Name: Arabidopsis 꽃가루관 수용 및 이중 수정의 실시간 이미징 semi-In vitro cum septum 방법을 사용한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 학습하세요 Arabidopsis thaliana에서 꽃가루관 수용과 씨방 수용성을 분석하는 개선된 semi-in vitro cum septum 방법을 사용하여. 이 기법은 배우체 상호작용을 고효율로 관찰하고 수정 과정을 실시간으로 모니터링합니다.

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pFG:roGFP2-ORP1-NLS 구조를 기증해 주신 Sara Simonini와 Stefano Bencivenga, 현미경에 대한 조언을 해주신 Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter 및 Celia Baroux에게 감사드립니다. Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima 및 SIV 겸 중격에 대한 프로토콜에 관심을 보인 2022년 성 식물 생식에 관한 국제 회의의 다른 모든 사람들의 조언을 진심으로 감사드립니다. 이 연구는 취리히 대학 (University of Zurich)과 스위스 국립 과학 재단 (Swiss National Science Foundation)의 보조금을 지원했습니다.

알림: 이 프로토콜에 사용된 재료 및 장비 목록은 재료 표를 참조하십시오.
1. 이미징 실험 설계 시 고려 사항
<ol><li>관찰하고자 하는 원하는 현상을 포착하는 데 필요한 이미징 지속 시간과 샘플링 주파수를 미리 결정합니다. 예를 들어, Nyquist의 샘플링 정리에 따르면 샘플링 주파수는 입력 샘플의 가장 높은 주파수의 두 배보다 커야 합니다. 따라서 시너지 [Ca2+]cyt 진동을 정확하게 포착하려면 약 10초마다 이미징을 수행하되 꽃가루 튜브 배출 시 정자 세포의 속도를 측정하려면 1초10 미만의 시간 분해능을 보장해야 합니다.</li>
	<li>배경 자가형광을 넘어 충분히 밝은 관심 세포에 대한 형광 마커를 선택합니다. 바이오센서를 사용하려면 일반적으로 더 민감하고 노출 시간이 덜 필요하기 때문에 세포 기능을 방해하지 않는 가장 밝은 선을 선택하십시오.</li>
	<li>원하는 현상을 포착하는 데 어떤 유형의 형광 현미경 및 배율이 가장 적합한지 고려하십시오. 광시야 현미경 및 저배율 대물렌즈를 사용하여 더 넓은 피사계 심도에서 빛을 캡처하고, 시간이 지나도 초점을 유지하고, 전체 난자와 같은 더 큰 물체를 이미지화하거나, 색채 이동 아티팩트에 민감한 비율계량 센서를 사용할 수 있습니다. 세포 및 세포 내 물체의 해상도를 높이기 위해 고배율 대물렌즈와 함께 CLSM 또는 2PEM을 사용하지만 시간이 지남에 따라 초점을 유지하는 데 어려움이 있습니다.</li>
	<li>실험당 이미지화할 샘플 수를 추정합니다. 예를 들어, 자동 초점 및 다단계 획득 기능에 필요한 시간 때문에 3개의 격막을 이미징하고 실험당 최대 40개의 수정 이벤트를 이미징하는 데 최소 샘플링 시간이 ~30초인 10x 대물렌즈를 사용합니다.</li>
</ol>2. 꽃가루 발아 배지 준비
<ol><li>-20°C에서 저장되는 각 미량 영양소의 1 M 분취액을 사용하여 액체 꽃가루 발아 배지(5mMCaCl2, 1mM MgSO4, 5mM KCl, 0.01% [w/v] H3BO3 및 10% [w/v] 수크로오스)를 준비합니다. 0.1M KOH로 pH를 7.5로 조정합니다. 배지를 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다. 알림: pH는 시간이 지남에 따라 떨어질 수 있습니다.</li>
	<li>10mL 비커에 2.5mL의 액체 배지를 넣고 덩어리를 방지하기 위해 빠르게 회전하는 교반 막대로 32mg의 초저융점 아가로스(~1.3%)를 천천히 추가합니다.</li>
	<li>65°C의 핫플레이트 상에서 아가로스를 용융시키고, 비커를 너트화하여 측면으로부터 임의의 응결을 수집한다.</li>
	<li>배지 130 μL를 35 mm 유리 바닥 접시의 14 mm 웰 내로 피펫팅하고, 배지가 웰을 덮을 때까지 접시를 회전시킨다.</li>
	<li>접시 중앙에서 피펫으로 총 40 μL를 흡입하고 총 부피 90 μL를 남깁니다. 알림: 더 낮은 총 부피를 달성하기 위해 더 많은 매체를 우물에서 흡인할 수 있습니다. 이는 작동 거리가 낮은 고배율 대물렌즈에 필요할 수 있습니다. 그러나 한천 패드가 얇을수록 더 빨리 건조됩니다.</li>
	<li>균일한 냉각을 보장하기 위해 습도 챔버의 알루미늄 블록에서 접시를 식히십시오. 다음날 아침 사용할 수 있도록 플레이트를 4°C에서 밤새 보관하십시오.</li>
</ol>3. 중격 기증자, 낙인 기증자 및 꽃가루 기증자의 꽃 스테이징
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig01.jpg"> 그림 1: 중격 기증자, 낙인 기증자 및 꽃가루 기증자의 꽃 스테이징. (A) 꽃차례 내 애기장대 꽃(Ler-0)의 단계. 꽃잎이 막 열리기 직전의 꽃잎과 노랗게 변하는 꽃밥이 있는 12B 단계의 새싹은 꽃받침, 꽃잎, 수술을 모두 제거하여 거세해야 합니다. 암술(암컷 배우체 제작자가 있음)은 24시간 후에 중격 기증자로 사용할 수 있습니다. (B) 꽃차례 내 애기장대 꽃(Col-0)의 단계. 꽃잎에서 거의 나오지 않는 노란색 음란한 꽃밥과 암술머리가 있는 12B 단계의 새싹은 꽃받침, 꽃잎, 수술을 모두 제거하여 거세해야 합니다. 그런 다음 암술은 24시간 후에 낙인 기증자로 사용할 수 있으며, 이때 열려 있고 꽃가루를 흘리는 꽃(수컷 배우체 마커가 있음)에 의해 수분되어야 합니다. 수분 된 암술머리는 수분 후 1 시간 이내에 해부해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol><li>이미징 전날 아침, 중격 기증자 및 낙인 기증자로 사용할 애기장 대 식물을 선택하십시오. 그들이 건강하고 최근에 규사를 생산하기 시작했는지 확인하십시오. 참고: Landsberg erecta (Ler-0)는 격막이 튼튼하고 난자 사이에 작은 마디가 있기 때문에 중격 기증자로 사용하기에 좋은 접근입니다. 컬럼비아(Col-0)는 꽃가루 튜브 성장에 도움이 되는 것으로 보이기 때문에 낙인 기증자로 사용하기에 좋은 접근입니다.</li>
	<li>수술, 꽃받침 및 꽃잎을 제거하여 최소 3개의 12B 단계 중격 기증자 꽃과 12개의 단계 12B 낙인 기증자 꽃을 거세합니다(그림 1A, B). 같은 꽃차례에서 오래된 꽃도 제거하면 잠재적으로 거세된 꽃에 수분을 공급할 수 있습니다.</li>
	<li>24시간 후인 아침에 꽃가루를 쉽게 흘리는 꽃가루 기증자 꽃(예: 꽃가루 튜브 또는 정자 세포 마커가 있음)으로 낙인 기증자에게 수분을 공급합니다. 암술머리가 꽃가루로 거의 완전히 덮일 때 수분이 완료됩니다(그림 1B).</li>
</ol>4. 중격 해부
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig02.jpg"> 그림 2: 중격 및 암술머리 해부에 대한 빠른 가이드. (A) 중격 해부 단계. 인슐린 주사기 바늘로 양면 테이프에 암술을 고정하고 스타일-난소 접합부와 난소-척추경 접합부를 절단한 다음 양쪽 심피의 중격을 따라 얕게 절단합니다(1단계). 심피벽을 테이프에 다시 떼어냅니다(2단계). 상단 중격 아래에서 replum을 자릅니다 (3 단계). 스타일에서 중격을 자르고 작은 꽃자루에서 집게를 사용하여 제거합니다 (4 단계). 중격을 한천 배지에 놓고 집게로 부드럽게 삽입합니다. (B) 낙인 해부 단계. 암술 (수분 &lt;1 시간 전)을 양면 테이프에 고정하고 면도날로 스타일-난소 접합부에서 자릅니다 (6 단계). 중격 옆에 인슐린 바늘이 있는 한천 배지에 암술머리를 놓고 거리를 약 250μm로 조정합니다(7-8단계). 스타일의 마이크로파일과 베이스 주위에 반액체 풀이 형성되는지 확인합니다(9단계). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol><li>수분 후 30 분 후에 척추 경에서 건강하고 성숙한 중격 기증자 암술을 모아 유리 슬라이드에 장착 된 신선한 양면 접착 테이프에 붙이고 테이프 가장자리 바로 옆에 낙인이 붙어 있습니다. 알림: 암술이 접착 테이프에 붙어 있는 해부 시간을 가능한 한 짧게 제한하십시오. 해부는 높은 습도에서 이루어져야하며, 이는 슬라이드 옆에 가습기를 놓음으로써 달성 할 수 있습니다.</li>
	<li>거세에서 남은 꽃받침, 꽃잎 및 수술 파편을 제거하기 전에 새 인슐린 주사기 바늘의 뒷면을 사용하여 척추경을 부드럽게 누르고 난소를 따라 암술을 테이프에 단단히 고정합니다.</li>
	<li>입체경 아래에서 인슐린 주사기 바늘을 사용하여 스타일-난소 접합부와 난소-척추경 접합부에서 심피당 두 번 절단한 다음 각 심피의 중격을 따라 얕게 절단합니다(그림 2, 1단계). 참고: 중격을 따라 너무 깊게 자르면 funiculus에서 난자가 절단됩니다.</li>
	<li>테이프에 난소 벽을 조심스럽게 떼어내고(그림 2, 2단계) 두 격막 사이에 바늘을 부드럽게 밀어 넣어 난자를 방해하지 않고 암술의 전체 길이를 따라 자두를 자릅니다(그림 2, 3단계). 참고: 스타일에서 척추경 방향으로 replum을 잘라서 상단 중격의 난자가 가능한 한 적게 방해받도록 합니다.</li>
	<li>스타일과 척추경과의 접합부 모두에서 상단 중격을 부드럽게 자르고 척추경 쪽에서 집게로 중격을 제거합니다(그림 2, 4단계). 알림: 중격이 평평하게 유지되고 구부러지지 않도록 이 절단을 똑바르고 부드럽게 유지하십시오.</li>
	<li>난자의 미세 파일이 위를 향하고 동일한 초점면에 있도록 중격을 매체에 가능한 한 평평하게 놓습니다. 난자가 배지에 약간 박힐 때까지 중격을 배지에 부드럽게 누릅니다(그림 2, 5단계). 참고: 난자의 미세 파일이 꽃가루 관에 접근할 수 있도록 중격을 배치하는 것이 중요합니다(접근할 수 없는 난자는 바늘로 부드럽게 재배열할 수 있음). 매립 후 중격 주위에 작은 액체 웅덩이가 형성되어야 합니다.</li>
	<li>최대 2개의 암술에 대해 4.1-4.6단계를 반복하여 격막을 끝에서 끝까지 배치합니다.</li>
</ol>5. 낙인 해부
<ol><li>수분된 암술머리 기증자 암술을 유리 슬라이드에 장착된 신선한 양면 접착 테이프에 올려 난소 스타일 접합부가 테이프 가장자리에서 떨어지도록 합니다(그림 2, 6단계).</li>
	<li>새 면도날을 사용하여 스타일을 똑바로 자르고 들어 올려 면도날에 오명이 붙지 않도록 합니다(그림 2, 6단계). 알림: 가장 깨끗한 절단을 위해 테이프 가장자리를 자릅니다.</li>
	<li>인슐린 주사기 바늘로 칼날에서 암술머리를 제거하고 난자에서 약 250-300μm 떨어진 곳에 평평하게 놓습니다(그림 2, 7-8단계). 참고: 스타일은 옆으로 수평으로 향해야 합니다. 그렇지 않으면 대부분의 꽃가루 튜브가 중격 아래에서 자랄 것입니다. 스타일 입구에 작은 액체 웅덩이가 1분 동안 매체에 누워 있으면 나타나야 합니다. 꽃가루 튜브가 스타일에서 부드럽게 빠져 나가기 때문에 이것은 좋은 징조입니다.</li>
	<li>최대 12개의 암술머리에 대해 5.1-5.3단계를 반복하여 각 중격의 양쪽에 2개를 배치합니다. 난자의 미세 파일 주위에 형성되는 작은 액체 풀을 찾으십시오. 이것은 배낭에 대한 꽃가루 관의 접근성과 표적화를 돕습니다(그림 2, 9단계). 참고: 배지와 난자가 마르는 것을 방지하기 위해 접시를 여는 시간을 제한하십시오.</li>
</ol>6. 이미징
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65156/65156fig04.jpg"> 그림 3: SIV 겸 중격 이미징 방식. (A) 입체경을 통해 볼 때 12개의 수분된 암술머리와 3개의 격막이 있는 전체 SIV 겸 중격 설정. (B) 10x 대물렌즈를 사용하여 배양 후 5시간 동안 A에서 볼 수 있는 전체 SIV 겸 중격 설정의 병합된 이미지, 다단계 획득을 위해 표시된 5개의 개요 영역(각각 ~1mm). 녹색 상자는 시너지 효과에서 폭발적인 폭발을 겪는 꽃가루 튜브를 받은 난자를 보여줍니다. (C) 다른 시점에서 개요 영역 2를 자세히 봅니다. 현미경의 습도 챔버에서 배양한 후 약 3시간 후에 꽃가루 튜브가 마이크로파일 근처에 도착해야 하며 6시간 동안 이미징하면 대부분의 난자가 꽃가루 튜브(녹색 사각형)를 제대로 받아야 합니다. 그런 다음 이 난자는 폭발적인 꽃가루 튜브 파열(별표)을 겪습니다. 스케일 바 = (A) 5 mm, (B, C) 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65156/65156fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol><li>해부가 완료되고 접시를 이미징할 준비가 되면 92% 상대 습도 및 21°C로 유지되는 현미경의 습도 챔버에서 배양합니다. 알림: 현미경에 사용할 수 있는 습도 챔버가 없는 경우 뚜껑과 접시의 바깥쪽 가장자리를 소량의 물로 감싸면 접시의 높은 습도를 유지하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>낮은 조도의 명시야에서 샘플에 초점을 맞춘 다음 형광등으로 전환하여 스테이지 오버view에서 이미지화할 샘플의 영역을 표시합니다. 참고: 10x 배율에서 총 3개의 격막에 대해 약 5개의 영역을 표시할 수 있습니다(그림 3). 광독성을 최소화하기 위해 개요 영역을 표시하는 데 사용되는 시간을 제한하십시오.amp형광등에 의한 샘플.</li>
	<li>각 개요 영역의 시작 부분에 자동 초점 기능이 있는 다단계 획득 방식을 사용하여 이미징을 시작합니다. 샘플을 배양한 후 ~1시간 후에 꽃가루 튜브가 스타일에서 나오기 때문에 수집을 2시간 지연시키거나 꽃가루 튜브가 마이크로파일에 도달할 때까지 지연시킵니다. 자동 초점이 100μm 범위(7μm 큰 단계 및 1μm 미세 단계)로 설정되어 있는지 확인하여 시간이 지남에 따라 격막이 약간 움직이고 가라앉을 때 난자에 초점을 유지합니다.</li>
	<li>샘플 배양을 시작한 후 ~9시간 후에 이미지 획득을 중지하면 이때까지 대부분의 난자가 꽃가루 튜브를 끌어당기고 받았어야 합니다. 참고: 적은 수의 난자가 꽃가루 관을 끌어들이는 경우 입체경으로 접시를 주의 깊게 관찰하면 다음에 난자 또는 스타일 방향을 개선할 수 있는 방법을 결정하는 데 유용합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Huck, N., Moore, J. M., Federer, M., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+mutant+feronia+disrupts+the+female+gametophytic+control+of+pollen+tube+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis mutant feronia disrupts the female gametophytic control of pollen tube reception.</a> Development. 130 (10), 2149-2159 (2003).</li>
<li>Rotman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+control+of+male+gamete+delivery+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Female control of male gamete delivery during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 13 (5), 432-436 (2003).</li>
<li>Palanivelu, R., Preuss, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+short-range+ovule+signals+attract+or+repel+Arabidopsis+thaliana+pollen+tubes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct short-range ovule signals attract or repel Arabidopsis thaliana pollen tubes in vitro.</a> BMC Plant Biology. 6, 7(2006).</li>
<li>Susaki, D., Maruyama, D., Yelagandula, R., Berger, F., Kawashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+F-actin+dynamics+during+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of F-actin dynamics during fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Methods in Molecular Biology. 1669, 47-54 (2017).</li>
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<li>Hamamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+of+two+sperm+cells+during+double+fertilization+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana.</a> Current Biology. 21 (6), 497-502 (2011).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 보고합니다.

이 원고는 애기장대에서 꽃가루 관 수용 및 이중 수정의 이미징을 위한 효율적인 프로토콜을 소개합니다. 개선된 방법인 SIV cum septum은 이미징 세션당 관찰할 수 있는 성공적인 꽃가루관 수용 이벤트의 백분율과 총 수를 크게 증가시킵니다. 여기에 표시된 대표적인 결과는 41개의 성공적인 꽃가루 튜브 수신 이벤트와 수신 결함(~80% 효율)을 나타내는 10개의 난자가 있는 이미징 세션을 보여줍니다. 이는 원래 SIV 절제 난자 방법을 사용하여 총 8개의 이미징 세션에서 캡처된 성공적인 꽃가루 튜브 수용 이벤트 수의 두 배 이상입니다(비디오 1). 총 8개의 격막에 대해 5개의 기술 복제에서 SIV 겸 중격 방법을 사용하여 8개의 기술 복제가 있는 SIV 절제 중격 방법을 사용한 평균 28%와 비교하여 평균 79%의 꽃가루 튜브 수용 효율을 달성했습니다(그림 4).
<p class="jov...

유성 생식 유기체에서 유전적으로 독특한 자손의 생성은 남성과 여성 배우자의 성공적인 융합에 달려 있습니다. 꽃 피는 식물에서 이중 수정 동안 두 개의 수컷 배우자(정자 세포)와 두 개의 암컷 배우자(난자 세포 및 중앙 세포)의 상호 작용은 꽃가루관(수컷 배우체)에서 정자 방출에 달려 있습니다. 꽃가루 관 수용이라고 하는 이 과정은 배낭(암컷 배우체) 내에 존재하는 시너지 세포에 의해 크게 제어됩니다.1,2. 꽃가루관 수용이 꽃 속 깊숙한 곳에서 일어나기 때문에, 이 과정의 생세포 이미징을 가능하게 하는 방법인 SIV(semi-in vitro (semi-in vitro) 꽃가루관 수용)가 확립되었다3. 이 방법을 사용하면 절제된 애기장대 난자를 반액체 꽃가루 발아 배지에 놓고 스타일 전달관접합부 3,4에서 절단된 암술의 암술머리와 스타일을 통해 자라는 꽃가루 관을 표적으로 합니다. 이 기술의 개발 이후, 상세한 관찰은 꽃가루 튜브 안내, 수용 및 수정을 둘러싼 몇 가지 발견으로 이어졌습니다. 그 중에서도 이러한 발견에는 암술머리3를 통한 성장에 의한 꽃가루관 표적화 능력의 획득, 꽃가루관 도착 시 시너지드에서 세포내 칼슘 진동의시작5,6,7,8,9, 꽃가루관 파열 시 정자 세포 방출 및 수정의 역학 등이 포함된다10 . 그럼에도 불구하고 이 기술은 난자 절제에 의존하기 때문에 수정 관찰 횟수가 제한되고 꽃가루 관 수용이 종종 비정상적이어서 꽃가루 관 파열이 실패합니다(비디오 1 및 보충 파일 1). 따라서 꽃가루 관 수용 및 수정에 대한 고처리량 분석을 가능하게 하는 보다 효율적인 접근 방식이 필요합니다.
이 프로토콜을 개발하면서 가장 "시험관 내"에서 가장 "생체 내" 방법에 이르기까지 꽃가루 관 수용을 분석하기 위한 몇 가지 새로운 접근 방식을 테스트했으며 전체 중격의 절제를 기반으로 하는 효율적인 기술이 정착되어 하루에 최대 40회의 수정 관찰이 가능합니다. 여기에서는 꽃 스테이징, 해부, 중간 준비 및 이미징 설정을 포함하여 기술의 뉘앙스와 중요한 점을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에 따라 꽃가루관 안내, 꽃가루관 수용 및 이중 수정에 중점을 둔 연구가 촉진되어야 합니다. 이 방법이 허용하는 더 높은 샘플 크기는 라이브 이미징 실험에서 도출된 결론의 과학적 건전성을 강화할 것으로 예상됩니다. 이 기술의 잠재적 응용 분야에는 유전적으로 암호화된 바이오센서를 사용하여 배우체 상호작용 동안 세포질 칼슘 농도([Ca 2+]cyt), pH 또는 H2O 2의 분자 및 생리학적 변화를 관찰하는 것이포함되지만 이에 국한되지는 않습니다. 또한, 수용 시너지 효과의 퇴화, 정자 세포 이동 또는 카르요가미와 같은 세포학적 변화는 이 개선된 방법을 사용하여 보다 쉽게 관찰할 수 있습니다. 마지막으로, 광시야 현미경으로 다양한 수정 단계의 시기를 모니터링한 다음 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 또는 이광자 여기 현미경(2PEM)을 사용하여 보다 자세한 분석을 수행하여 고해상도 및 3D 재구성을 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1mm 유리 슬라이드&nbsp;</td><td>에프레디아&nbsp;</td><td></td><td></td>16211551</tr><tr><td>35mm 유리 바닥 접시 (14mm 우물)</td><td>Mattek&nbsp;</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘&nbsp;</td><td>로스&nbsp;</td><td>CN93.1</td><td></td></tr><tr><td>컬럼비아(Col-0)&nbsp;</td><td>노팅엄 애기장대 스톡 센터(NASC)</td><td></td> <td>낙인 기증자</td></tr><tr><td>해부 범위&nbsp;</td><td>올림푸스&nbsp;</td><td>SZX2-ILLT</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 바늘 (0.3 G)</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Landsberg erecta (Ler-0)&nbsp;</td><td>노팅엄 애기장대 주식 센터 (NASC)</td><td></td> <td>셉텀 기증자</td></tr><tr><td>마그네슘 황산염</td><td>Merck</td><td>5886</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Beldura</td><td>7026797</td><td></td></tr><tr><td>Scotch 양면 테이프&nbsp;</td><td>스카치</td><td>768720</td><td>덜 두껍고 암술 해부에 좋은</td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>ITW 시약</td><td>A2211,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tesa 양면 테이프&nbsp;</td><td>Tesa</td><td>05681-00018</td><td>매우 끈적거리고 중격 박리에 좋습니다</td></tr>. <tr><td>초저겔화 온도 아가로스</td><td>FMC SeaPrep</td><td>50302</td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis 꽃가루관 수용 및 이중 수정의 실시간 이미징 semi-in vitro cum septum 방법을 사용한

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

꽃 피는 식물에서 암술 내 꽃가루관(수컷 배우체)의 성장과 안내, 암컷 배우체에 의한 꽃가루관의 수용은 이중 수정과 후속 종자 발달에 필수적입니다. 꽃가루 관을 수용하는 동안 수컷과 암컷 배우체 사이의 상호 작용은 꽃가루 관 파열과 두 개의 정자 세포의 방출로 절정에 달하여 이중 수정을 일으킵니다. 꽃가루 관의 성장과 이중 수정은 꽃의 조직 내에 깊숙이 숨겨져 있기 때문에 이 과정은 생체 내에서 관찰하기 어렵습니다.
모델 식물 Arabidopsis thaliana에서 수정의 생세포 이미징을 위한 반시험관(SIV) 방법이 여러 조사에서 개발 및 구현되었습니다. 이러한 연구는 꽃 피는 식물에서 수정 과정이 어떻게 발생하는지, 그리고 수컷과 암컷 배우체의 상호 작용 중에 어떤 세포 및 분자 변화가 발생하는지에 대한 근본적인 특징을 밝히는 데 도움이 되었습니다. 그러나 이러한 생세포 이미징 실험에는 개별 난자의 절제가 포함되기 때문에 이미징 세션당 관찰 횟수가 적기 때문에 이 접근 방식은 지루하고 시간이 많이 걸립니다. 다른 기술적 어려움 중에서도 꽃가루 관이 시험관 내에서 난자를 수정하지 못하는 경우가 종종 보고되어 이러한 분석이 심각하게 혼란스러워집니다.
여기에서는 자동화되고 높은 처리량 방식으로 꽃가루 튜브 수용 및 수정을 이미징하기 위한 자세한 비디오 프로토콜이 제공되어 이미징 세션당 꽃가루 튜브 수신 및 파열을 최대 40개까지 관찰할 수 있습니다. 유전적으로 암호화된 바이오센서 및 마커 라인의 사용과 함께 이 방법을 사용하면 시간 투자를 줄이면서 큰 크기의 샘플을 생성할 수 있습니다. 꽃 스테이징, 해부, 배지 준비 및 이미징을 포함한 기술의 뉘앙스와 중요한 점은 꽃가루 튜브 안내, 수용 및 이중 수정의 역학에 대한 향후 연구를 용이하게 하기 위해 비디오 형식으로 명확하게 자세히 설명되어 있습니다.

애기장대에서 꽃가루관 파열과 관련하여 수용성 시너지드에서 핵 변성의 시기를 평가하고 왼쪽 또는 오른쪽 시너지드가 수용성 시너지드가 될 운명인지 관찰하기 위해, 여기에 설명된 SIV cum septum 방법은 시너지 세포질 마커(pFG: roGFP2-ORP1-NLS, pMYB98:roGFP2-ORP1)를 중격 기증자로, 수컷 배우체 마커(pLAT52:R-GECO)를 꽃가루 기증자로 사용합니다. 격막과 수분된 암술머리는 프로토콜의 섹션 4-5에 따라 배합 후 24시간 후에 해부하고 전날 준비된 배지로 유리 바닥 접시에 놓았습니다. 각 접시를 현미경의 습도 챔버에 넣고 5개의 개요 영역이 있는 10x 대물 렌즈(개구수 0.4)를 사용하여 다단계 실험을 수행했습니다(그림 3). 각 영역의 이미지는 R-GECO(25ms)의 경우 채널 (1) 560/640, roGFP2-ORP1(60ms)의 경우 채널 (2) 488/520...

여기에서 우리는 난자의 수용성을 증가시키는 Arabidopsis thaliana에서 꽃가루 튜브 안내 및 수신을 관찰하기 위한 SIV(semi-in vitro) 방법의 개선을 설명합니다. 고처리량 SIV 겸 중격 방법은 배우자 마커 라인 및 유전적으로 인코딩된 바이오센서와 결합하여 수정의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

Arabidopsis 꽃가루관 수용 및 이중 수정의 실시간 이미징 semi-In vitro cum septum 방법을 사용한

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

이 방법은 영상 세션당 높은 샘플 크기 수와 높은 효율성으로 배우식물 상호작용을 관찰할 수 있도록 함으로써 애기장대의 유성 생식에 대한 연구를 용이하게 할 것입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 중격에 난자를 유지함으로써 난자의 양과 수용성이 이전 방법에 비해 크게 증가한다는 것입니다. 해부 기술은 처음에는 어려울 수 있으며 꾸준한 손이 필요합니다.따라서 실험을 시작하기 전에 거세된 암술에 대해 몇 번 연습하는 것이 좋습니다. 본문에 설명 된대로 꽃가루 발아 배지를 준비하는 것으로 시작하십시오. 한천이 완전히 용융된 후, 130 마이크로리터의 배지를 35 밀리미터 유리 바닥 접시의 14 밀리미터 웰 내로 피펫팅한다.매체가 우물을 덮을 때까지 접시를 돌립니다. 피펫을 사용하여 접시 중앙에서 40마이크로리터의 배지를 흡인하고 90마이크로리터의 배지를 남깁니다. 매체의 균일한 냉각을 보장하려면 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 보관하기 전에 습도 챔버의 알루미늄 블록에서 접시를 식히십시오.이미징 전날 아침, 최근에 중격 기증자 및 낙인 기증자로 생산되기 시작한 건강한 애기장대 식물을 선택하십시오. 수술, 꽃받침 및 꽃잎을 제거하여 3단계 12B 중격 기증자 꽃과 12단계 12B 낙인 기증자 꽃을 거세하기 전에 꽃차례에서 오래된 꽃을 제거합니다. 24시간 후 아침에 쉽게 꽃가루를 흘리는 꽃가루 기증자 꽃으로 낙인 기증자에게 수분을 공급합니다.낙인이 꽃가루로 거의 완전히 덮여있을 때 수분이 완료됩니다. 수분 30분 후, 척추경에서 건강하고 성숙한 중격 기증자 암술을 제거하고 테이프 가장자리 바로 옆에 낙인이 붙어 있는 유리 슬라이드에 장착된 신선한 양면 접착 테이프에 넣습니다. 새 인슐린 주사기 바늘의 뒷면을 사용하여 척추경을 부드럽게 누르고 난소를 따라 암틀을 테이프에 단단히 고정합니다.꽃받침, 꽃잎 및 수술 찌꺼기를 제거합니다. 입체경 아래에서 인슐린 주사기 바늘을 사용하여 스타일-난소 접합부와 난소-척추경 접합부에서 심피당 두 번 절단합니다. 그런 다음 각 심피의 중격을 따라 얕게 자르고 난소 벽을 테이프에 다시 벗겨 난자를 노출시킵니다.두 개의 격막 사이에 바늘을 부드럽게 밀어 난자를 방해하지 않고 암술의 전체 길이를 따라 replum을 자릅니다. 그런 다음 스타일 근처의 상단 중격을 잘라 전체 중격이 들어 올려지도록 합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 척추경에서 중격을 제거합니다.난자의 미세 더미가 위를 향하도록 배

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

각인은 식물과 동물의 복제에 현상입니다. DNA의 methylation은 각인의 메커니즘에서 중요한 역할을합니다. 배젖를 분리 및 각인 유전자의 methylation 상태를...

에 각인 유전자의 DNA Methylation의 결정 Arabidopsis 배젖

우리의 개발 초기 단계에서 배아를 분리하는 효율적이고 간단한...

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

라이브 공 촛점 이미징 개발을 연구하는 강력한 도구로 생물 학자를 제공합니다. 여기, 우리 애기 꽃을 개발하는 라이브 공 촛점 이미징에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

이 프로토콜 embryogenesis 애기 에 난 허가 뒤에 현미경으로 배아 패턴 형성의 검사를 통해 관찰 하는 방법을 설명 합니다.

애기 에서 Embryogenesis를 특성화 하는 방법

이 원고는 체 외에 난 재배 방법을 라이브 셀 이미징 애기 zygotes 및 배아의 수를 설명 합니다. 이 메서드는 zygote 분극 동안 세포내 역학 및 배아 개발 세포 운명 명세를 시각화 하기 위해 이용 된다.

생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

우리는 epifluorescence 현미경을 사용하여 애기장대 이중 수정에 있는 정액 핵 형태에 근거하여 성공또는 실패한 수정을 결정하는 방법을 보여줍니다.

애기장의 정자 핵 형태를 추적하여 수정 상태의 평가 이중 수정

Arabidopsis thaliana에서 꽃가루 수화 프로필을 측정하는 개선된 방법이 여기에 설명되어 있습니다. 새로운 방법은 더 높은 분해능을 제공하고 비침습적이며 재현성이 높습니다. 이 프로토콜은 수분의 초기 단계를 조절하는 과정을 보다 세밀하게 해부하기 위한 새로운 도구를 나타냅니다.

Arabidopsis thaliana에 대한 고분해능, 단일 입자, 생체 내 꽃가루 수화 생물학적 분석

이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 종자에서 배유 세포층의 온전한 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주사 바늘 및 정밀 겸자와 같은 일반적인 실험실 장비만 필요하며 개발 중인 종자와 성숙한 종자 모두에서 배유 세포의 고해상도 형광 라이브 셀 이미징을 가능하게 합니다.

Preparation of intact tissue for microscopic analysis of the endosperm cell layer in Developing and mature Arabidopsis seeds(개발 및 성숙한 애기장대 종자에서 배유 세포층의 현미경 분석을 위한 온전한 조직의 준비)

감수 분열 전기 동안의 염색체 이동은 포자 형성의 기본이 되는 잘 이해되지 않는 현상입니다. 이 프로토콜은 애기장대 탈리아나 수컷 감수 모수세포에서 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임을 획득, 분석 및 정량화하는 방법을 설명합니다.

애기장대 의 수컷 감수 분열 전기 동안 중심체 움직임의 라이브 이미징 특성화

이것은 zebrafish에 대한 높은 처리량 정자 cryopreservation 프로토콜입니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 이후의 체외 수정에 25 % 다산의 평균을 가지고 있으며, 수년 동안 안정 cryopreserved.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

학습하세요 Arabidopsis thaliana에서 꽃가루관 수용과 씨방 수용성을 분석하는 개선된 semi-in vitro cum septum 방법을 사용하여. 이 기법은 배우체 상호작용을 고효율로 관찰하고 수정 과정을 실시간으로 모니터링합니다.

Arabidopsis 꽃가루관 수용 및 이중 수정의 실시간 이미징 semi-In vitro cum septum 방법을 사용한

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