Name: 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 나노에멀젼 보조제 백신을 제조하고 면역 반응을 평가하는 방법을 MRSA 감염에 대해 연구합니다. 이 프로토콜은 저에너지 유화법을 사용하여 백신의 물리적 특성과 보호 효과를 체계적으로 분석하는 방법을 제공합니다.

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이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 No. 2021YFC2302603, NSFC No. 32070924 및 32000651, 충칭 자연 과학 재단 프로젝트 프로그램의 No. 2019jcyjA-msxmx0159의 지원을 받았습니다.

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저자는 이 작업에 이해 상충이 없음을 선언합니다.

박테리아 세포벽 고정 및 철 조절 표면 단백질인 IsdB는 헴철15를 얻는 과정에서 중요한 역할을 합니다. 알파 독소인 HLA는 MRSA에서 알려진 가장 효과적인 박테리아 독소 중 하나이며, 진핵 세포에 기공을 형성하고 부착 및 상피 세포를 방해할 수 있다16. 본 연구에서는 IsdB와 Hla의 항원 유전자를 기반으로 한 유전자 공학 기술로 새로운 재조합 MRSA 항원 단백질(HI)을 구성하고 발현했습니다. 이어서, 저에너지 유화법에 의해 나노에멀젼 백신을 개발하고, 이 백신의 안정성 및 유효성을 평가하였다. 예를 들어, 생체 내에서의 장기 안정성, 구조, 형상, 흡수 및 효과와 같은 일부 특성은 에멀젼 액적(7)의 크기에 의해 크게 영향을 받는다. 결과는 입자 크기가 생체 내에서 나노에멀젼의 수송과 항원 ...

메티실린 내성 황색포도 상구균 (MRSA)은 전 세계 중환자실(ICU) 병동1, 심장내과 및 화상 부서에서 감염률이 가장 높은 기회 병원체 중 하나입니다. MRSA는 높은 감염률, 사망률 및 광범위한 약물 내성을 나타내어 임상 치료에 큰 어려움을 나타냅니다2. 2017년 세계보건기구(WHO)가 발표한 항생제 내성 박테리아의 글로벌 우선순위 목록에서 MRSA는 가장 중요한 범주3에 포함되었습니다. 따라서 MRSA 감염에 대한 백신이 시급히 필요합니다.
알루미늄 보조제는 오랫동안 사용되어 왔으며 보조제 보조 메커니즘은 비교적 명확하고 안전하며 효과적이며 내약성이 우수합니다4. 알루미늄 보조제는 현재 널리 사용되는 보조제 유형입니다. 일반적으로 알루미늄염 입자에 흡착된 항원은 안정성을 향상시키고 주사 부위의 항원 흡수 능력을 향상시켜 우수한 흡수와 느린 방출을 제공할 수 있다고 믿어진다5. 현재, 알루미늄 보조제의 주요 단점은 일부 백신 후보 항원에 대해 보조제 효과가 없거나 약한 보조제 효과만을 나타낸다는 것이다6. 또한, 알루미늄 보조제는 IgE 매개 과민 반응을 유도한다5. 따라서 더 강한 면역 반응을 자극하기 위해 새로운 보조제를 개발할 필요가 있습니다.
나노에멀젼 보조제는 오일, 물, 계면활성제 및 공계면활성제로 구성된 콜로이드 분산 시스템이다7. 또한, 보조제는 열역학적으로 안정하고 등방성이며, 고속 원심분리에 의해 오토클레이브 또는 안정화될 수 있고, 온화한 제조 조건 하에서 자발적으로 형성될 수 있다. 여러 에멀젼 보조제(예: MF59, NB001-002 시리즈, AS01-04 시리즈 등)가 현재 시판 중이거나 임상 연구 단계에 있지만 입자 크기는 160nm8보다 큽니다. 따라서 나노 스케일 (1-100 nm) 의약품의 장점 (즉, 큰 비 표면적, 작은 입자 크기, 표면 효과, 높은 표면 에너지, 작은 크기 효과 및 매크로 양자 터널링 효과)을 완전히 활용할 수 없습니다. 본 프로토콜에서, 직경 크기가 1-100 nm인 나노에멀젼 기술에 기초한 신규한 보조제는 양호한 보조제 활성을 나타내는 것으로 보고되었다9. 재조합 서브유닛 백신 항원 단백질 HI (α-hemolysin 돌연변이체[Hla] 및 Fe 이온 표면 결정 인자 B[IsdB] 서브유닛 N2 활성 단편 융합 단백질)를 시험하였다. 마우스 전신 감염 모델을 사용하여 물리적 특성과 안정성을 검사하고, 근육 투여 후 특정 항체 반응을 평가하고, 백신의 보호 효과를 테스트하기 위한 일련의 절차가 수립되었습니다.

<table><tbody><tr><td>5424-소형 고속 원심분리기FA-45-24-11</td><td>Eppendorf, Germany&nbsp;</td><td></td><td></td>5424000495</tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning Incorporated, 미국</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>AFM Dimension FastScan</td><td>BRUKER, 독일&nbsp;</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>알코올 램프</td><td>Shenzhen Yibaxun Technology Co., China</td><td>YBS-AA-11408</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c 마우스&nbsp;</td><td>베이징 HFK Bioscience Co. Ltd.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCIP / NBT</td><td>푸저우 Maixin 생명 공학 개발 회사, 중국</td><td>BCIP / NBT</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 6.0 마이크로 플레이트 리더</td><td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>BL21 유능한 세포</td><td>Merck millipore, 독일</td><td>70232-3CN</td><td></td></tr><tr><td>BSA-100G</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>B2064-100G</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기 5810 R</td><td>에펜도르프, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>5811000398</tr><tr><td>Coomassie 밝은 파란색 G-250 염색 용액</td><td>MIKX, 중국</td><td>DB236</td><td></td></tr><tr><td>탈색 용액</td><td>BOSTER, 중국</td><td>AR0163-2</td><td></td></tr><tr><td>전기 가열 서 온도 경운기 HH-B11-420</td><td>상하이 Yuejin 의료 기기 공장, 중국</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>전기 영동 장치</td><td>베이징 Liuyi 악기 공장, 중국</td><td>DYCZ-25D</td><td></td></tr><tr><td>젤 이미지</td><td>Tanon, 미국</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온-세파로스 수지 GST</td><td>Mei5bio, 중국</td><td>친화 크로마토그래피 수지</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Chengdu KESHI Chemical Co., LTD, 중국</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>안녕 재조합 단백질</td><td>제 3 군사 의과 대학, 중국</td><td>110-27-0</td><td></td></tr><tr><td>HRP - 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Biodragon, 중국</td><td>BF03001</td><td></td></tr><tr><td>HRP- 염소 안티 마우스 IgG1</td><td>Biodragon, 중국</td><td>BF03002R</td><td></td></tr><tr><td>HRP - 염소 안티 마우스 IgG2a</td><td>Biodragon, 중국</td><td>BF03003R</td><td></td></tr><tr><td>HRP- 염소 안티 마우스 IgG2b</td><td>Biodragon, 중국</td><td>BF03004R</td><td></td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>Haimen Feiyue Co., LTD, 중국</td><td>YR-JZH-1UL</td><td></td></tr><tr><td>IsdB 및 Hla 클론</td><td>상하이 Jereh 생명 공학 공동, 중국</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>이소 프로필 육두구 (제약 보조제)</td> <td>SEPPIC, 프랑스</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>이소 프로필-&beta; -D-1-mercaptogalactopyranoside</td><td>fdbio, 중국</td><td>FD3278-1</td><td></td></tr><tr><td>LB 부용 배양 매체</td><td>베이징 AOBOX 생명 공학 유한 회사, 중국</td><td>02-136</td><td></td></tr><tr><td>적외선 물리 치료 램프</td><td>Guangzhou Runman Medical Equipment Co., China</td><td>7600</td><td></td></tr><tr><td>저온 냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf, Germany&nbsp;</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Malvern NANO ZS</td><td>Malvern Instruments Ltd., 영국</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>MH(A) 매체</td><td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td><td>02-051</td><td></td></tr><tr><td>MH(B) 매체</td><td>Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China</td><td>02-052</td><td></td></tr><tr><td>Micro plate washing machine 405 LSRS</td><td>Bio Tek Instruments,Inc Highland&nbsp; Park, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument</td><td>BeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, China</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>MMC packing</td><td>TOSOH (SHANGHAI) CO., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0022818 MRSA252</td><td>USA, ATCC</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 자외선 분광 광도계</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>New FlashTM Protein any KD PAGE 단백질 전기 영동 젤 키트</td><td>DAKEWE, 중국</td><td>8012011</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>biosharp, 중국</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>PCR, 증폭기</td><td>열 순환기, 미국</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>pGEX 타겟 유전자 재조합 플라스미드</td><td>상하이 Jereh 생명 공학 공동, 중국</td><td>B3528G</td><td></td></tr><tr><td>포스 포 텅스텐 산</td><td>G-CLONE, 중국</td><td>CS1231-25g</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>에펜도르프, 독일&nbsp;</td><td></td><td></td>3120000844</tr><tr><td>폴리옥시에틸화 피마자유(약제 보조제)</td><td>알라딘, 중국</td><td>K400327-1kg</td><td></td></tr><tr><td>1차 항체</td><td>실험실 홈메이드: 양성 혈청 null을 가진 면역된 마우스에서</td><td></td> 자세한 내용은 <td>참조 11 참조 참조</td></tr> 프로필<tr><td>렌 글리콜(제약 보조제)</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>P4347-500ML</td><td></td></tr><tr><td>단백질 마커</td><td>Thermo Scientufuc, 미국</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 전사막</td><td>Invitrogen, 미국</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>JEOL, 일본</td><td>JSM-IT800</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 펜토바르비탈</td><td>Merck, 독일</td><td>Tc-P8411</td><td></td></tr><tr><td>Talos L120C TEM</td><td>Thermo Fisher, 미국</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>TMB 컬러 솔루션</td><td>TIAN GEN, 중국</td><td>PA107-01</td><td></td></tr><tr><td>거북이 키트</td><td>Xiamen Bioendo Technology Co., LTD</td><td>ES80545</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Macklin, China</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

메티실린 내성 황색포도상구균 (mrsa) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가

Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection

나노 에멀젼 보조 백신은 작은 입자 크기, 높은 열 안정성 및 유효한 면역 반응을 유도하는 능력으로 인해 광범위한 관심을 끌었습니다. 그러나 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응을 평가하기 위한 일련의 포괄적인 프로토콜을 수립하는 것이 중요합니다. 따라서 이 기사에서는 백신의 물리화학적 특성(투과전자현미경[TEM], 원자력현미경[AFM] 및 동적 광산란[DLS]), 백신 항원 및 시스템의 안정성(고속 원심분리기 테스트, 열역학적 안정성 테스트, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯) 및 특정 면역 반응(IgG1, IgG2a 및 IgG2b). 이 접근법을 사용하여 연구자들은 치명적인 MRSA252 마우스 모델에서 새로운 나노 에멀젼 보조 백신의 보호 효과를 정확하게 평가할 수 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 효과적인 보조제 잠재력 측면에서 가장 유망한 나노에멀젼 백신 보조제를 확인할 수 있습니다. 또한 이 방법은 향후 개발을 위해 새로운 백신을 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

나노에멀젼 아쥬반트 백신을 제조하기 위한 프로토콜과 이 백신의 시험관내 및 생체내 시험이 평가되었다. TEM, AFM 및 DLS를 사용하여 이 샘플 표면의 제타 전위 및 입자 크기의 중요한 특성을 확인했습니다(그림 1). SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅은 침전물 및 상청액 내의 항원의 양이 원심분리 후에도 유의하게 분해되지 않았음을 보여주었으며, 이는 백신이 구조적으로 손상되지 않고 특이적이며 면역원성임을 나타냅니다(그림 2). 나노에멀젼 보조제 백신은 총 IgG, IgG1 및 IgG 2a 항체 역가를 유의하게 증가시켰다. 백신의 면역원성은 상당히 개선되었다(도 3A-C). 항원 그룹의 450 nm에서 혈청 IgG2b OD 값이 가장 높았다 (1:500 PBS에서 희석) (<s...

본 프로토콜은 새로운 나노에멀젼 보조제 백신의 물리적 특성, 면역 반응 및 생체 내 보호 효과를 준비하고 평가합니다.

메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가

Nanoemulsion adjuvant vaccines have attracted extensive attention because of their small particle size, high thermal stability, and ability to induce ...

입증된 프로토콜은 직접적이고 효과적인 실험적 접근 방식과 새로운 바이러스 보조제의 면역 반응 효과에 대한 세부 단계를 강조했습니다. 이 프로토콜은 보조 백신에 대한 기본적인 면역 평가 방법을 연구에 제공할 뿐만 아니라 질량 안정성을 결정할 수도 있습니다. 먼저, MRSA HI 항원 단백질의 10 밀리리터 작업 용액을 취하고, 여기에 이소프로필 미리스테이트, 폴리옥시에틸렌 피마자유, 프로필렌 글리콜 등 3가지 부형제를 순차적으로 첨가하고, 1 대 6 대 3의 질량비를 유지한다.혼합물을 잘 저어 준 다음 멸균 된 순수한 물을 서서히 첨가하여 10 밀리리터의 시스템 부피에 도달하십시오. 저에너지 유화법으로 나노에멀젼 백신을 제조하기 위해서는 분당 500회전, 섭씨 25도에서 약 20분 동안 교반한다. 이어서, 밀리리터 당 1 밀리그램의 단백질을 함유하는 나노 에멀젼 백신을 투명한 액체로서 수득한다.효소 결합 면역흡착 분석 또는 ELISA 플레이트의 항원 코팅을 위해, HI 단백질 항원을 코팅 용액으로 밀리리터당 10마이크로그램으로 희석하고, 웰당 희석된 항원 100마이크로리터를 ELISA 플레이트에 첨가한다. 접시를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 인큐베이션 후, 플레이트를 웰 당 300 마이크로리터의 PBST로 세척한다.웰 당 300 마이크로리터의 밀봉 용액으로 웰을 섭씨 37도에서 2시간 동안 밀봉한 후, 각 실험군으로부터 3 마이크로리터의 마우스 혈청을 297 마이크로리터의 PBST를 첨가하여 100배 희석하고, 희석된 혈청을 와동시킨다. 각 혈청 샘플에 대해 코팅된 ELISA 플레이트에 웰당 100마이크로리터의 희석된 혈청을 추가합니다. 유사하게, 396 마이크로리터의 PBST에 4 마이크로리터의 양성 또는 음성 대조군 혈청을 첨가하여 PBST로 양성 및 음성 대조군 혈청을 100배 희석한 다음, 와류 혼합한다.이중 비율 희석을 수행하려면 이전에 희석된 실험 혈청 200마이크로리터를 코팅된 ELISA 플레이트의 첫 번째 행에 추가한 다음 1열과 12행의 웰을 제외한 모든 웰에 PBST 100마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 피펫 건을 100 마이크로리터로 조정하고 100 마이크로리터의 혈청을 첫 번째 행에서 PBST가 포함된 두 번째 행으로 옮깁니다. 피펫 건을 사용하여 두 번째 줄의 내용물을 10 번 혼합하십시오.유사하게, 1행까지 혈청을 2회 연속적으로 희석하여 11행을 수행한다. 완료되면 100열에서

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 쥐 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하기 위해 항원 보조 에멀젼을 생성하는 효율적인 균질화 기술을 보여줍니다. 에멀젼은 물 상태에 자가항원인 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)을 함유하고 있으며, 불활성화된 병원성 박테리아로 구성된 연속적인 오일 상태로 둘러싸여 있습니다. 에멀젼은 장기적인 면역 반응을 위해 항원의 지속적인 방출을 보장합니다.

자가면역 뇌척수염을 유발하기 위한 항원 보조 에멀젼 제조

이 비디오는 사전 면역 마우스에서 새로운 나노 에멀젼 보조 백신에 대한 항체 면역 반응을 평가하는 방법을 보여줍니다. 면역은 IgG 항체 역가를 측정하여 확인된 항체 반응을 향상시킵니다.

마우스 혈청에서 테스트 백신에 대한 면역글로불린 G 수치 측정

이 비디오는 나노 에멀젼 종양 백신의 생산을 보여줍니다. 합성 펩타이드와 보조제를 운반하는 안정적인 오일 저장소 저장소는 저에너지 나노에멀젼으로 생산되어 종양 면역 요법에 대한 상당한 가능성을 제공합니다.

나노에멀젼 보조제 백신의 준비

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.

체외 나노에멀젼 백신 보조제인 오피오포고닌 D의 세포 활성 평가

여기에서는 비강 자가 조립 나노에멀젼 종양 백신의 시험 관 내 및 생체 내 비강 내 진단 및 평가를 위한 자세한 방법을 제시 합니다.

비강 자기조립 나노에멀젼 종양백신의 제조, 특성, 독성 및 효능 평가 In Vitro 및 In Vivo

다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.

실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법

시험관 내 기술을 사용하여 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성을 평가하는 네 가지 방법을 소개합니다. 이러한 방법은 다양한 나노 입자 및 나노 구조 표면과 광범위한 미생물 종의 상호 작용을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

시험관 내에서 나노 입자 및 나노 구조 표면의 항균 활성 평가

이 프로토콜에서는 항원 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로 사용할 수 있는 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산(RA)을 개발했습니다. FDA 승인 RA를 나노에멀젼에 첨가함으로써, 나노에멀젼의 근육 주사 후 질과 소장에서 항원 특이적 sIgA를 촉진시켰다.

OVA 특이적 전신 및 점막 반응을 촉진하기 위한 보조제로서의 양이온성 나노에멀젼 캡슐화 레티노산

드립 흐름 반응기로 개방형 시스템 흐름 biofilms을 활용하여 디스크 원자로 회전을위한 프로토콜이 상세하게 제공됩니다.

에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 Biofilm 분석

배우세요 나노에멀젼 보조제 백신을 제조하고 면역 반응을 평가하는 방법을 MRSA 감염에 대해 연구합니다. 이 프로토콜은 저에너지 유화법을 사용하여 백신의 물리적 특성과 보호 효과를 체계적으로 분석하는 방법을 제공합니다.

메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염에 대한 나노에멀젼 보조제 백신의 면역 반응 평가

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