Name: 광견병 항원을 캡슐화하는 박동성 고분자 미세입자의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 학습하세요 광견병 항원을 박동성 고분자 미세입자에 캡슐화하는 방법을. PLGA 미세입자 제조 및 밀봉 기술을 활용하여 단일 주사로 다회 접종 효과를 구현하고 저소득 국가의 예방접근성을 향상시키는 백신 전달 플랫폼을 개발합니다.

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Particles for Humanity에 RABV 항원을 제공한 Chiron Behring과 Bharat Biotech International에 감사드립니다. 또한 Charles Rupprecht, VMD, MS, PhD.의 귀중한 지침과 기술적 공헌에 감사드립니다. 저자는 SciFLEXARRAYER S3 피코리터 디스펜싱 장치의 사용을 허용한 Dr. Rebecca Richards-Kortum의 관대함과 장치 사용에 대한 Dr. Chelsey Smith의 지시에 감사드립니다. 우리는 또한 광견병 항원의 현미경 이미지를 생성한 매사추세츠 챈 의과대학(University of Massachusetts Chan Medical School)을 인정합니다. 마지막으로 제출 전에 문서를 검토해 주신 Don Chickering과 Erin Euliano에게 감사드립니다. 이 작업은 빌 앤 멜린다 게이츠 재단(Bill and Melinda Gates Foundation)의 보조금(INV-004360)으로 지원되었습니다.

<ol><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+health+impact+of+vaccination+against+ten+pathogens+in+98+low-income+and+middle-income+countries+from+2000+to+2030%3A+a+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Estimating the health impact of vaccination against ten pathogens in 98 low-income and middle-income countries from 2000 to 2030: a modelling study.</a> The Lancet. 397, 398-408 (2021).</li>
<li>Euliano, E. M., Sklavounos, A. A., Wheeler, A. R., McHugh, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+diagnostics+and+drug+delivery+technologies+to+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translating diagnostics and drug delivery technologies to low-resource settings.</a> Science Translational Medicine. 14 (666), eabm1732(2022).</li>
<li>Haider, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies%3A+old+disease%2C+new+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Medical+Association+Journal%22%5BJournal%5D)">Rabies: old disease, new challenges.</a> Canadian Medical Association Journal. 178 (5), 562-563 (2008).</li>
<li>Fisher, C. R., Streicker, D. G., Schnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+and+evolution+of+rabies+virus%3A+conquering+new+frontiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 241-255 (2018).</li>
<li>Nagarajan, T., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagarajan%2C+T+%22Rabies+and+Rabies+Vaccines%22">Rabies and Rabies Vaccines</a>. , Springer International Publishing. (2020).</li>
<li>Shi, T., Dunham, E. F., Nyland, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+vaccination+compliance+and+reasons+for+incompletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Western+Journal+of+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rabies vaccination compliance and reasons for incompletion.</a> The Western Journal of Emergency Medicine. 21 (4), 918-923 (2020).</li>
<li>Shankaraiah, R. H., Rajashekar, R. A., Veena, V., Hanumanthaiah, A. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compliance+to+anti-rabies+vaccination+in+post-exposure+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Compliance to anti-rabies vaccination in post-exposure prophylaxis.</a> Indian Journal of Public Health. 59 (1), 58-60 (2015).</li>
<li>Cleland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-administration+vaccines%3A+controlled-release+technology+to+mimic+repeated+immunizations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-administration vaccines: controlled-release technology to mimic repeated immunizations.</a> Trends in Biotechnology. 17 (1), 25-29 (1999).</li>
<li>Yeh, M. K., Coombes, A. G. A., Jenkins, P. G., Davis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+emulsification-solvent+extraction+technique+for+production+of+protein+loaded+biodegradable+microparticles+for+vaccine+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">A novel emulsification-solvent extraction technique for production of protein loaded biodegradable microparticles for vaccine and drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 33 (3), 437-445 (1995).</li>
<li>Peyre, M., Sesardic, D., Merkle, H. P., Gander, B., Johansen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+divalent+vaccine+based+on+biodegradable+microspheres+induces+protective+immunity+against+tetanus+and+diphtheria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">An experimental divalent vaccine based on biodegradable microspheres induces protective immunity against tetanus and diphtheria.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 92 (5), 957-966 (2003).</li>
<li>Mvan de Weert, M., Hennink, W. E., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+instability+in+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Protein instability in poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles.</a> Pharmaceutical Research. 17 (10), 1159-1167 (2000).</li>
<li>Graf, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+platform+for+fabricating+biodegradable+microparticles+with+pulsatile+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A scalable platform for fabricating biodegradable microparticles with pulsatile drug release.</a> Advanced Materials. , https://doi.org/10.1002/adma.202300228 e2300228 (2023).</li>
<li>Wang, Y., Qin, B., Xia, G., Choi, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA%27s+poly+%28lactic-co-glycolic+acid%29+research+program+and+regulatory+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Association+of+Pharmaceutical+Scientists+Journal%22%5BJournal%5D)">FDA's poly (lactic-co-glycolic acid) research program and regulatory outcomes.</a> The American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 23 (4), 92(2021).</li>
<li>Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+stabilizing+formulations+of+a+trivalent+inactivated+poliovirus+vaccine+in+a+dried+state+for+delivery+in+the+NanopatchTM+microprojection+array%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of stabilizing formulations of a trivalent inactivated poliovirus vaccine in a dried state for delivery in the NanopatchTM microprojection array.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (6), 1540-1551 (2018).</li>
<li>Smith, T. G., Siirin, M., Wu, X., Hanlon, C. A., Bronshtein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+vaccine+preserved+by+vaporization+is+thermostable+and+immunogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rabies vaccine preserved by vaporization is thermostable and immunogenic.</a> Vaccine. 33 (19), 2203-2206 (2015).</li>
<li>McHugh, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+fillable+microparticles+and+other+complex+3D+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of fillable microparticles and other complex 3D microstructures.</a> Science. 357 (6356), 1138-1142 (2017).</li>
<li>Sanchez, M. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+vaccine+characterization+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rabies vaccine characterization by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8149(2020).</li>
<li>Fu, K., Pack, D. W., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+evidence+of+acidic+environment+within+degrading+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+%28PLGA%29+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Visual evidence of acidic environment within degrading poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres.</a> Pharmaceutical Research. 17 (1), 100-106 (2000).</li>
</ol>

McHugh 박사는 포괄적 인 연구를 기반으로 특허를 출원했으며 현재 Particles for Humanity의 컨설턴트입니다. Mr. Graf는 포함된 작업을 기반으로 특허를 출원했습니다. Kadasia 박사, Yang 및 Brady는 이 작업 중에 MIT로부터 유사한 미세 입자 백신 전달 기술을 라이선스한 공익 법인인 Particles for Humanity의 일원입니다.

특정 요구 사항에 맞게 입자 형상을 변경할 수 있습니다. 그러나 원통형 구조의 경우 저자는 프로토콜에 설명된 높이:직경:벽 두께의 5:4:1 비율을 유지할 것을 권장합니다. 이 종횡비는 입자를 밀봉하기에 충분한 PLGA 재료가 존재하고 취급하기에 충분히 기계적으로 견고함을 유지하도록 합니다. CAD 프로세스 중에 입자 치수와 모양을 쉽게 변경할 수 있으므로 수많은 형상을 생성할 수 있습니다. CAD의 유연성과 3D 프린팅을 결합하면 미세 입자 설계를 빠르게 반복할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다광자 3D 프린터를 사용하지만 적절한 재료로 미세 구조 치수를 인쇄할 수 있는 사양을 가진 모든 3D 프린터를 사용하여 초기 마스터 몰드를 생성할 수 있습니다. 또한, 포토리소그래피는 이전에 이 프로토콜에서 생성된 것보다 훨씬 더 큰 어레이에서 유사한 구조를 만드는 데 사용되었습니다. 그러나 노동력, 맞춤형 포토마스크 주문 지연, 장비 접근성으로 인해 반복적인 설계 프로세스가 느려질 수 있다(16). 마지막으로, 마스터 금형 생성은 사내 마스터 금형 제작이 불가능한 경우 유료 서비스 회사에 아웃소싱할 수 있습니다. 마스터 몰드를 생성하는 데 사용되는 3D 프린터 또는 방법에 관계없이 인쇄물을 기판에 접착하는 것은 다운스트림 단계에서 매우 중요합니다. 특히, PDMS 몰드 생성 중에 접착력이 불충분할 경우, 인쇄된 입자가 PDMS 몰드에 박힌 채로 남아 인쇄된 입자를 수동으로 제거하고 마스터 몰드를 파괴해야 합니다.
입자 충전은 고려해야 할 또 다른 중요한 측면입니다. 미립자는 충전 용량이 제한되어 있으므로 여과는 RABV 항원을 농축할 뿐만 아니라 미립자 코어 부피의 많은 부분을 차지하는 스톡 부형제를 제거하는 데에도 사용됩니다. 그러나 RABV 항원의 크기가 크면(약 60nm x 180nm) 17, 원심분리 단계에서 항원을 부분적으로 펠릿화할 수 있습니다. 이러한 이유로 RABV 항원의 높은 회수율을 달성하기 위해 원심분리 후 피펫팅 또는 볼텍싱에 의해 항원을 재현탁하는 것이 중요합니다. 고농축 용액은 분주 주기를 줄여 충진 중 항원 분해를 제한하기 때문에 분주에 이상적입니다. 그러나 점도는 안정적인 방울을 형성하는 압전 디스펜싱 로봇의 주요 한계이므로 매우 높은 농도의 용액을 디스펜싱하는 것이 불가능하거나 바람직하지 않을 수 있습니다. 충진 용액을 희석하는 것이 안정적인 입자 형성을 달성하는 가장 쉬운 방법이지만, 원하는 로딩을 달성하는 데 필요한 추가 충진 주기에 대한 항원 안정성과 입자를 채우는 데 필요한 더 긴 시간을 고려해야 합니다.
제한 이 방법은 초기 금형을 생산하기 위한 고도로 전문화된 장비와 미세 입자 생산을 위한 특수 충전 장비가 필요합니다. 초기 마스터 몰드를 생성할 수 있는 인쇄 해상도를 가진 3D 프린터의 필요성은 행위별 수가제 접근 방식으로 전복될 수 있지만 압전 디스펜싱 로봇에 대한 접근성은 제한적입니다. 압전 디스펜싱 로봇을 조달하려면 브랜드, 처리량 및 기능에 따라 종종 $80,000에서 $200,000 사이의 상당한 초기 초기 투자가 필요합니다. 몇 가지 다른 충전 방법이 잠재적인 대안이지만, 이러한 방법은 RABV 항원12를 사용하여 검증되지 않았습니다.
향후 적용 분야 캡슐화된 RABV 항원의 상당 부분은 밀봉 공정을 통해 안정적으로 유지되었습니다. 이론적으로, 이 항원을 노출후 예방 치료의 투여 타임라인을 모방하는 상이한 유형의 PLGA로 구성된 입자에 통합함으로써, 모든 용량을 단일 주사로 투여할 수 있었다. 추가 용량을 투여하기 위해 병원을 반복적으로 방문할 필요가 없어지면 환자 순응도가 향상되어 치료 결과가 향상됩니다. 또한, 고도로 복잡한 비활성화 된 광견병 바이러스의 ELISA 반응성을 유지하는 능력을 입증 한 후, 서브 유닛 백신을 포함한 다른 항원이이 캡슐화 방법과 호환 될 가능성이 있습니다. PULSED 미립자와 함께 다른 예방 항원을 사용하면 백신 접종이 부족한 인구의 예방 접종률을 높여 LMIC에서 수백만 명의 생명을 구할 수 있습니다. 그러나 이를 달성하기 위해서는 백신이 캡슐화뿐만 아니라 방출을 통해 안정적으로 유지되어야 하며, 이는 페이로드가 체온 및 PLGA 분해 생성물로 인해 고온과 잠재적으로 산성인 미세 환경에 노출되기 때문에 어려울 수 있습니다18. 향후 연구에서는 방출을 통한 항원의 안정화 전략을 추구할 것이며, 이는 많은 전염병을 예방하는 데 광범위하게 적용할 수 있는 단일 주사 백신 접종 플랫폼의 가능성을 열어줄 것입니다.

백신 접종은 2000년에서 2019년 사이에 3,700만 명 이상의 사망을 예방한 매우 효과적인 의료 도구입니다1. 이러한 효과에도 불구하고, 백신으로 예방할 수 있는 질병은 전 세계 보건에 계속해서 심각한 위험을 초래하고 있으며, 특히 높은 백신 미접종률 및 미흡률로 인해 연간 150만 명의 백신 예방 가능 사망자가 발생하는 저소득 및 중간 소득 국가(LMIC)에서더욱 그렇습니다 2. 광견병도 이러한 불균형에서 예외는 아닙니다. 광견병은 인류에게 알려진 가장 치명적인 질병임에도 불구하고 거의 보편적으로 치명적이기 때문에 완전히 치료할 수 있으며 많은 고소득 국가에서 근절된 것으로 분류됩니다. 대신, 광견병의 부담은 아시아와 아프리카의 일부 지역에 사는 사람들에 의해 불균형적으로 부담되며, 이 질병은 인간과 가축에게 치명적인 결과를 초래합니다 3,4.
백신 접종은 광견병이 전 세계에 미치는 영향을 관리하는 데 매우 중요하다5. 예방 접종 비용은 질병의 전반적인 발병률이 낮다는 점을 고려하여 노출 전 예방(PrEP)의 광범위한 시행을 금지합니다. 또한 LMIC에서 노출 후 예방(PEP)의 유용성은 의료 서비스를 원하는 환자에 대한 사회경제적 압력에 의해 제한됩니다. 의료 액세스 포인트까지의 이동 거리, 치료를 받는 동안 임금 손실, 치료 비용, 일상 활동을 방해하는 약속 및 건망증과 같은 물류 요인으로 인해 PEP 준수율이 60%로 낮아집니다6,7. 이 높은 환자 감소율은 질병을 퇴치하기 위해 광견병 예방 접종의 격차를 해소하기 위한 접근 방식을 개선할 수 있는 기회를 제공합니다.
항원 방출을 조절하는 단일 주사(SI) 백신 접종 시스템은 한 번의 주사로 완전한 면역을 얻는 방법으로 연구되었습니다. 의료 서비스 제공자를 여러 번 방문할 필요가 없어지면 개인이 적절한 치료를 받지 못하게 하는 부담이 완화됩니다. SI 백신접종을 달성하기 위해, 항원은 전형적으로 종종 주사 가능한 미립자의 형태를 취하는 생분해성 중합체 매트릭스 내에 캡슐화된다. 일단 주입되면, 중합체는 분해되고 격리 된 항원을 방출한다. 현재까지 SI 백신 접종을 달성하기 위해 두 가지 기본 릴리스 전략이 추구되었습니다. 한 접근법에서, 항원은 장기간에 걸쳐 연속적으로 방출된다. 단일 주사의 면역원성을 향상시키기 위한 것이지만, 이 접근법이 인간의 광견병 바이러스(RABV)에 대한 보호 면역 반응을 이끌어내기에 충분한지는 불분명하다8. 다른 예에서, 항원은 종래의 입증된 프라임-부스트 백신 요법을 모방하기 위해 미리 결정된 지연 후에 방출된다. 분무 건조 및 에멀젼/용매 증발 기반 미세입자 제조 방법은 전자의 전략을 나타내며, 모델 백신9과 파상풍 톡소이드10와 같은 매우 안정적인 항원을 성공적으로 캡슐화하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 캡슐화 방법은 항원을 변성시킬 수 있는 열, 용매 상호작용 및 물리적 힘을 포함하는 스트레스 요인을 포함한다11.
PULSED(Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs)는 생분해성 미세 입자에 생물학적 제제를 캡슐화하는 데 사용할 수 있는 최근에 개발된 제조 방법입니다. 마이크로 몰딩은 액체 페이로드로 채워지고 가열되어 폴리머가 리플로우되고 생분해성 폴리머의 인접한 층 내에서 화물의 중앙 저장소를 완전히 캡슐화할 수 있도록 하는 입자를 생성하는 데 사용됩니다. 이러한 미세구조는 중합체성 쉘(12)의 분해 속도에 의존하는 지속기간 후에 페이로드의 박동성 방출을 초래한다. 이 원고는 많은 FDA 승인 제형13에 사용되는 생분해성 폴리머인 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)로 구성된 미세 입자 내에서 비활성화된 RABV를 캡슐화하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 평가된 바와 같이 안정적인 RABV 항원을 캡슐화하기 위해 PULSED 제조 방법을 사용하는 것을 보여줍니다. PLGA 입자를 상이한 분자량 및/또는 말단기와 결합함으로써, 이 접근법은 단일 주사 후 현재의 광견병 백신 접종 시간 경과를 모방할 수 있는 잠재력을 갖는다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m PES 필터</td><td>Cole-Parmer+B4B2:B63</td><td>04396-26</td><td></td></tr><tr><td>0.25 mm Shims</td><td>McMaster Carr</td><td>98090A935</td><td></td></tr><tr><td>0.75 inch 바인더 클립</td><td>스테이플</td><td>480114</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>10 mL&nbsp; 돋보기 스트라이프가 있는 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>101.6mm C-클램프</td><td>Amazon</td><td>PT-SD-CP01A</td><td>검은색 손잡이는 결국 떨어집니다. 이 경우 플라이어를 사용하여 조정하십시오.</td></tr><tr><td>19 G 바늘</td><td>EXCELINT</td><td>26438</td><td></td></tr><tr><td>25 mL&nbsp; 확대경 스트라이프가 있는 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트&nbsp;</td><td>Millipore 시그마</td><td>M6514-25ML</td><td></td></tr><tr><td>5 mL&nbsp; 돋보기 스트라이프가 있는 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>50 mL&nbsp; 메니파이어 스트라이프가 있는 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>피셔</td><td>AC268310010</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 블록</td><td>McMaster Carr</td><td>9057K175</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>VWR</td><td>89079-069</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5mL 원심 필터, 100kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>C82301</td><td></td></tr><tr><td>광견병 바이러스 항체, 무혈청 항체, 클론 1112-1, 100</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>광견병 바이러스 마우스 단클론 항체, 클론 D1-25, 비오틴화</td><td>Fisherbrand</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>카르복시메틸 셀룰로오스</td><td>Tokyo Chemical Industries</td><td>C0045</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 300, 필터, 랙 Fisherbrand</td><td></td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Costar 0.65 mL 저결합 스냅 캡 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3206</td><td></td></tr><tr><td>Costar 1.7 mL 저 바인딩 스냅 캡 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nanoscribe 3D 프린터의 인쇄 매개변수를 정의하는 데 사용되는 Nanoscribe 소프트웨어는 프린터와 함께 제공된 1.2. 단계입니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td>10529901</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>스테이플</td><td>649280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x), 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>F1-ClipTip 멀티채널 피펫, 30 to 300 &micro; L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne 에어로졸 배리어 피펫 팁, 0.1 &ndash; 10 &마이크로; L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne 에어로졸 배리어 피펫 팁, 100 &ndash; 1000 &마이크로; L</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne 에어로졸 배리어 피펫 팁, 2 &ndash; 20 &마이크로; L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne 에어로졸 배리어 피펫 팁, 20 &ndash; 200 & 마이크로; L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>피셔브랜드&nbsp; Elite 피펫 키트</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 피펫 컨트롤러&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시, 90mm</td><td>VWR</td><td>470313-346</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>글로브 사이언티픽</td><td>1380-10</td><td></td></tr><tr><td>헬리콘 포커스 8</td><td>HeliconSoft</td><td></td><td>소프트웨어 스택 이미지</td></tr><tr><td>IP-Q 수지</td><td>나노 스크라이브</td><td></td><td>에 사용프린터 수지는 10x 렌즈와 호환되며 Nanoscribe Photonic Professional GT2</td></tr><tr><td>Lascar EL-USB-TC-LCD 열전대</td><td>Amazon</td><td>5053485896236</td><td>또는 동급의</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 박스</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z374385-1EA</td><td>또는</td></tr><tr><td>10X 대물렌즈</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가 있는 동급의 Nanoscribe Photonic Professional GT2에서 대형 미세 구조를 인쇄하는 데 사용됩니다.NanoWrite</td><td>Nanoscrive 3D 프린터와 인터페이스하는 데 사용되는 Nanoscribe 소프트웨어입니다. 프린터와 함께 제공되는 소프트웨어입니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate</td><td>Invitrogen</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>OPD 기판 정제 (o-Phenylenediamine Dihydrochloride)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 래핑 필름, 4 인치.</td><td>Fisherbrand</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>PDC 60 타입 3 코팅</td><td>Scienion</td><td>P-2020</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 입자 금형</td><td>Rice University</td><td>n/a</td><td>N/A- 입자는 400 &mu; 벽 두께가 100 &mu인 직경의 m; m, 그리고 500 &mu의 높이; m, 내부 지름은 200 &mu;m입니다. 어레이는 14 x 22 입자 간격이 600 &mu입니다. m은 서로 떨어져 있습니다. 4 점 및 5 점 별은 기준점으로 사용되며 600 &mu에 위치합니다. m을 어레이의 오른쪽 상단 및 왼쪽 상단 파티클의 오른쪽과 왼쪽에 둡니다.</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>피어스 안정적인 과산화물 기판 버퍼 (10x)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 컵</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04170</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 필름, 502H</td><td>시그마</td><td>502H: 719897-1G</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트</td><td>밀리포어 시그마</td><td>484431</td><td></td></tr><tr><td>광견병 항원</td><td>Chiron Behring 및 Bharat Biotech International</td><td></td><td>Material은 회사와 재료 이전 계약을 체결하여 인수되었습니다.</td></tr><tr><td>면도날</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>VWR</td><td>21899-530 및 76457-512</td><td></td></tr><tr><td>SciFLEXARRAYER S3(PCD 60</td><td>Scienion</td><td></td><td>포함 또는</td></tr><tr><td>96웰 플레이트용 동급의 밀봉 테이프</td><td>Thermo Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>University Wafer</td><td>1025</td><td></td></tr><tr><td>스프링 클램프</td><td>IRWIN</td><td></td><td></td>VGP58100</tr><tr><td>스테인레스 스틸 블록</td><td>McMaster Carr</td><td>9083K12</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin&minus; 과산화효소 폴리머, 초고감도</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>DOW</td><td>2646340</td><td></td></tr><tr><td>테프론 시트</td><td>McMaster Carr</td><td>9266K12</td><td>PLGA 필름을 만드는 데 사용됩니다. 적절한 크기의 조각으로 잘라야 합니다.</td></tr><tr><td>테플론 시트, 0.8 mm 두께</td>의 <td>McMaster Carr</td><td>9266K81</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) 실란</td><td>시그마</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>핀셋&nbsp;</td><td>Pixnor</td><td>ESD-16</td><td></td></tr><tr><td>초순수 증류수</td><td>Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UV 오븐, CL-1000S UV Crosslinker</td><td>UVP</td><td>95-0174-01</td><td>또는 이에 상응하는</td></tr><tr><td>진공 탈착기</td><td>Bel-Art</td><td>F420100000</td><td>이 중 두 개가 필요합니다. 하나는 오염을 방지하기 위해 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸) 실란으로 샘플을 전처리하는 데만 사용됩니다.</td></tr><tr><td>120 &deg에 도달할 수 있는 진공 오븐; C</td><td>VWR</td><td>97027-664</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>진공, CRVpro4&nbsp;</td><td>Welch</td><td>3041-01</td><td>또는 동급의</td></tr><tr><td>나무 혀 압착</td>기 <td>전자 현미경 과학</td><td>72320</td><td></td></tr></tbody></table>

광견병 항원을 캡슐화하는 박동성 고분자 미세입자의 제조

Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen

광견병 노출 후 예방에 대한 현재 지침은 몇 주에 걸쳐 여러 번 주사해야 합니다. 이것은 광견병에 대한 치명적인 노출의 대부분이 발생하는 저소득 및 중간 소득 국가(LMIC)에 거주하는 사람들에게 불균형적으로 부담이 될 수 있습니다. 항원을 고분자 입자로 캡슐화하여 백신 요법을 단일 주사로 압축하기 위해 다양한 약물 전달 전략이 탐구되었습니다. 그러나, 캡슐화 과정 동안 가혹한 스트레스 요인은 캡슐화된 항원의 변성을 유발할 수 있다. 이 기사에서는 광견병 바이러스(RABV) 항원을 조정 가능한 박동 방출을 나타내는 고분자 미세 입자로 캡슐화하는 방법을 설명합니다. PULSED(Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs)라고 하는 이 방법은 소프트 리소그래피를 사용하여 미세 입자를 생성하여 다광자 3D 프린팅 마스터 몰드에서 역 폴리디메틸실록산(PDMS) 몰드를 만듭니다. 그런 다음 폴리락틱-코-글리콜산(PLGA) 필름을 PDMS 몰드로 압축 성형하여 압전 디스펜싱 로봇을 사용하여 농축된 RABV로 채워진 개방형 실린더를 생성합니다. 그런 다음 이러한 미세 구조는 입자의 상단을 가열하여 밀봉되어 재료가 흐르고 연속적인 비다공성 고분자 장벽을 형성할 수 있도록 합니다. 제조 후, 온전한 삼량체 광견병 바이러스 당단백질의 검출에 특이적인 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 미세입자에서 면역원성 항원의 높은 회수율을 확인합니다.

입자 밀봉 및 충전은 이 프로토콜에서 가장 중요한 두 단계입니다. 입자는 이상적인 충전과 몇 가지 일반적인 오류를 보여주기 위해 플루오레세인 나트륨 염으로 채워졌습니다. 시각화의 용이성을 위해 RABV 항원 대신에 플루오레세인 나트륨 염을 사용하였다. 충전하는 동안 입자 코어의 바닥에 용액을 분배한 다음 용매/물이 증발할 때까지 충분한 시간을 허용하는 것이 중요합니다. 완료되면 용질 저장소가 입자 코어의 바닥에 남아 있습니다(그림 1A). 일단 채워지면 입자를 올바르게 밀봉하는 것이 중요합니다. 그림 1B 는 밀봉 공정의 여러 결과(성공 및 실패)를 보여줍니다. 12초의 밀봉 시간이 지나면 입자 중심에서 입자 외부로 뚜렷한 경로가 남아 완전히 밀봉되지 않은 입자를 보여줍니다. 반대로, 36초 동안 밀봉하도록 방치하면 PLGA가 거의 완전히 녹아서 프로파일이 얕은 미세구조가 됩니다. 이상적인 형태는 입자가 18초 및 24초 동안 밀봉될 때 시각화할 수 있는데, 이는 입자 구조를 유지하면서 폴리머에 의해 완전히 캡슐화된 화물을 포함하기 때문입니다. 그림 1C 는 충진 및 밀봉 후 몇 가지 잠재적인 결과를 보여줍니다. 분배하는 동안 용매가 입자 바닥에 도달하지 않으면 입자 코어의 중간에 용질이 건조됩니다 (잘못 채워짐). 이러한 입자는 여전히 밀봉될 수 있지만 화물의 적재 불량은 적재 효율을 제한할 수 있습니다. 입자가 너무 많은 카고로 채워지면(overfilled), 카고가 PLGA가 개구부를 통해 유동하는 것을 방지하기 때문에 밀봉 공정이 금지됩니다. 올바르게 채워지고 밀봉되면 이 형상의 입자는 19G 바늘 안에 쉽게 들어갈 수 있을 만큼 작습니다. 또한, 2% 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 점성 용액을 주입했을 때 10개의 입자가 19G 바늘(100% ± 0%)을 통해 일관되게 흘렀습니다(보충 그림 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig01.jpg"> 그림 1: 충진 및 밀봉 공정의 일반적인 문제 . (A) 이미지는 한 번의 충전 사이클 후 용매의 증발을 보여주며, 여기서 입자에는 물에 용해된 100mg/mL 플루오레세인 나트륨 염 6nL이 로드됩니다. (B) 0, 12, 18, 24 및 36초에 밀봉 공정에서 제거된 502H PLGA 입자의 대표 이미지. (C) 입자가 올바르게, 부정확하게 채워지거나, 과충전되었을 때 밀봉 공정의 다른 결과. 이미지는 여러 이미지를 초점 스태킹하고 초점 스태킹 소프트웨어를 사용하여 병합하여 생성됩니다. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
항원을 입자에 로딩하기 전에 스핀 필터를 통해 처리하는 것은 두 가지 이유로 중요합니다. 첫째, 원심분리는 백신 용액 중의 스톡 부형제를 제거하는 역할을 하는데, 이는 RABV 항원을 보유하면서 입자 로딩 용량을 제한할 수 있다. 현재 프로토콜은 항원을 약 50배 정제합니다. 둘째, 이 과정에서 항원도 농축됩니다. 도 2A 는 농축된 항원 샘플 중의 무손상 RABV 비리온의 현미경 사진을 나타낸다. 이 항원은 출발 원액보다 약 4.4배 더 농축되어 있습니다(그림 2B). 원심 스핀 필터에 초기에 로딩된 항원의 양은 달성된 최종 폴드 농도를 조절하기 위해 변경될 수 있습니다. 예를 들어, 40μL의 스톡 항원을 로드하면 약 1.75배 농도가 됩니다. 보충 그림 8 은 농축 공정에서 와류(단계 5.15)의 중요성을 보여줍니다. 소용돌이를 게을리하거나 샘플을 부적절하게 소용돌이치면 농축 과정이 제한됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig02.jpg"> 그림 2: 항원 농도. 원심 여과에 의한 항원의 농도를 투과전자현미경(A)으로 나타내고 ELISA(B)로 확인하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 통계 분석은 단방향 ANOVA를 사용한 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행됩니다. **p &lt; 0.01, ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
도 3A는 밀봉되지 않은 밀봉된 입자로 채워진 농축된 항원을 나타낸다. 상당한 양의 항원이 입자에 로드되지만(0.0469 ± 0.0086 IU), 이 물질은 입자 용량의 &lt;90%를 구성하여 추가 항원 로딩을 위한 충분한 공간을 남깁니다. 흥미롭게도 밀봉되지 않은 입자는 0.0396 ± 0.0077 IU만 함유하고 있으며, 이는 로드된 총량의 85% ± 16%만을 차지합니다. 비록 통계적으로 유의하지 않은 손실이었지만, RABV 항원의 일부는 충전 공정에서 반복적인 재수화 및 건조 동안 변성되었을 수 있다. 밀봉 후 항원의 69% ± 5%가 생리활성 형태로 캡슐화된 상태로 유지됩니다. 이는 열 응력으로 인해 밀봉 공정 중에 상당한 손실이 발생함을 시사하지만, 대부분의 비활성화된 바이러스 항원은 손상되지 않은 상태로 남아 있습니다(그림 3B). 항원과 함께 안정화 부형제의 공동-캡슐화는 제조 공정 전반에 걸쳐 항원 안정성을 더욱 증가시키기 위한 하나의 가능한 전략이며, 이전에 다른 불활성화된 바이러스 항원과 함께 성공적이었다14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig03.jpg"> 그림 3: 입자 제조 후 생체 활성 RABV 항원. (A) 이미지는 RABV 항원을 포함하는 밀봉되지 않은 입자와 밀봉된 입자를 보여줍니다. (B) 입자 제조 공정을 통한 항원 안정성(n=4). 로딩 제어는 항원을 용액에 직접 분배하여 생성됩니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm. 통계 분석은 단방향 ANOVA를 사용한 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행됩니다. *p &lt; 0.05입니다. 이미지는 여러 이미지를 초점 스태킹하고 초점 스태킹 소프트웨어를 사용하여 병합하여 생성됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 입자, 기준 및 배열 치수. 이 그림은 4각 별 기준점(A), 원통형 미세 입자(B), 5각 별 기준점(C) 및 CAD 소프트웨어에 표시된 기준점(D)이 있는 입자 배열의 기하학적 특성을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 이 그림은 PDMS 금형을 경화시키기 위해 오븐에 배치된 구조물의 단면을 보여줍니다. 화살표는 바인더 클램프가 적용되는 위치를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S2.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: 농축된 항원을 효율적으로 회수하기 위한 적절한 기술. 첫 번째 스핀이 끝나면 농축된 샘플이 빨간색(A)으로 원으로 표시되어 필터에 유지되고 여과액은 수집 튜브(더 큰 외부 튜브)의 바닥에 수집됩니다. 펠릿화된 항원을 재현탁하기 위해, 원심 필터 유닛은 와류를 준비하기 위해 수집 튜브(B)를 사용하여 캡핑된다. 와동할 때 튜브의 끝이 와류 패드와 접촉한 상태를 유지하고 캡 끝이 와류 패드(C)와 45° 각도를 유지하면서 회전합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S3.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4: 사전 실행 프로그래밍 압전 디스펜서. (A) "메인 탭"에서 로봇 설정 &gt; 기타 &gt;Div. 기능 &gt; 목표 기준점 찾기로 이동하여 "대상 기준점 찾기"를 설정합니다. 파란색으로 강조 표시된 버튼을 사용하여 신탁 표시를 설정합니다. 먼저 Learn Template(템플릿 학습)을 선택하고 관심 있는 신탁 마크 주위에 상자를 그리고 Search Template(템플릿 검색)을 클릭하여 템플릿 정확도를 확인한 다음 템플릿을 저장합니다. 4각 및 5각 별에 대해 이 작업을 수행하고 두 개의 다른 템플릿 이미지 사용의 지침에 따라 파일 이름을 저장합니다. 그런 다음 블랙 박스의 모든 매개 변수가 일치하는지 확인합니다. 템플릿 로드(Load Template)(녹색 상자)를 사용하여 4각형 별 기준점을 로드합니다. 작업 목록(주황색 상자)을 선택하여 "대상 참조점 찾기" 프로그램을 저장합니다. (B) 로봇 설정 &gt; 작업 탭으로 이동하여 실행을 설정한 다음 실행 선택 항목(녹색 상자)의 작업을 사용하여 작업 목록(검은색 상자)에서 작업을 추가하여 파란색 상자에 표시된 작업 순서를 로드합니다 . 마지막으로 작업(주황색 상자)을 저장합니다. (C) 로봇 설정 &gt; 대상 기판으로 이동하여 "대상 기판"을 설정한 다음 대상(파란색 상자)을 추가합니다. (D) 여기에 표시된 매개 변수를 입력하고 저장(파란색 상자)을 선택합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S4.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 5: 항원 로딩 및 분배 정렬 보정. (A) 노즐 설정 &gt; 작업 수행 탭으로 이동하여 TakeProbe10 uL (블랙 박스)을 선택하고 DO (블랙 박스)를 클릭하여 항원 10μL을 디스펜싱 팁으로 흡인합니다. (B) 별도의 창이 열립니다. 농축된 항원이 로딩된 웰을 선택하고 OK (파란색 상자)를 선택합니다. (C) 항원을 흡인 한 후 파란색 상자를 선택하여 팁을 세척하고이 세척을 두 번 더 반복하십시오. 카메라(검은색 상자)를 선택하고 드롭 볼륨(녹색 상자)을 선택하여 드롭 볼륨을 결정합니다. 부피 표준 편차(%)&lt;2(주황색 상자)로 안정적인 방울이 형성되고 있는지 확인합니다. (D) 이 단계를 따르면 Snap Drop Cam이 열립니다. 드롭다운 메뉴에서 이미지 (파란색 상자)를 선택하고 노즐 헤드 카메라 마법사를 선택합니다. 그러면 새 창이 열립니다. 다음 단계 시퀀스를 빠르게 수행합니다. (E) 보충 그림 4 에서 만든 타겟이 로드되었는지 확인한 다음 타겟으로 이동 (파란색 상자)을 선택합니다. 드롭을 15로 조정하고 스팟 (블랙박스)을 선택합니다. 발견되면 즉시 이동 (녹색 상자)을 선택합니다. 자동 찾기 가 선택되어 있는지 확인하고 입자 크기 = 12를 삭제한 다음 시작 (주황색 상자)을 클릭합니다. 자동 감지에 실패하면 슬라이드의 다른 영역(보라색 상자)으로 이동한 후 이 과정을 반복합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S5.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 6: 스포팅 어레이 프로그래밍 및 실행 시작. (A) 타겟 설정 &gt; 타겟으로 이동한 다음 파란색 상자에 표시된 매개변수를 입력합니다. (B) 그런 다음 "필드 설정 탭"으로 이동하여 아니오에 20 을 입력합니다. 드롭 필드(파란색 상자)에서 웰(검은색 상자)을 선택한 다음 투약할 대상/입자(녹색 상자)를 선택합니다. 다른 웰을 선택하고 타겟/입자를 다시 선택하면 단일 실행 중에 추가 충전 주기가 수행됩니다. (C) 메인 화면에서 보충 그림 5 에서 생성된 실행 및 목표가 선택되어 있는지 확인합니다. (D) "실행 탭"으로 이동하여 실행 시작 (파란색 상자)을 선택합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S6.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 7: 미세입자 주입성. (ᄀ씨) 플루오레세인 나트륨 염으로 채워지고 19G 바늘에 밀봉된 미세 입자의 초점 적층 입체경 이미지. (D) 2% 카르복시메틸셀룰로오스 용액(n=8)을 사용하여 19G 바늘을 통해 총 10개의 입자를 주입하였다. 스케일 바 = 1mm. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S7.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 8: 항원 농도와 관련된 잠재적인 문제. 빨간색 선은 예상되는 농도 증가를 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 통계 분석은 단방향 ANOVA를 사용한 Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 수행되었습니다. p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S8_Revised.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: RABV ELISA를 위한 완충액 및 용액 준비. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 1: 파티클 배열을 포함하는 STL 파일입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplemental%20File%201.STL" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 2: 입자를 밀봉하는 데 사용되는 사용자 슬라이드 홀더의 형상이 포함된 STL 파일입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplemental%20File%202.STL" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 방법은 광견병 항원을 미리 결정된 지연 후에 박동성 방출을 가능하게 하는 구조적 및 물질적 특성을 가진 생분해성 고분자 미세입자로 캡슐화하는 것을 설명합니다. 입자 코어에서 회수된 항원의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 평가는 입자 제조를 통해 손상되지 않은 삼량체 광견병 바이러스 당단백질의 존재를 확인합니다.

The current guidelines for rabies post-exposure prophylaxis require multiple injections administered over several weeks. This can be disproportionately ...

이 접근법의 중요성은 한 번의 주사로 여러 용량의 백신을 투여하는 데 사용될 수 있으며, 특히 신생아가 접근 문제로 인해 예방 접종을받지 못하는 저소득 및 중간 소득 국가에서 수백만 명의 생명을 구할 수 있다는 것입니다. 이 제조 방법을 통해 광견병 백신은 단 한 번의 주사로 현재 예방 접종 일정을 모방하는 미립자로 캡슐화 될 때 고유 면역 부여 형태를 유지할 수 있습니다. 광견병은 치명적인 질병으로, 사망을 예방하기 위해 경우에 따라 최대 5번의 반복 백신 주사가 필요합니다.그러나 한 번의 방문으로 완전한 백신 요법을 투여하면 순응도를 높이고 생명을 구할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 질병에 대한 다양한 치료제 또는 예방을 전달할 수 있는 플랫폼 기술을 나타냅니다. 먼저 3D 프린팅된 마스터 몰드 표면을 표면에 40마이크로리터의 트리클로로실란이 있는 유리 슬라이드가 들어 있는 진공 챔버에 넣어 처리합니다.1 시간 동안 진공을 시작하십시오. PDMS 프리폴리머 베이스와 경화제를 9:1의 질량비로 플라스틱 컵에 혼합합니다. 그런 다음 용액을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 3 분 동안 300 G을 원심 분리합니다.원심분리 후 용액이 깨끗한지 확인하십시오. 표면 처리가 완료되면 마스터 몰드를 알루미늄 호일 접시에 놓고 경화되지 않은 PDMS를 몰드에 부어 피처가 완전히 잠기도록 합니다. 알루미늄 호일 접시를 진공 챔버에 넣고 진공 청소기를 1시간 동안 당겨 기포를 제거합니다.알루미늄 호일 접시를 제거한 후 마스터 몰드의 양쪽 끝에 800마이크로미터 스페이서를 놓고 기포를 피하면서 깨끗한 유리 슬라이드를 마스터 몰드에 오버레이합니다. 바인더 클립을 사용하여 800미크론 스페이서 위에 금형을 고정합니다. 예비중합체를 섭씨 120도의 오븐에서 4시간 동안 경화시킨다.경화되면 바인더 클립을 조심스럽게 풉니다. 면도날을 사용하여 경화된 PDMS 몰드에서 마스터 몰드를 분리합니다. PLGA 필름을 준비하기 위해, 450 밀리그램의 PLGA를 링 심 내의 붙지 않는 폴리머 시트에 놓는다.그런 다음 PLGA에 두 번째 논스틱 폴리머 시트를 오버레이하고 101.6mm C-클램프를 사용하여 손가락이 조일 때까지 두 개의 알루미늄 블록 사이의 스택을 압축합니다. C-cl 배치amped 어셈블리를 진공 오븐에 넣습니다. 오븐에서 30분 후 클램프를 조이고 30분 더 다시 놓습니다.그런 다음 어셈블리를 데시케이터에 4시간 동안 옮겨 냉각시킵니다. 냉각되면 클램프를 풀고 붙지 않는 폴리머 시트에서 PLGA 필름을 제거하고 라벨이 붙은 페트리 접시에 넣습니다. 나중에 사용할 수 있도록 페트리 접시를 데시케이터 안에 보관하십시오.PLGA 입자를 생성하려면 앞에서 설명한 대로 PDMS 몰드 표면을 처리합니다. 핀셋 또는 메스를 사용하여 250미크론 PLGA 필름을 입자 어레이의 대략적인 크기로 절단하고 처리된 PDMS 몰드에 놓습니다. PDMS 몰드 상단의 PLGA 필름에 깨끗한 유리 현미경 슬라이드를 오버레이하고 어레이와 PLGA 필름 위에 스프링 클램프를 배치하여 함께 고정합니다.클램핑된 금형 어셈블리를 진공 오븐에 1시간 동안 보관한 다음 실온에서 15분 동안 냉각합니다. 냉각되면 면도날을 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 PDMS 몰드를 PLGA 입자 어레이에서 분리하고 추가 사용을 위해 PLGA 입자를 데시케이터에 저장합니다. 농축된 광견병 백신 항원으로 입자를 채우려면 압전 디스펜서를 준비하고 PLGA 입자가 포함된 슬라이드를 분배 영역에 넣습니다.플레이트에 농축된 항원을 로드한 다음 대상 설정 매개변수를 입력하고 실행을 클릭합니다. 그러면 압전 로봇이 입자를 채웁니다. 완료되면 스테레오스코프를 사용하여 파티클이 채워졌는지 확인합니다.채워진 입자를 밀봉하려면 열판에 스테인리스 스틸 블록을 놓고 스테인리스 스틸 블록에 두 개의 평행 현미경 슬라이드를 놓습니다. 스테인레스 스틸 블록을 평평하게 한 후 핫 플레이트를 켜고 온도를 섭씨 205도로 설정합니다. 스테인리스강의 원하는 표면 온도에 도달하면, 채워진 PLGA 입자를 두 개의 유리 슬라이드에 현탁시키고 즉시 18초 동안 타이머를 시작한다.밀봉된 입자 어레이를 핫 플레이트에서 제거한 후 실험실 벤치에 있는 두 개의 유리 슬라이드에 매달고 1분 동안 냉각합니다. 밀봉된 입자를 수확하려면 메스 블레이드를 슬라이드에 대해 45도 각도로 잡고 입자 바닥에 압력을 가하여 슬라이드에서 분리합니다. 메스를 사용하여 수확 된 입자를 0.5 밀리리터의 저 단백질 결합 튜브로 옮깁니다.광견병 백신 안정성을 유지하기 위해 소 혈청 알부민과 포도당을 함유한 PBS 250마이크로리터를 추가합니다. 샘플을 입체경 아래에 놓고 한 쌍의 미세 핀셋에 한 갈래를 사용하여 입자를 분쇄합니다. 입자 충전 중에는 완전한 용매 또는 수분 증발을 위해 충분한 건조 시간이 필요합니다. 건조 후, 용질 저장소는 입자 코어의 바닥에 남아있다.이 PLGA의 경우 18초에서 24초 사이의 천장 시간 사이에 입자의 이상적인 형태가 관찰되었는데, 이는 화물을 포함하는 입자가 입자 구조를 잃지 않고 그 시간에 완전히 밀봉되었기 때문입니다. 입자는 적절하게 포장되고 밀봉되었을 때 19게이지 바늘에 쉽게 들어갈 수 있을 만큼 충분히 작았습니다. 또한, 10 개의 입자는 19 % 카르복시 메틸 셀룰로오스와 같은 점성 용액에 주입 할 때 2 게이지 바늘을 통해 일관되게 흘렀습니다.투과 전자 현미경 사진은 농축된 항원 샘플에서 온전한 광견병 변이체를 나타냈고, 이들은 출발 원액보다 약 4.4배 더 농축되었습니다. 밀봉 후 항원의 약 69%가 생리활성 형태로 캡슐화된 상태로 유지되며, 이는 열 스트레스가 밀봉 중에 상당한 손실을 유발하지만 대부분의 바이러스 항원은 손상되지 않은 상태로 유지됨을 시사합니다. 미세 입자 충전은 가장 중요한 단계 중 하나입니다.입자가 올바르게 채워지지 않으면 입자가 올바르게 밀봉되지 않을 수 있습니다. 안정성을 이해하려면 입자 코어의 부형제 및 기타 생물학적으로 관련된 물질을 포함한 추가 제형 개발이 필요합니다.

fabrication-pulsatile-polymeric-microparticles-encapsulating-rabies

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 감염된 쥐의 뇌 조직에서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색을 보여줍니다. 이 과정에는 탈파라핀화(deparaffinization) 및 알코올 처리(alcohol treatment)가 포함되며, 항원 접근성을 높이기 위한 단백질 분해 처리(proteolytic treatment)가 이어집니다. 면역조직화학 염색을 통해 붉은 침전물이 나타나 조직 단면에 광견병 항원이 존재함을 확인합니다.

광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색

이 동영상은 백신의 면역원성 당단백질 수치를 평가하기 위해 고안된 간접 효소 결합 면역흡착 분석 또는 ELISA 샌드위치 면역포획 분석을 보여줍니다. 당단백질 특이적 항체를 포함하는 분석 플레이트는 참조 및 테스트 백신을 포함하여 연속적으로 희석된 백신 샘플과 함께 배양된 후 면역 분석을 통해 테스트 백신의 당단백질 함량을 정량화합니다.

샌드위치 ELISA를 사용하여 백신의 면역원성 당단백질 함량 측정

이 비디오는 고분자 나노 입자를 사용하여 mRNA 백신 후보를 생성하는 방법을 보여줍니다. 양이온 고분자는 음전하를 띤 mRNA와 상호 작용하여 폴리플렉스를 형성합니다. 폴리플렉스의 형성은 mRNA를 안정화시켜 면역 치료 응용 분야에서 향후 mRNA 백신의 잠재적 후보가 됩니다.

백신 접종 목적을 위한 mRNA 로딩 나노입자 제형

여기, 우리는 빨리 그리고 reproducibly 생물학적 영감, 생 분해성 유일 항 원 제시 세포 (aAPC) 가변 크기, 모양, 및 T 셀 확장 비보 전 또는 vivo에서 표면 단백질 프레 젠 테이 션을 생성 하는 프로토콜을 제시 .

이방성 고분자 인공 항 원 제시 세포 CD8 + T 세포 활성화의 제조

우리는 에틸 또는 메틸 이오페노산과 함께 포로 몽구스 위약 경용 광견병 백신 미끼를 바이오마커로 제공하고 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 방법을 사용한 새로운 액체 크로마토그래피를 사용하여 미끼 섭취를 검증했습니다.

작은 인도 몽구스(헤르페스 오로 punctatus)에서이오페녹산 유사체의 분석은 구강 광견병 예방 접종 생물학적 마커로 사용하기위한 세라

용매 정리 된 장기의 궁극적 인 3D 이미징과 같은 새로운 면역 염색 호환 조직 지우기 기술은 광견병 바이러스 뇌 감염및 복잡한 세포 환경의 3D 시각화를 허용합니다. 두꺼운 항체 표지 된 뇌 조직 조각은 이미징 깊이를 높이고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 분석을 가능하게하기 위해 광학적으로 투명하게 만들어집니다.

용매 클리어 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징

여기에서 우리는 광견병 백신에 있는 면역원성 당단백질 내용을 결정하기 위하여 간접적인 ELISA 샌드위치 면역 포착을 기술합니다. 이 시험은 당단백질 트리머를 인식하는 중화 단일클론 항체(mAb-D1)를 사용한다. 그것은 생산 하는 동안 백신 힘의 일관성을 따라 생체 내 NIH 테스트에 대 한 대안.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

여기서, 우리는 조혈 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험 프로토콜을 제시한다.

포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험

여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

여기에서는 나노포어 기술을 사용하여 광견병 바이러스(RABV) 게놈을 특성화하기 위한 빠르고 비용 효율적인 워크플로우를 제시합니다. 이 워크플로우는 지역 수준에서 유전체학 정보 감시를 지원하기 위한 것으로, 광견병 통제 조치를 안내하기 위해 순환하는 RABV 계통 및 지역 계통 발생 내 배치에 대한 정보를 제공합니다.

나노포어 기술을 사용한 광견병 바이러스의 신속한 특성 분석을 위한 전체 게놈 염기서열 분석

이 프로토콜은 조직 채취에서 결과 해석에 이르기까지 pan-lyssavirus LN34 real-time reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 분석을 보여주며, 여기에는 일부 비광견병 lyssavirus 및 lagomorphs에 대한 분석 성능을 개선하기 위한 프라이머 염기서열 및 제형 업데이트가 포함됩니다. 또한 단일 웰 LN34 다중화(LN34M) 형식에 대한 분석 설정을 시연합니다.

업데이트된 멀티플렉스 LN34 Real-Time 역전사-중합효소 연쇄 반응 분석을 통한 동물 광견병의 사후 진단

학습하세요 광견병 항원을 박동성 고분자 미세입자에 캡슐화하는 방법을. PLGA 미세입자 제조 및 밀봉 기술을 활용하여 단일 주사로 다회 접종 효과를 구현하고 저소득 국가의 예방접근성을 향상시키는 백신 전달 플랫폼을 개발합니다.

광견병 항원을 캡슐화하는 박동성 고분자 미세입자의 제조

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