Drosophila melanogaster를 사용한 휘발성 물질의 고처리량 조사를 위한 직렬 마취 어레이
2023년 2월 24일
초파리(Drosophila melanogaster)는 생물학 및 독성 연구에 널리 사용됩니다. 파리의 유용성을 확장하기 위해 우리는 여러 파리 샘플을 휘발성 전신 마취제(VGA)에 동시에 노출시키는 기기인 직렬 마취 어레이를 개발하여 VGA의 부수적 효과(독성 및 보호)를 조사할 수 있도록 했습니다.
SAA는 정교한 뇌와 방대한 행동 레퍼토리를 부여받은 무척추 동물 모델 유기체에서 휘발성 물질의 약리학을 조사하기 위한 고처리량 처리를 허용합니다. Drosophila melanogaster에서 사용할 수 있는 유전 도구 상자와 함께 이 기술을 사용하면 휘발성 물질의 약리유전학을 빠르고 저렴하게 연구할 수 있습니다. 많은 사람들이 오염 물질이나 치료제로 휘발성 물질에 노출됩니다.
마취 외에도 휘발성 마취제는 수많은 독성 및 유익한 부수적 효과가 있습니다. 효과의 정도는 부분적으로 유전학에 의해 결정되며, 유전학은 대부분 미개척 상태로 남아 있습니다. 나무 프레임을 만든 후 50/9인치 드릴 비트로 각 캡에 두 개의 구멍을 뚫어 32밀리리터 크로니클 튜브 캡을 수정합니다.
울퉁불퉁 한 플라스틱을 청소하기 위해 구멍을 샌딩하십시오. 또한 표면을 거칠게 하기 위해 캡 상단을 샌딩합니다. 그런 다음 5밀리리터 혈청학적 피펫을 크기에 맞게 자르고 플라스틱에 점수를 매기고 점수가 매겨진 라인에서 깨끗하게 부수십시오.
절단되거나 부러진 피펫의 끝을 샌딩하십시오. 그런 다음 그물을 튜브에 붙이고 접착제가 마르면 그물을 튜브 크기로 자릅니다. 두 튜브가 캡 위로 뻗어 있는 원뿔형 캡의 구멍에 튜브를 삽입합니다.
유입 튜브가 유출 튜브보다 튜브 안으로 더 오래 연장되는지 확인하십시오. 튜브 주위의 캡 상단에 접착제를 바르고 부품을 함께 고정하고 건조시킵니다. 접착 케이블 타이 다운을 프레임에 부착합니다.
지퍼 타이를 사용하여 캡을 프레임에 부착하고 지퍼 타이 태그 끝을 짧게 자릅니다. 타이곤 튜브의 길이를 절단하여 수정된 각 캡의 유입 및 유출 튜브에 연결합니다. 상류 끝에서 시작하여 튜브를 먼저 유입에 부착 한 다음 유출에서 후속 위치의 유입으로 연결합니다.
다음으로, 가장 다운스트림 유입에 흐름 표시기를 추가합니다. 50밀리리터의 원추형 튜브를 첫 번째 위치에 놓고 물 채우기 표시를 표시합니다. 튜브를 제거합니다.
유입 튜브 아래에 물을 채우고 제자리에 다시 놓습니다. 기화기의 인터페이스를 준비합니다. 플런저를 제거하고 두 개의 10밀리리터 분배 주사기에서 노치를 잘라낸 다음 노치가 기화기 전면을 향하도록 하여 구멍에 맞춰 기화기 유입 및 유출에 삽입합니다.
전체 시스템을 연결합니다. 타이곤 튜브를 사용하여 캐리어 가스 탱크를 레귤레이터, 가스비유량계, 기화기 및 SAA와 부착합니다. 어레이의 빈 위치를 빈 50밀리리터 크로니클 튜브로 채웁니다.
이제 가스 탱크를 켭니다. 유량계를 분당 2리터로 열고 기화기를 켜서 0%기화기 상류의 유량계와 SAA의 마지막 챔버 하류의 유량 표시기를 확인하여 시스템을 통한 가스 흐름을 확인합니다. 또는 다운스트림 튜브 끝을 물에 삽입하고 기포가 있는지 확인합니다.
마취 노출 24시간 이상에 바람직한 방법을 사용하여 실험에 필요한 파리 코호트를 분류한다. 식품 바이알에서 파리를 빈 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 노출되기 전에 죽은 파리를 세고 기록하십시오.
파리가 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브의 캡을 풀고 SAA에 나사로 고정합니다. 운반 가스를 켜고 원하는 유량으로 설정하십시오. 마취 기화기를 원하는 농도로 설정하고 원하는 시간 동안 파리를 노출시킵니다.
노출이 끝나면 총 SAA 부피의 약 10배에 해당하는 5분 동안 분당 1.5리터의 신선한 가스 흐름으로 시스템을 세척합니다. 고압 조절기를 완전히 연 다음 반 바퀴 돌려 닫아 캐리어 가스 흐름을 보장합니다. 유량계와 기화기까지 각 라인의 튜브를 따라 기화기의 마취 수준을 확인하십시오.
가스가 흐를 때 유량계와 다운스트림 유량 표시기에 흐름이 표시되는지 확인하십시오. 실험이 끝나면 4-5 분 동안 공기 흐름으로 마취제를 씻어 내십시오. 단일 쌍 회의를 통해 단일 개체군으로부터 분리된 7개 라인은 ND23 60114 파리에서 진화적 압력으로 인한 이소불소 독성 유발 사망률의 변화를 보여주었습니다.
외상성 뇌 손상 전에 15분 동안 2% iso 불소로 사전 컨디셔닝 비행을 하면 흰색 1118 및 노란색/흰색 균주에서 24시간 사망률이 감소했습니다. 24시간째의 사망률 지수는 사전 조절된 Oregon R 및 Canton S 라인에서 유의하게 낮지 않았습니다. 조립하는 동안 수정된 주사기의 노치는 기화기 포트의 구멍과 정렬되어야 합니다.
노출하는 동안 시스템을 통해 흐름이 있는지 주기적으로 확인하십시오. 이 절차는 휘발성 물질의 약리학에 대한 통찰력으로 이어질 수 있는 다양한 행동, 생존 및 분자 연구를 위해 따를 수 있습니다.
개요
직렬 마취 어레이(serial anesthesia array, SAA)는 휘발성 전신 마취제(volatile general anesthetics, VGAs)의 약리학을 연구하기 위해 *Drosophila melanogaster*를 고효율로 처리하도록 설계된 새로운 기기입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 초파리의 유전적 다양성을 활용하여 VGAs가 초파리에 미치는 독성 및 보호 효과를 모두 탐색할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 약리학
- 독성학
배경
- Drosophila melanogaster는 생물학적 연구에서 널리 사용되는 모델 생물입니다.
- VGA는 유전적 요인의 영향을 받는 다양한 부수적 효과를 나타냅니다.
- SAA는 여러 시료를 VGA에 동시에 노출시키는 것을 용이하게 합니다.
- VGA의 효과를 이해하면 치료 및 독성학적 함의에 대한 정보를 얻을 수 있습니다.
연구 목적
- 초파리에서 VGA의 고처리량 조사를 위한 방법을 개발한다.
- VGA에 대한 반응의 유전적 기초를 탐구한다.
- Drosophila에 미치는 VGA의 독성 및 보호 효과를 모두 평가한다.
사용된 방법
- 수정된 50 mL conical tube 캡과 혈청 피펫을 이용한 SAA 제작.
- 초파리 시료에 VGA를 전달하기 위한 가스 흐름 시스템 설정.
- 제어된 조건 하에서 Drosophila를 VGA에 노출.
- 노출 후 초파리의 폐사율 및 행동 반응 모니터링.
주요 결과
- 다양한 초파리 계통 간에 iso fluorine 독성으로 인한 사망률의 차이가 관찰되었습니다.
- iso fluorine을 이용한 사전 처리는 특정 계통에서 사망률을 감소시켰습니다.
- SAA 방법은 휘발성 마취제(VGA)에 대한 효율적이고 재현 가능한 테스트를 가능하게 합니다.
- 이를 통해 얻은 통찰은 휘발성 제제의 약리학에 대한 더 나은 이해로 이어질 수 있습니다.
결론
- SAA는 초파리에서 VGA의 효과를 연구하는 데 효과적인 도구입니다.
- 유전적 요인은 VGA에 대한 반응에 중요한 역할을 합니다.
- 이 연구는 더 광범위한 생물학적 맥락에서 VGA의 효과를 이해하는 데 시사점을 줄 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업계 관련성 개요
직렬 마취 어레이(Serial Anesthesia Array, SAA)는 초파리에서 휘발성 전신 마취제(volatile general anesthetics, VGAs)에 대한 고처리량 정량 조사를 가능하게 하여, 초기 발견 단계에서의 신속한 약물 유전학적 및 기전적 리스크 제거를 지원합니다. SAA는 여러 유전자형 또는 생물학적 변수에 대한 동시적이고 제어된 노출을 가능하게 함으로써, 신경약리학 및 독성학 파이프라인의 타겟 검증과 포트폴리오 선별에 있어 예측 신뢰도를 높입니다. 이 플랫폼은 약물 반응의 유전적 및 환경적 결정 요인을 조사하기 위한 확장 가능하고 재현 가능한 시스템에 대한 필요성을 충족합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 제어된 in vivo 시스템에서 VGA 반응에 영향을 미치는 유전적 결정 요인을 체계적으로 조사할 수 있습니다.
- 다양한 초파리 모델에서 약력학적 및 약유전학적 상호작용을 명확히 함으로써 기전적 리스크 감소를 지원합니다.
- 재현 가능하고 병렬화된 노출 및 결과 측정을 통해 기능적 타겟 검증을 용이하게 합니다.
- 신경 활성 화합물 프로그램의 추진을 위한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 화합물 스크리닝 및 기전 연구를 위해 검증되고 확장 가능한 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 다양한 코호트와 유전자형 전체에 걸쳐 노출 조건과 정량적 출력값을 표준화합니다.
- 행동, 생존 및 분자적 엔드포인트에 대한 재현 가능하고 고처리량의 평가를 가능하게 합니다.
- 유전적 조작이 가능한 모델에서 화합물의 효능 및 독성을 평가하기 위한 분석 준비를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련 유전적 및 환경적 변수와 전임상 모델 시스템을 일치시킵니다.
- 초기 발견 단계부터 신경약리학적 가설의 전임상 검증까지 연속성을 제공합니다.
- 유전자형 및 조건 전반에 걸친 견고한 비교 데이터를 바탕으로 리스크가 조정된 진행 결정을 가능하게 합니다.
- 신경염증 및 손상 모델에서 중개 바이오마커 탐색을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
SAA는 초기 가설 검증 및 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴 및 전임상 모델 개발에 이르기까지의 발견 연속체에 통합됩니다.
- 발견 생물학: 확장 가능한 in vivo 시스템에서 VGA 효과 및 유전적 수정 인자에 대한 가설 기반 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 코호트 간 비교 및 화합물 평가를 위해 표준화된 정량적 결과물을 제공합니다.
- 분석: 사망률, 행동 및 분자적 종말점에 대한 통계적 분석을 가능하게 하여 의사 결정에 필요한 정보를 제공합니다.
- 중개 연구: 질병 관련 유전적 및 손상 변수를 모델링하여 발견 단계와 전임상 단계 사이의 가교 역할을 합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 약리학 및 유전학 연구에 적용 가능한 재사용 가능하고 모듈화된 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 신경활성 화합물 개발에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 약물유전학 및 독성학 연구의 표준화, 재현성 및 처리량을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 견고한 비교 데이터 생성을 가능하게 하여 go/no-go 결정 및 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 신경약리학 자산의 위험 조정 우선순위 지정 및 발전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- Drosophila 유전학, 행동 분석 및 약리학에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 기화기 장비, 가스 유량 제어 및 정량적 판독을 위한 분석 인프라에 대한 접근이 필요합니다.
- 노출 프로토콜과 데이터 분석 워크플로의 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 유전자형, 생물학적 변수 및 실험 종점에 적용 가능합니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 다른 모델 생물로의 확장성과 포유류 시스템으로의 적용 가능성이 있습니다.
