광견병 항원을 캡슐화하는 박동성 고분자 미세입자의 제조
2023년 5월 12일
이 방법은 광견병 항원을 미리 결정된 지연 후에 박동성 방출을 가능하게 하는 구조적 및 물질적 특성을 가진 생분해성 고분자 미세입자로 캡슐화하는 것을 설명합니다. 입자 코어에서 회수된 항원의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 평가는 입자 제조를 통해 손상되지 않은 삼량체 광견병 바이러스 당단백질의 존재를 확인합니다.
이 접근법의 중요성은 한 번의 주사로 여러 용량의 백신을 투여하는 데 사용될 수 있으며, 특히 신생아가 접근 문제로 인해 예방 접종을받지 못하는 저소득 및 중간 소득 국가에서 수백만 명의 생명을 구할 수 있다는 것입니다. 이 제조 방법을 통해 광견병 백신은 단 한 번의 주사로 현재 예방 접종 일정을 모방하는 미립자로 캡슐화 될 때 고유 면역 부여 형태를 유지할 수 있습니다. 광견병은 치명적인 질병으로, 사망을 예방하기 위해 경우에 따라 최대 5번의 반복 백신 주사가 필요합니다.
그러나 한 번의 방문으로 완전한 백신 요법을 투여하면 순응도를 높이고 생명을 구할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 질병에 대한 다양한 치료제 또는 예방을 전달할 수 있는 플랫폼 기술을 나타냅니다. 먼저 3D 프린팅된 마스터 몰드 표면을 표면에 40마이크로리터의 트리클로로실란이 있는 유리 슬라이드가 들어 있는 진공 챔버에 넣어 처리합니다.
1 시간 동안 진공을 시작하십시오. PDMS 프리폴리머 베이스와 경화제를 9:1의 질량비로 플라스틱 컵에 혼합합니다. 그런 다음 용액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 3 분 동안 300 G을 원심 분리합니다.
원심분리 후 용액이 깨끗한지 확인하십시오. 표면 처리가 완료되면 마스터 몰드를 알루미늄 호일 접시에 놓고 경화되지 않은 PDMS를 몰드에 부어 피처가 완전히 잠기도록 합니다. 알루미늄 호일 접시를 진공 챔버에 넣고 진공 청소기를 1시간 동안 당겨 기포를 제거합니다.
알루미늄 호일 접시를 제거한 후 마스터 몰드의 양쪽 끝에 800마이크로미터 스페이서를 놓고 기포를 피하면서 깨끗한 유리 슬라이드를 마스터 몰드에 오버레이합니다. 바인더 클립을 사용하여 800미크론 스페이서 위에 금형을 고정합니다. 예비중합체를 섭씨 120도의 오븐에서 4시간 동안 경화시킨다.
경화되면 바인더 클립을 조심스럽게 풉니다. 면도날을 사용하여 경화된 PDMS 몰드에서 마스터 몰드를 분리합니다. PLGA 필름을 준비하기 위해, 450 밀리그램의 PLGA를 링 심 내의 붙지 않는 폴리머 시트에 놓는다.
그런 다음 PLGA에 두 번째 논스틱 폴리머 시트를 오버레이하고 101.6mm C-클램프를 사용하여 손가락이 조일 때까지 두 개의 알루미늄 블록 사이의 스택을 압축합니다. C-cl 배치amped 어셈블리를 진공 오븐에 넣습니다. 오븐에서 30분 후 클램프를 조이고 30분 더 다시 놓습니다.
그런 다음 어셈블리를 데시케이터에 4시간 동안 옮겨 냉각시킵니다. 냉각되면 클램프를 풀고 붙지 않는 폴리머 시트에서 PLGA 필름을 제거하고 라벨이 붙은 페트리 접시에 넣습니다. 나중에 사용할 수 있도록 페트리 접시를 데시케이터 안에 보관하십시오.
PLGA 입자를 생성하려면 앞에서 설명한 대로 PDMS 몰드 표면을 처리합니다. 핀셋 또는 메스를 사용하여 250미크론 PLGA 필름을 입자 어레이의 대략적인 크기로 절단하고 처리된 PDMS 몰드에 놓습니다. PDMS 몰드 상단의 PLGA 필름에 깨끗한 유리 현미경 슬라이드를 오버레이하고 어레이와 PLGA 필름 위에 스프링 클램프를 배치하여 함께 고정합니다.
클램핑된 금형 어셈블리를 진공 오븐에 1시간 동안 보관한 다음 실온에서 15분 동안 냉각합니다. 냉각되면 면도날을 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 PDMS 몰드를 PLGA 입자 어레이에서 분리하고 추가 사용을 위해 PLGA 입자를 데시케이터에 저장합니다. 농축된 광견병 백신 항원으로 입자를 채우려면 압전 디스펜서를 준비하고 PLGA 입자가 포함된 슬라이드를 분배 영역에 넣습니다.
플레이트에 농축된 항원을 로드한 다음 대상 설정 매개변수를 입력하고 실행을 클릭합니다. 그러면 압전 로봇이 입자를 채웁니다. 완료되면 스테레오스코프를 사용하여 파티클이 채워졌는지 확인합니다.
채워진 입자를 밀봉하려면 열판에 스테인리스 스틸 블록을 놓고 스테인리스 스틸 블록에 두 개의 평행 현미경 슬라이드를 놓습니다. 스테인레스 스틸 블록을 평평하게 한 후 핫 플레이트를 켜고 온도를 섭씨 205도로 설정합니다. 스테인리스강의 원하는 표면 온도에 도달하면, 채워진 PLGA 입자를 두 개의 유리 슬라이드에 현탁시키고 즉시 18초 동안 타이머를 시작한다.
밀봉된 입자 어레이를 핫 플레이트에서 제거한 후 실험실 벤치에 있는 두 개의 유리 슬라이드에 매달고 1분 동안 냉각합니다. 밀봉된 입자를 수확하려면 메스 블레이드를 슬라이드에 대해 45도 각도로 잡고 입자 바닥에 압력을 가하여 슬라이드에서 분리합니다. 메스를 사용하여 수확 된 입자를 0.5 밀리리터의 저 단백질 결합 튜브로 옮깁니다.
광견병 백신 안정성을 유지하기 위해 소 혈청 알부민과 포도당을 함유한 PBS 250마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 입체경 아래에 놓고 한 쌍의 미세 핀셋에 한 갈래를 사용하여 입자를 분쇄합니다. 입자 충전 중에는 완전한 용매 또는 수분 증발을 위해 충분한 건조 시간이 필요합니다. 건조 후, 용질 저장소는 입자 코어의 바닥에 남아있다.
이 PLGA의 경우 18초에서 24초 사이의 천장 시간 사이에 입자의 이상적인 형태가 관찰되었는데, 이는 화물을 포함하는 입자가 입자 구조를 잃지 않고 그 시간에 완전히 밀봉되었기 때문입니다. 입자는 적절하게 포장되고 밀봉되었을 때 19게이지 바늘에 쉽게 들어갈 수 있을 만큼 충분히 작았습니다. 또한, 10 개의 입자는 19 % 카르복시 메틸 셀룰로오스와 같은 점성 용액에 주입 할 때 2 게이지 바늘을 통해 일관되게 흘렀습니다.
투과 전자 현미경 사진은 농축된 항원 샘플에서 온전한 광견병 변이체를 나타냈고, 이들은 출발 원액보다 약 4.4배 더 농축되었습니다. 밀봉 후 항원의 약 69%가 생리활성 형태로 캡슐화된 상태로 유지되며, 이는 열 스트레스가 밀봉 중에 상당한 손실을 유발하지만 대부분의 바이러스 항원은 손상되지 않은 상태로 유지됨을 시사합니다. 미세 입자 충전은 가장 중요한 단계 중 하나입니다.
입자가 올바르게 채워지지 않으면 입자가 올바르게 밀봉되지 않을 수 있습니다. 안정성을 이해하려면 입자 코어의 부형제 및 기타 생물학적으로 관련된 물질을 포함한 추가 제형 개발이 필요합니다.
개요
이 방법은 미리 정해진 지연 후 맥동 방출을 가능하게 하는 생체 분해성 고분자 마이크로입자로 광견병 항원을 캡슐화하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 단일 주사로 여러 회 접종 백신을 투여할 수 있게 해 저소득 및 중간소득 국가에서 예방접종 접근성을 개선할 수 있습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 백신 전달 시스템
- 생체 분해성 고분자
- 면역학
배경
- 광견병은 여러 회 백신 접종이 필요한 치명적인 질병입니다.
- 현재 예방접종 일정은 준수하기 어려울 수 있습니다.
- 캡슐화 기술은 백신 안정성 및 전달을 향상시킬 수 있습니다.
- 단일 주사 솔루션은 충분한 서비스를 받지 못하는 지역에서 생명을 구할 수 있습니다.
연구 목적
- 광견병 백신 항원을 캡슐화하는 방법을 개발합니다.
- 전통적인 예방접종 일정을 모방하는 전달 시스템을 만듭니다.
- 백신 준수 및 접근성을 개선합니다.
사용된 방법
- 마이크로입자 생산을 위한 PDMS 금형 제작.
- 항원 캡슐화를 위한 PLGA 필름 및 입자 준비.
- 백신으로 입자를 채우기 위한 압전 분배기 사용.
- 안정성 테스트를 위한 채워진 마이크로입자의 밀봉 및 수확.
주요 결과
- 입자는 광견병 백신 항원으로 성공적으로 채워졌습니다.
- 캡슐화 후 약 69%의 항원이 생물학적으로 활성을 유지했습니다.
- 입자 무결성을 유지하기 위한 밀봉 시간이 최적화되었습니다.
- 마이크로입자는 표준 바늘을 통한 주사에 적합한 크기를 보였습니다.
결론
- 이 방법은 백신 전달을 위한 유망한 플랫폼을 제공합니다.
- 단일 주사 백신은 예방접종 비율을 향상시킬 수 있습니다.
- 다른 치료제에 대한 이 기술의 응용을 탐색하기 위한 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Pulsatile polymeric microparticle encapsulation of rabies antigen enables single-injection vaccine regimens, addressing adherence and access barriers in resource-limited settings. This platform technology supports the delivery of immunogenic antigens with tunable release profiles, directly impacting vaccine pipeline efficiency and global health portfolios. The method's ability to preserve antigen integrity during fabrication is critical for predictive confidence in translational vaccine development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antigen stability and immunogenicity under encapsulation stressors.
- Supports functional validation of antigen release kinetics for immune response modeling.
- Facilitates predictive assessment of formulation impact on antigen bioactivity.
Screening & Assay Development
- Provides standardized microparticle fabrication for reproducible vaccine delivery studies.
- Enables quantitative ELISA-based measurement of antigen recovery post-encapsulation.
- Supports scalability and platform reuse for diverse antigen candidates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant vaccine delivery models for preclinical evaluation.
- Maintains continuity from antigen discovery through formulation optimization.
- De-risks advancement by demonstrating preserved antigenicity after processing.
Pipeline & Workflow Integration
This encapsulation method integrates from antigen discovery through preclinical formulation, supporting lead candidate selection and translational readiness.
- Discovery Biology: Confirms antigen integrity and immunogenicity post-encapsulation for hypothesis-driven vaccine design.
- Screening: Standardizes microparticle production and ELISA-based quantification for batch comparability.
- Analytics: Delivers quantitative recovery and bioactivity data to inform formulation decisions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling single-injection regimens in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform adaptable to multiple vaccine and therapeutic payloads.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antigen stability and release kinetics.
- Operational Value: Standardizes encapsulation and assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions for vaccine candidates based on quantitative antigen recovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of single-injection vaccine platforms for global health impact.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer processing and microfabrication techniques.
- Demands access to piezoelectric dispensing and ELISA analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of fabrication and assay protocols.
- Adaptation to other antigens may require formulation optimization for stability.
- Heat sealing step may limit compatibility with highly heat-sensitive biomolecules.
