</li>
	<li>챔버에 피사체를 적재한 후 기포 테스트 또는 유량 표시기로 공기/가스가 흐르는지 확인하십시오. 알림: 일부 기화기는 다이얼이 꺼짐 위치에 있을 때 공기 흐름을 허용하지 않습니다.</li>
	<li>가스가 흐를 때 유량계와 다운스트림 유량 표시기가 모두 유량을 나타내는지 확인하십시오.</li>
	<li>실험이 끝나면 마취제를 씻어내기 위해 4-5분의 공기 흐름을 허용합니다.</li>
</ol>

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<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+postconditioning+reduces+ischemia-induced+nuclear+factor-kappaB+activation+and+interleukin+1beta+production+to+provide+neuroprotection+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Isoflurane postconditioning reduces ischemia-induced nuclear factor-kappaB activation and interleukin 1beta production to provide neuroprotection in rats and mice.</a> Neurobiology of Disease. 54, 216-224 (2013).</li>
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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

SAA 구성의 중요한 단계에는 마취 가스 혼합물의 누출을 방지하기 위해 단단한 피팅을 보장하는 것이 포함됩니다. SAA는 실험실 공간의 오염을 방지하기 위해 흄 후드에 보관해야 합니다. 캐리어 가스 실린더에서 SAA 다운스트림의 유량 표시기까지의 모든 요소는 체크리스트에 설명된 대로 점검해야 합니다.
파리에 VGA를 투여하는 다른 방법들은 작동이 복잡하고(이뇌계)21 처리량이 낮고22, 여러 개체군이 동시에 노출되는 것을 허용하지 않으며23, 마취 농도를 정밀하게 조절할 수 없거나21, 임상적으로 인정되는 용어로 번역하기 어려운 판독값을 가지고 있다24.
SAA의 현재 버전은 상업용 기화기에 의존하므로 독성 연구는 휘발성 마취제로 제한됩니다. 다른 휘발성 물질과 함께 사용하는 경우 출력을 보정한 후 기화기를 "오프 라벨"로 사용할 수 있습니다. 대안적으로, 휘발성 물질을 기화시키는 다른 방법이 적용될 수 있으며, 이는 이전에 설명한 바와 같이 약물 농도를 적정하기 위한 전용 측정을 필요로 한다25.
유량 표시기 외에는 경보가 없습니다(즉, 탱크가 비어 있으면 SAA를 통한 흐름이 중단됨). 사용 강도에 따라 SAA는 Tygon 튜브를 청소, 조이고 교체해야 할 수도 있습니다. 우리는 7년 동안 원래 SAA에 대해 "유지 보수"를 두 번 수행했습니다.
초파리를 마취하는 이 방법을 사용하면 고처리량 시스템에서 초파리 연구원이 사용할 수 있는 유전 도구 상자를 사용할 수 있습니다. 상이한 집단(예를 들어, 유전자형, 연령, 성별)의 파리의 여러 코호트는 동일한 마취 농도 및 당면한 연구 문제에 적합한 운반 가스(공기,O2,N2O, 비활성 기체)의 원하는 조합에 동시에 노출될 수 있다.
여기에서 우리는 SAA가 ND2360114 플라이 라인에서 이소플루란 독성에 대한 회복력의 예상치 못한 변화를 밝히는 데 유용했으며 표준 실험실 플라이 라인이 AP에 대한 반응성이 다르다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과를 식별하는 것은 실험 조건의 엄격한 제어와 SAA의 높은 처리량 덕분에 가능했습니다.
SAA는 곤충(예: 꿀벌)에 대한 다른 휘발성 유기 화합물(VOC)의 영향을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 휘발성 마취제(이소플루란: 20°C에서 240mmHg)에 가까운 증기압을 가진 VOC의 경우 기존 기화기를 사용할 수 있지만 출력을 보정해야 합니다. 데스플루란을 위한 상업용 기화기는 가열되어 잠재적으로 추가적인 유연성을 제공합니다.

부수적 마취 효과(즉, 즉시 관찰할 수는 없지만 행동 결과를 지연시킬 수 있는 효과)의 존재는 일반적으로 받아들여지지만, 그 메커니즘과 위험 요인에 대한 이해는 여전히 초보적이다 1,2. 그들의 지연된 발현과 미묘함은 합리적인 시간 내에 수용 가능한 비용으로 포유류 모델에서 조사할 수 있는 잠재적으로 중요한 변수의 수를 제한합니다. 초파리(Drosophila melanogaster)는 신경퇴행성 질환3과 독성학적 스크리닝4의 맥락에서 독특한 이점을 제공하는데, 이는 현재까지 마취 부수적 효과에 대한 연구에 적용되지 않았다.
우리는 마취 약력학 및 약리유전학 연구에서 초파리의 사용을 용이하게 하기 위해 SAA(Serial Anesthesia Array)를 개발했습니다. SAA의 주요 장점은 여러 코호트의 동일한 실험 조건에 동시에 노출된다는 것입니다. 초파리의 실험적 유연성과 함께 SAA의 높은 처리량을 통해 포유류 모델에서는 불가능한 규모로 생물학적 및 환경적 변수를 탐색할 수 있습니다. 
원칙적으로 SAA는 운반 가스가 휘발성 물질을 전달하는 일련의 연결된 마취 위치(50mL 바이알로 만들어진 챔버)입니다. 시스템의 첫 번째 챔버에는 운반 가스가 가습되는 증류수가 포함되어 있으며(파리는 탈수에 민감함) 시스템을 통과하는 가스 흐름을 나타내는 간단한 흐름 표시기로 끝납니다. 연결 튜브의 개구부에 놓인 미세한 그물은 챔버 사이의 파리의 이동을 방지하기 위해 챔버를 분리합니다. "직렬"위치의 수는 가압되지 않은 가스 흐름 (튜브, 그물)에 대한 저항에 의해 제한됩니다. 
우리는 이전 간행물5에서 이 SAA 프로토타입의 동역학을 특성화했습니다. 정확한 약동학적 특성은 SAA마다 다르지만 실험적으로 테스트된 관련 기본 사항은 다음과 같습니다: (i) 1.5-2L/min의 초기 유량은 모든 챔버(총 부피 ±550mL)를 2분 이내에 원하는 마취 농도와 평형을 이룹니다. (ii) 챔버로 전달된 마취 증기의 농도가 첫 번째 및 마지막 위치 사이에서 눈에 띄게 변하지 않는 경우, 개별 챔버 내의 기체 부피(50mL)에 포함된 마취제의 양이 임의의 수의 파리에 의해 흡수되는 양을 훨씬 초과하기 때문에; (iii) 챔버가 평형을 이루면 운반 가스 흐름을 줄여 (50-100 mL / min 이하) 환경의 낭비 및 오염을 방지 할 수 있습니다 (휘발성 마취제는 온실 가스 특성을 가짐). 증기의 정상 상태 농도를 유지하는 데 필요한 최소 유량은 파리에 의한 증기 흡수가 무시할 수 있기 때문에 주로 SAA의 누출에 달려 있습니다. 이러한 표준 조건(2% 이소플루란 및 1.5L/분 운반 가스 흐름)에서 파리는 3-4분 이내에 어레이의 모든 위치에서 마취(즉, 움직이지 않음)되며 위치 간에 눈에 띄지 않는 차이가 있습니다. VGA는 몇 분에서 몇 시간 동안 투여할 수 있으며 일반적인 노출 패러다임은 15분에서 2시간 사이입니다. 시스템을 세척하기 위해 기화기를 끄고 유량을 유지하여 어레이의 약 10배 부피(5분 동안 1.5L/min)를 교환합니다. 마취 제거 속도는 설정된 유량에 따라 달라집니다.
휘발성 마취제는 면역 염증 시스템을 포함하여 아직 확인되지 않은 수많은 표적과 상호 작용합니다6. 1차 대 부수적 결과("마취 상태" 대 장단기 "부작용")에 대한 개별 분자 표적의 기여도는 잘 알려져 있지 않습니다. 그러므로, 민감하고 처리량이 높은 파리 시스템은 파리와 포유류 사이의 명백한 차이에도 불구하고 고등 동물에서의 실험에 정보를 제공하는 데 유용하다7. 실제로 몇 가지 차이점이 유리할 수 있습니다. 예를 들어, 파리의 면역체계는 반응의 적응 팔이 없다는 점에서 고등 동물의 면역체계와 다르다8. 이것은 인간의 질병을 이해하는 데 한계가 있는 것처럼 보일 수 있지만, 적응 반응과 분리하여 VGA와 선천성 면역-염증 반응의 상호작용을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공한다9. 이를 통해 VGA가 염증에 미치는 약리학적 효과와 집단에 존재하는 다양한 유전적 배경에 의한 조절에 대한 연구를 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Serial 마취 배열:&nbsp; </강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청학 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10C</td><td>폴리스티렌, 5mL 혈청학 피펫</td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>1495949A</td><td>폴리프로필렌, 50 mL</td></tr><tr><td>케이블 타이 마운팅 패드</td><td>Grainger</td><td>6EEE6</td><td>1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H</td></tr><tr><td>디스펜싱 시린지</td><td>Grainger</td><td>5FVE0</td><td>10mL, Luer-Lock 연결</td></tr><tr><td>패브릭 메쉬 그물 포함</td><td></td><td></td>, <td>1mm 메쉬</td></tr><tr><td>흐름 표시기</td>, <td>Grainger</td><td>8RH52</td>, <td>5/16 to 1/2 인치 연결 크기, 패들 휠 스타일,</td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td>, <td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>ID: 5/16, OD: 7/16, 벽: 1/16</td></tr><tr><td>나무 프레임</td><td></td><td></td><td>, 2 인치 x 3/4 인치의 10 피트</td></tr><tr><td>지퍼 타이</td><td></td><td></td><td>>5inch</td></tr><tr><td>기화기 인터페이스(매니폴드에 대한 예산 대체):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분배 주사기</td><td>그레인저</td><td>5FVE0</td><td>10mL(Luer-Lock 연결 포함</td></tr><tr><td>상업용 매니폴드 및 기화기:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4인치 등가 가시 Y 커넥터</td><td>Somni Scientific</td><td>BF-9000</td><td></td></tr><tr><td>1/8인치 NPT to 1/4 인치 가시 엘보우(플라스틱)</td><td>Somni Scientific</td><td>BF-9004</td><td></td></tr><tr><td>AIR 0-4 LPM 유량계(검은색 손잡이 포함</td>) <td>Somni Scientific</td><td>FP-4002</td><td></td></tr><tr><td>유량계 보조 장착 브래킷</td><td>Somni Scientific</td><td>NonInvPart</td><td></td></tr><tr><td>Medical Air, 1/8인치 NPT Male x DISS Male</td><td>Somni Scientific</td><td>GF-11012</td><td></td></tr><tr><td>TT-2 탁상용 마취 시스템, 이중 전환 밸브 시스템 내장. 6' 색상으로 구분된 튜빙 X2 포함. (기화기는 포함되어 있지 않음)</td><td>Somni Scientific</td><td>TT-17000</td><td></td></tr><tr><td>Tec 7 Isoflurane 기화기</td><td>GE Datex-Ohmeda</td><td>1175-9101-000</td><td>제제 특이적 기화기 (Isoflurane)</td></tr><tr><td>Tec 7 Sevoflurane 기화기</td><td>GE Datex-Ohmeda</td><td>1175-9301-000</td><td>제제 특이적 기화기 (Sevoflurane)</td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster를 사용한 휘발성 물질의 고처리량 조사를 위한 직렬 마취 어레이

The Serial Anesthesia Array for the High-Throughput Investigation of Volatile Agents Using Drosophila melanogaster

휘발성 전신 마취제(VGA)는 전 세계적으로 모든 연령과 질병의 수백만 명의 사람들에게 사용됩니다. 고농도의 VGA(수백 마이크로몰에서 낮은 밀리몰)는 관찰자에게 "마취"로 나타나는 뇌 기능의 심오하고 비생리적인 억제를 달성하는 데 필요합니다. 이러한 고농도의 친유성 제제에 의해 유발되는 부수적 효과의 전체 스펙트럼은 알려져 있지 않지만 생물학적 중요성은 이해되지 않았지만 면역 염증 시스템과의 상호 작용이 주목되었습니다.
동물에서 VGA의 생물학적 효과를 조사하기 위해 우리는 초파리(Drosophila melanogaster)가 제공하는 실험적 이점을 활용하기 위해 SAA(Serial Anesthesia Array)라는 시스템을 개발했습니다. SAA는 직렬로 배열되고 공통 유입에 연결된 8개의 챔버로 구성됩니다. 일부 부품은 실험실에서 사용할 수 있으며 다른 부품은 쉽게 제작하거나 구입할 수 있습니다. VGA의 보정된 관리에 필요한 기화기는 상업적으로 제조된 유일한 구성 요소입니다. VGA는 대량(일반적으로 95% 이상)이 운반 가스이기 때문에 작동 중에 SAA를 통해 흐르는 대기의 작은 비율만을 구성합니다. 기본 운송업체는 항공입니다. 그러나 산소 및 기타 가스는 조사할 수 있습니다. 
이전 시스템에 비해 SAA의 주요 이점은 여러 파리 코호트를 정확히 적정 가능한 용량의 VGA에 동시에 노출시킬 수 있다는 것입니다. 모든 챔버에서 몇 분 안에 동일한 농도의 VGA가 달성되므로 구별할 수 없는 실험 조건을 제공합니다. 각 챔버는 단일 파리에서 수백 마리의 파리까지 포함 할 수 있습니다. 예를 들어, SAA는 8개의 서로 다른 유전자형 또는 서로 다른 생물학적 변수(예: 남성 대 여성, 노인 대 젊은이)를 가진 4개의 유전자형을 동시에 검사할 수 있습니다. 우리는 SAA를 사용하여 신경염증-미토콘드리아 돌연변이 및 외상성 뇌 손상(TBI)과 관련된 두 가지 실험 파리 모델에서 VGA의 약력학 및 약리유전학적 상호작용을 조사했습니다.

SAA 비디오 링크는 여기에 제공됩니다 : Perouansky 연구 방법-마취과-UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) 우리 연구실은 SAA를 사용하여 (i) 마취제에 대한 행동 민감도에 대한 유전자형의 영향을 연구했습니다5; (ii) 마취제의 부수적 효과에 대한 미토콘드리아 돌연변이체를 선별11; (iii) 외상성 뇌 손상(TBI)12,13,14,15,16,17의 결과에 대한 이소플루란 및 세보플루란의 약력학을 조사합니다. 발표된 결과는 유전적 배경이 기존의 마취 표현형과 마취 독성의 부수적 효과 및 조직 보호와 관련하여 임상적으로 사용된 VGA의 약력학에 영향을 미친다는 것을 분명히 보여줍니다 5,11,13,14,15.
대표적인 예 1(그림 2): 신뢰성 있게 재현 가능한 실험 조건에서 검출된 이소플루란 독성에 대한 복원력의 유전적 드리프트 별도로 배양된 ND2360114 파리 사이에서 VGA 유발 사망률의 점진적인 정량적 변화의 발견은 SAA를 사용하는 실험군 전반에 걸쳐 마취 약력학의 신뢰할 수 있는 비교의 유용성을 보여주는 예입니다. ND23 은 mETC의 복합체 I의 코어에 있는 서브유닛을 암호화하는 유전자입니다(포유류의 Ndufs8 과 유사)18. 이 서브유닛의 돌연변이는 치명적인 미토콘드리아 질환인 리 증후군의 원인입니다. 우리는 표준 실험실 조건(즉, VGA에 노출되지 않음)에서 동시에 배양된 다양한 동형접합 ND2360114 주식에서 시간이 지남에 따라 이소플루란 유발 사망 표현형의 점진적인 약화를 관찰했습니다. 이소플루란 독성에 대한 이러한 진화적 적응은 VGA에 대한 노출이 없을 때 발생했으며 아마도 돌연변이 주식 내에서 "적자생존"의 부수적 효과일 것입니다. 이소플루란 민감도의 이러한 점진적인 변화는 실험 조건이 분석 전반에 걸쳐 그리고 시간이 지남에 따라 동일하다는 우리의 확신 없이는 인식되지 않았을 것입니다. 우리는 선택이 ND2360114의 효과에 대한 수정자를 선호하며 우연히도 이소플루란 독성에 대한 회복력이 증가한다고 결론지었습니다. 중추 신경계의 염증이 리 증후군의 발병에 중요한 역할을 하기 때문에 목격된 내성의 진화는 선천적 면역 염증 반응의 적응 변화로 인한 것일 수 있으며 이소플루란 독성에 대한 내성은 우발적인 부산물입니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65144/65144fig02.jpg"> 그림 2: ND2360114 파리의 진화적 압력으로 인한 이소플루란 독성 유발 사망률의 변화. 단일 쌍 교배를 통해 단일 집단에서 분리, 확장 및 2% 이소플루란(10-13일령)에 2시간 노출 후 24시간 사망률(PM24)에 대해 테스트한 7개의 라인(AG)은 단일 집단에서 발생하는 표현형의 가변성을 보여줍니다. 상자와 수염 그림으로 표시된 데이터입니다. 상자는 데이터의 두 번째 및 세 번째 사분위수를 나타내며 수염은 최소 및 최대 데이터 요소까지 확장됩니다. 평균과 중앙값은 각각 "+"와 수평선으로 표시됩니다. 개별 반복실험의 사망률(N)은 원으로 표시됩니다. N = 20-50마리의 파리/바이알이 들어 있는 3-4개의 바이알. 일반 일원 분산 분석에 대한 P-값; p=0.012는 평균 간의 유의한 차이를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65144/65144fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
대표적인 예 2(그림 3): 이소플루란 약력학에 대한 유전적 배경 효과를 밝히기 위한 SAA의 고처리량 적용 그림 시스템의 높은 처리량의 예로서, 그림 3은 외상성 뇌 손상(TBI)16 이전에 이소플루란(2% 이소플루란의 15분)에 대한 동일한 노출의 효과를 보여줍니다.16, 이 플라이 모델13,15,19에서 프로토콜 테스트 마취 전처리(AP). 판독값은 자연 감소에 대해 TBI 보정 후 24시간 후의 사망률입니다(MI24). 이 모델에서, 모든 파리는 TBI 후 30분 이내에 이동성을 회복(즉, 살아 있음)했고, MI24에 기록된 사망률은 이차성 뇌 손상(sBI)의 결과였다. 4개의 플라이 라인에서 이소플루란이 있는 AP는 MI24를 다양한 정도로 감소시켰으며, 이는 AP에 대한 반응성이 정량적 특성임을 나타냅니다. 염증 반응은 sBI로부터의 이환율에 중요한 인자이기 때문에, AP는 면역계의 조절을 수반할 수 있다20.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65144/65144fig03.jpg"> 그림 3: 이소플루란으로 전처리하여 사망률 억제(MI24)에 대한 유전적 배경의 영향. 15분 동안 2% 이소플루란(보라색)으로 전처리 파리를 하면 w 1118 및 y1w1118 균주에서 24시간(MI24)에서 사망률 지수가 감소했습니다(각각 p &lt; 0.0001 및 p = 0.036). MI24는 사전 조건화된 오레곤 R(OR) 및 캔톤 S(CS) 라인에서 유의하게 낮지 않았다(각각 p=0.16 및 p=0.27). 상자와 수염 그림으로 표시된 데이터입니다. 상자는 데이터의 두 번째 및 세 번째 사분위수를 나타내며 수염은 최소 및 최대 데이터 요소까지 확장됩니다. 평균과 중앙값은 각각 "+"와 수평선으로 표시됩니다. 개별 반복실험(N)의 MI24 값은 원으로 표시됩니다. N = 30-40마리의 파리 15-33개 바이알/TBI 처리 파리용 바이알. N = 처리되지 않은 대조군의 경우 30-40마리의 파리/바이알의 2-15개 바이알. 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정의 P-값입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65144/65144fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

초파리(Drosophila melanogaster)는 생물학 및 독성 연구에 널리 사용됩니다. 파리의 유용성을 확장하기 위해 우리는 여러 파리 샘플을 휘발성 전신 마취제(VGA)에 동시에 노출시키는 기기인 직렬 마취 어레이를 개발하여 VGA의 부수적 효과(독성 및 보호)를 조사할 수 있도록 했습니다.

Drosophila melanogaster를 사용한 휘발성 물질의 고처리량 조사를 위한 직렬 마취 어레이

Volatile general anesthetics (VGAs) are used worldwide on millions of people of all ages and medical conditions. High concentrations of VGAs (hundreds of ...

SAA는 정교한 뇌와 방대한 행동 레퍼토리를 부여받은 무척추 동물 모델 유기체에서 휘발성 물질의 약리학을 조사하기 위한 고처리량 처리를 허용합니다. Drosophila melanogaster에서 사용할 수 있는 유전 도구 상자와 함께 이 기술을 사용하면 휘발성 물질의 약리유전학을 빠르고 저렴하게 연구할 수 있습니다. 많은 사람들이 오염 물질이나 치료제로 휘발성 물질에 노출됩니다.마취 외에도 휘발성 마취제는 수많은 독성 및 유익한 부수적 효과가 있습니다. 효과의 정도는 부분적으로 유전학에 의해 결정되며, 유전학은 대부분 미개척 상태로 남아 있습니다. 나무 프레임을 만든 후 50/9인치 드릴 비트로 각 캡에 두 개의 구멍을 뚫어 32밀리리터 크로니클 튜브 캡을 수정합니다.울퉁불퉁 한 플라스틱을 청소하기 위해 구멍을 샌딩하십시오. 또한 표면을 거칠게 하기 위해 캡 상단을 샌딩합니다. 그런 다음 5밀리리터 혈청학적 피펫을 크기에 맞게 자르고 플라스틱에 점수를 매기고 점수가 매겨진 라인에서 깨끗하게 부수십시오.절단되거나 부러진 피펫의 끝을 샌딩하십시오. 그런 다음 그물을 튜브에 붙이고 접착제가 마르면 그물을 튜브 크기로 자릅니다. 두 튜브가 캡 위로 뻗어 있는 원뿔형 캡의 구멍에 튜브를 삽입합니다.유입 튜브가 유출 튜브보다 튜브 안으로 더 오래 연장되는지 확인하십시오. 튜브 주위의 캡 상단에 접착제를 바르고 부품을 함께 고정하고 건조시킵니다. 접착 케이블 타이 다운을 프레임에 부착합니다.지퍼 타이를 사용하여 캡을 프레임에 부착하고 지퍼 타이 태그 끝을 짧게 자릅니다. 타이곤 튜브의 길이를 절단하여 수정된 각 캡의 유입 및 유출 튜브에 연결합니다. 상류 끝에서 시작하여 튜브를 먼저 유입에 부착 한 다음 유출에서 후속 위치의 유입으로 연결합니다.다음으로, 가장 다운스트림 유입에 흐름 표시기를 추가합니다. 50밀리리터의 원추형 튜브를 첫 번째 위치에 놓고 물 채우기 표시를 표시합니다. 튜브를 제거합니다.유입 튜브 아래에 물을 채우고 제자리에 다시 놓습니다. 기화기의 인터페이스를 준비합니다. 플런저를 제거하고 두 개의 10밀리리터 분배 주사기에서 노치를 잘라낸 다음 노치가 기화기 전면을 향하도록 하여 구멍에 맞춰 기화기 유입 및 유출에 삽입합니다.전체 시스템을 연결합니다. 타이곤 튜브를 사용하여 캐리어 가스 탱크를 레귤레이터, 가스비유량계, 기화기 및 SAA와 부착합니다. 어레이의 빈 위치를 빈 50밀리리터 크로니클 튜브로 채웁니다.이제 가스 탱크를 켭니다. 유량계를 분당 2리터로 열고 기화기를 켜서 0%기화기 상류의 유량계와 SAA의 마지막 챔버 하류의 유량 표시기를 확인하여 시스템을 통한 가스 흐름을 확인합니다. 또는 다운스트림 튜브 끝을 물에 삽입하고 기포가 있는지 확인합니다.마취 노출 24시간 이상에 바람직한 방법을 사용하여 실험에 필요한 파리 코호트를 분류한다. 식품 바이알에서 파리를 빈 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 노출되기 전에 죽은 파리를 세고 기록하십시오.파리가 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브의 캡을 풀고 SAA에 나사로 고정합니다. 운반 가스를 켜고 원하는 유량으로 설정하십시오. 마취 기화기를 원하는 농도로 설정하고 원하는 시간 동안 파리를 노출시킵니다.노출이 끝나면 총 SAA 부피의 약 10배에 해당하는 5분 동안 분당 1.5리터의 신선한 가스 흐름으로 시스템을 세척합니다. 고압 조절기를 완전히 연 다음 반 바퀴 돌려 닫아 캐리어 가스 흐름을 보장합니다. 유량계와 기화기까지 각 라인의 튜브를 따라 기화기의 마취 수준을 확인하십시오.가스가 흐를 때 유량계와 다운스트림 유량 표시기에 흐름이 표시되는지 확인하십시오. 실험이 끝나면 4-5 분 동안 공기 흐름으로 마취제를 씻어 내십시오. 단일 쌍 회의를 통해 단일 개체군으로부터 분리된 7개 라인은 ND23 60114 파리에서 진화적 압력으로 인한 이소불소 독성 유발 사망률의 변화를 보여주었습니다.외상성 뇌 손상 전에 15분 동안 2% iso 불소로 사전 컨디셔닝 비행을 하면 흰색 1118 및 노란색/흰색 균주에서 24시간 사망률이 감소했습니다. 24시간째의 사망률 지수는 사전 조절된 Oregon R 및 Canton S 라인에서 유의하게 낮지 않았습니다. 조립하는 동안 수정된 주사기의 노치는 기화기 포트의 구멍과 정렬되어야 합니다.노출하는 동안 시스템을 통해 흐름이 있는지 주기적으로 확인하십시오. 이 절차는 휘발성 물질의 약리학에 대한 통찰력으로 이어질 수 있는 다양한 행동, 생존 및 분자 연구를 위해 따를 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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학습 및 기억과 같은 인지 과정 중 세포 활동을 연구하는 데 있어 중요한 장벽은 생체 내 이미징 준비를 위해 마취제를 사용하는 것입니다. 마취는 초파리(Drosophila)를 포함한 여러 모델에서 단기 기억과 인지를 손상시킵니다.이 연구는 마취 없이 생체 내 이미징을 위해 성인 초파리를 준비하는 독특한 방법을 제시합니다.

생체 내 마취되지 않은 초파리 성충의 신경 활동 이미징

대기압에서는 무해해 보이는 가스가 고압 조건에서 마취와 같은 행동을 유발할 수 있습니다. 기존의 고압 압력 챔버는 비용이 많이 들고 노동 집약적입니다. 이 연구는 4기압 이하의 중간 압력에서 제논이 Drosophila melanogaster에 미치는 영향을 간단하고 저비용으로 평가하는 방법을 제시합니다.

초파리 멜라노가스터에 대한 제논 마취를 이용한 고압 시스템 검증

배우세요 Drosophila melanogaster를 이용한 직렬 마취 어레이(SAA)로 휘발성 마취제의 약리학을 고처리량으로 조사하는 방법입니다. 유전적 다양성을 활용하여 독성 및 보호 효과를 탐구할 수 있습니다.

Drosophila melanogaster를 사용한 휘발성 물질의 고처리량 조사를 위한 직렬 마취 어레이

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