Name: Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 배우세요 Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 분리하고 식별하는 방법을. 이 기술은 췌장 재생 및 당뇨병 치료 연구에 활용됩니다.

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저자는이 프로젝트를 수행하기 위해 제공 된 지원에 대해 멕시코 사회 보장 연구소 (IMSS)와 멕시코 아동 병원, 페데리코 고메즈 (HIMFG) 및 IMSS 연구 조정의 Bioterio 직원에게 감사드립니다. AOC (815290) 장학금에 대한 국립 과학 기술위원회와 시청각 자료에 대한 기술 지원에 대해 Antonio Duarte Reyes에게 감사드립니다.

모든 실험 절차는 국제 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico)의 권장 사항에 따라 멕시코 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 Instituto Mexicano del Seguro Social의 건강 연구 윤리 위원회(R-2021-785-092)에서 검토, 승인 및 등록했습니다.
1. 외과적 절제술에 의한 쥐의 지방조직 제거
<ol><li>20mL의 멸균 1x 인산염 완충 식염수-항생제 항진균제(PBS-AA) 용액(1x PBS, 겐타마이신[20μg/mL] 및 암포테리신[0.5μg/mL])으로 두 개의 원뿔형 튜브를 준비하고 얼음 위에 유지합니다.</li>
	<li>건강 상태가 양호한 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐 (R. norvegicus) 두 마리를 선택합니다. 쥐가 생후 3-4개월 사이이고 코랄 무게가 350-450g인지 확인하십시오.</li>
	<li>자일라진 염산염 20mg/kg으로 진정을 진행하고 5분 후 케타민 염산염 120mg/kg을 복강 주사하여 마취제를 투여합니다. 건조를 방지하기 위해 안과 용 연고로 양쪽 눈을 윤활하십시오. 그런 다음 페달 반사 부족을 통해 마취 깊이를 확인합니다.</li>
	<li>복부와 사타구니 부위를 요오드 용액으로 면도하고 소독하십시오. 무균 상태를 유지하기 위해 외과 용 커튼을 적용하십시오. 그런 다음 흉골에서 고환 부위까지 중앙 세로 절개를합니다.</li>
	<li>멸균 겸자로 부고환과 신장을 둘러싼 지방 조직을 제거하고 1x PBS-AA 용액에 넣습니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>기관 지침에 따라 필요한 경우 절개 부위를 봉합하고 40mg/kg 펜토바르비탈 나트륨의 심장 내 용량으로 동물을 안락사시킵니다. 사망이 확인되면 제도적 절차에 따라 시체를 처리한다. 참고: 죽음은 중간엽 세포의 면역 표현형, 분화 능력 및 측분비 효과에 영향을 미치는 신호 전달 메커니즘을 유도합니다. 따라서 조직 수집은 안락사 전에 수행됩니다. </li>
</ol>2. 지방조직에서 중간엽 세포의 분리
<ol><li>생물 안전 캐비닛 내에서 멸균 집게로 지방 조직을 제거하고 100mm 직경의 페트리 접시에 멸균 여과지에 올려 과도한 PBS를 흡수합니다.</li>
	<li>지방 조직을 다른 페트리 접시로 옮기고 10mL 피펫을 사용하여 1x PBS-AA 용액 10mL로 각각 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.</li>
	<li>가위와 메스를 사용하여 조직을 약 1cm2 의 조각으로 기계적으로 분해합니다.</li>
	<li>보충되지 않은 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 20mL에 콜라게나제 IV형(0.075%)을 준비합니다. 0.22μm 주사기 필터를 통해 여과하고 37°C에서 유지합니다.</li>
	<li>단계 2.4에서 제조된 콜라게나제 용액(20 mL)을 파편화된 조직과 마그네틱 바가 있는 크리스탈 비이커에 넣는다. 용기를 밀봉하고 37°C에서 서서히 연속적인 교반 하에 배양한다. 참고: 효소 분해에는 약 90분이 소요됩니다(세포막의 무결성을 유지하기 위해 천천히 저어줍니다).</li>
	<li>100mm 페트리 접시의 스테인리스 스틸, 40메쉬, 0.38mm 조리개 필터를 통해 균질액을 여과하고 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.</li>
	<li>따뜻하게 하고 보충된 DMEM(10% 소 태아 혈청[FBS], 2mM 글루타민, 2mM 피루브산나트륨, 100x 비필수 아미노산 용액 및 100x 항생제 항진균 용액[AA]) 20mL를 추가합니다. 기질 혈관 분획 (SVE)을 조심스럽게 중단하십시오.</li>
	<li>세포 현탁액을 290 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 25 mL 피펫으로 상청액을 버리고, 40 mL의 비보충 DMEM 배지로 세포를 부드럽게 세척한다.</li>
	<li>이 단계를 반복합니다. 단계 사이에 새로운 멸균 원추형 튜브를 사용하여 세포 찌꺼기와 지방을 최소한으로 끌어냅니다.</li>
	<li>펠릿을 5mL 피펫으로 보충된 DMEM 5mL에 현탁하고 T-25cm2 병으로 옮깁니다. 37°C 및 5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>다음 날, 5mL의 데워진 1x PBS-AA로 3회 세척하고 보충되지 않은 DMEM으로 2회 세척하여 세포 파편과 비부착성 세포를 제거합니다. 5mL 피펫으로 신선하고 따뜻하게 보충된 DMEM 5mL를 추가하고 3-4일마다 배지를 교체합니다.</li>
</ol>3. ASC 1차 문화의 유지 및 확장
<ol><li>세포가 90%-100% 합류(8± 2일)에 도달하면 보충되지 않은 DMEM 5mL로 두 번 세척합니다. 데워진 0.025% 트립신-2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1mL를 넣고 37°C에서 5-7분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포 단층이 분리되면 보충된 DMEM 4mL를 추가하고 세포 현탁액을 부드럽게 분해합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 5mL의 따뜻하고 보충된 DMEM을 추가하고 부드럽게 현탁하여 균질화합니다.</li>
	<li>290 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 버리고 펠릿을 보충된 DMEM 1mL에 부드럽게 혼합합니다. Trypan blue로 염색한 후 Neubauer 챔버에서 세포를 계수합니다.</li>
	<li>마지막으로 T-75 플라스크에서 2.5 x 103 cells/cm 2 를 1:4의 분할 비율로 시드합니다. 이 단계는 집락 형성과 높은 증식 속도를 보장합니다.</li>
</ol>4. ASC 1차 배양의 형태학적 특성
<ol><li>도립 현미경으로 ASC의 형태를 관찰합니다. 알림: 조직학 및 ASC 식별을 위해 장착하기 전에 커버슬립을 1% 젤라틴 용액으로 처리하십시오. UV를 15분 동안 조사합니다.<ol><li>70% 에탄올 용액에서 커버슬립을 제거하고 5분 동안 건조시킵니다.</li>
		<li>커버슬립을 멸균된 1% 젤라틴 용액에 담그고 물기를 빼고 실온(RT)에서 건조합니다.</li>
		<li>각 커버슬립을 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 플레이트에 15분 동안 UV 광선을 조사합니다.</li>
		<li>웰 중앙에 25 x 103 세포가 들어 있는 한 방울을 시딩하고 1분 정도 기다린 후 보충된 DMEM 배지 1mL를 추가합니다. 37°C 및 5%CO2에서 96시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>배지를 제거하고 이송 피펫을 사용하여 1x PBS-AA로 3회 세척을 수행합니다.</li>
		<li>3.5% 중성 포르말린 1mL를 각 웰에 넣고 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 포르말린을 조심스럽게 제거하고 차가운 70% 에탄올 1mL를 각 웰에 추가합니다.</li>
		<li>건조를 방지하기 위해 사용할 때까지 파라필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 참고: ASC의 세포 형태는 또한 다른 계대 동안 헤마톡실린-에오신 염색에 의해 평가됩니다.</li>
		<li>각 웰로부터 70% 에탄올을 제거하고, 증류수로 5분 동안 세포를 수화시킨다. 한편, 염색 용액을 여과한다.</li>
		<li>물을 제거하고 Harris의 헤마톡실린 용액으로 15분 동안 천천히 교반하면서 세포를 염색합니다.</li>
		<li>염색 용액을 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>에오신 용액으로 세포를 1분 동안 천천히 교반하여 염색합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 1x PBS로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>각 웰에서 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 PBS-글리세롤 장착 용액(1:1 v/v) 한 방울에 슬라이드를 장착합니다.</li>
		<li>커버슬립 주위에 네일 바니시를 한 줄 붙이고 광학 현미경으로 조직학적 슬라이드를 관찰합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 면역형광법에 의한 ASC의 발현 마커
<ol><li>1x PBS-0.05% Tween 20을 함유하는 세척 완충액을 준비한다. RT에서 천천히 흔들어 세탁하십시오. 2mL의 완충액/웰로 플레이트를 세 번 세척합니다(세척할 때마다 3분 동안 배양).</li>
	<li>1mL의 블로킹 시약(1:10)을 넣고 20분 동안 천천히 교반하면서 배양합니다.</li>
	<li>CD9(단클론 마우스), CD34(다클론 토끼) 및 항-CD63(다클론 염소)과 같은 1차 항체 200μL(1:50 희석)를 각 웰에 추가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>플레이트를 다시 세 번 세척하고 다음 2차 항체의 200μL(1:50 희석)와 함께 배양합니다: 항-마우스 IgG FITC 접합 염소, 당나귀 항-염소 IgG DyeLight 550 및 염소 항-토끼 IgG Cy3.</li>
	<li>1x PBS-0.05% Tween 20으로 3회 세척하고 100μL의 DRAQ-7(희석: 이중 증류수 1mL에 17μL)로 세포핵을 20분 동안 대조염색합니다.</li>
	<li>세 번 더 씻고 4.1.12-4.1.13 단계에 따라 슬라이드를 장착합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 사용할 때까지 냉동하십시오.</li>
	<li>에피형광 컨포칼 현미경 하에서 이 장비에 권장되는 적절한 설정과 소프트웨어를 사용하여 샘플을 시각화합니다.</li>
</ol>6. 유세포 분석에 의한 ASC의 발현 마커
<ol><li>트립신 처리 또는 해동된 세포(하위 계대 3 또는 4)의 단일 세포 현탁액을 1x PBS-5% FBS의 1 x 106 cells/mL 농도로 조정합니다. 1.5mL 원심분리기 튜브에 100,000개 세포와 함께 100μL를 분취합니다. 자동 형광 제어를 위해 라벨링 없이 하나의 분취량을 사용합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 적절한 양의 Anti-CD105 AF-594 및 Anti-CD31 AF-680을 모두 추가합니다. 4°C에서 20분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.</li>
	<li>250 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 1mL의 1x PBS-5% FBS로 초과 염색을 세척하고 1% 포르말린 300μL에 현탁합니다.</li>
	<li>유세포 분석기에서 시료 수집을 수행합니다. 셀의 게이팅 전략은 FSC-A 대 SSC-A 게이팅, SSC-H 대 SSC-A를 사용하여 게이팅된 단일 셀, FSC-A 대 FSC-H를 기반으로 합니다.</li>
	<li>CD105 AF-594에는 Y610-mCherry-A 검출기를 사용하고 CD31 AF-680에는 R660-APC-A 검출기를 사용합니다.</li>
</ol>7. ASC와 지방 생성 계통의 분화
<ol><li>6-웰 플레이트에서, 시드 1 x 10 cm2 당 4 세포 (P-4) 및 60-80% 합류(~72-96 h)까지 37°C, 5%CO2에서 인큐베이션한다. 4 μM 인슐린, 1 μM 덱사메타손 21-아세테이트(Dxa) 및 0.5 mM의 3-이소부틸-1-메틸크산틴(MIX)을 배양 배지에 직접 적용하여 분화를 유도합니다. 분화 배지는 2-3일마다 교체하십시오.</li>
	<li>멸균 초순수 2mL에 800μM 인슐린 원액을 준비하고(완전한 용해를 위해 1N HCl 20μL 추가) -20°C에서 보관합니다. 이전에 1:100으로 희석한 인슐린 스톡 10μL를 추가하고 웰당 2mL의 최종 부피로 10μL를 적용합니다.</li>
	<li>멸균 초순수 5mL에 1mM Dxa의 원액을 준비합니다(완전 용해가 일어나지 않음). 4 °C에서 보관하십시오. 40 μL/well의 1:4 희석 Dxa 스톡을 추가합니다.</li>
	<li>2.5mL의 0.1N NaOH에 100mM의 MIX를 준비하고, 와동하고, 완전한 용해를 위해 40μL의 1N NaOH를 추가합니다. -70 °C에서 보관하십시오. 10 μL/well의 MIX 스톡을 추가합니다.</li>
	<li>보관하기 전에 0.22μm 멸균 주사기 필터를 통해 저장 용액을 여과합니다.</li>
	<li>12일째에, 세포를 1x PBS로 3회 세척하고, RT에서 1시간 동안 4% 포르말린 500 μL로 인큐베이션한다. 증류수로 각 웰을 2회 세척하고, 이어서 60% 이소프로판올을 5분 동안 건조시켰다.</li>
	<li>60% 이소프로판올(500μL/웰)로 희석한 0.5% 오일 레드 O를 넣고 RT에서 20분 동안 배양합니다. 증류수 1mL로 3회 세척하고 도립 현미경으로 관찰합니다. 알림: 필요한 시약, 장비 및 재료는 재료 표를 참조하십시오.</li>
</ol>

지방 조직 유래 줄기세포 분리 및 특성 분석

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저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

중간엽 줄기세포가 발견된 이후 지난 40년 동안 여러 그룹의 연구자들이 다양한 조직과 종에서 중간엽 줄기세포를 얻는 절차를 설명했습니다. 쥐를 동물 모델로 사용하는 장점 중 하나는 유지 관리가 쉽고 발달이 빠르며 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 쉽게 얻을 수 있다는 것입니다. ASC를 얻기 위한 상이한 조직 공급원, 예컨대 내장, 주위지방, 부고환 및 피하 지방 12,13,14,15,16이 기재되어 있다.
여기에 사용 된 추출 절차와 관련하여 저자는 쥐의 체중이 350-450g 사이 여야하며 생후 첫 4 개월 동안 달성 할 수 있다고 권장합니다. 동물의 체중이 450-600g이고 생후 8개...

중간엽 줄기세포(MSC)는 자가 재생, 증식, 이동 및 다른 세포 계통으로의 분화 능력이 높기 때문에 재생 의학에 큰 영향을 미쳤습니다 1,2. 현재 많은 연구가 다양한 질병의 치료 및 진단 가능성에 초점을 맞추고 있습니다.
중간엽 세포의 출처는 골수, 골격근, 양수, 모낭, 태반, 지방 조직 등 다양합니다. 그들은 인간, 생쥐, 쥐, 개, 말3을 포함한 다양한 종에서 얻습니다. 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMSC)는 재생 의학에서 줄기세포의 주요 공급원이자 배아 줄기 세포 사용의 대안으로 수년 동안 사용되어 왔다4. 그러나 지방 유래 중간엽 줄기 세포 또는 지방 유래 줄기 세포 (ASC)는 수집 및 분리가 용이하고 지방 조직 5,6 그램 당 얻은 세포의 수율로 인해 큰 이점을 가진 중요한 대안입니다. ASCs의 수확량은 일반적으로 BMSCs의 수확량보다 높다고 보고되었다7. 처음에는 ASC의 회복/재생 능력이 다른 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력 때문이라고 제안되었다8. 그러나 최근 몇 년 동안의 연구는 ASC가 회복 잠재력에서 방출하는 측분비 인자의 주요 역할을 강화했습니다 9,10.
지방 조직(AT)은 에너지를 비축할 뿐만 아니라 내분비계, 신경계 및 심혈관계와 상호 작용합니다. 또한 출생 후 성장 및 발달, 조직 항상성 유지, 조직 복구 및 재생에 관여합니다. AT는 지방세포, 혈관 평활근 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 단핵구, 대식세포, 림프구, 지방전구세포 및 ASC로 구성됩니다. 후자는 면역 원성이 낮기 때문에 재생 의학에서 중요한 역할을합니다11,12. ASC는 효소 분해 및 기계적 처리 또는 지방 조직 외식편에 의해 얻을 수 있습니다. ASC의 기본 문화는 유지 관리, 성장 및 확장이 쉽습니다. ASC의 표현형 특성 분석은 면역형광 및 유세포 분석과 같은 방법을 사용하여 특정 막 마커의 발현을 평가함으로써 세포의 정체성을 검증하는 데 필수적이다13. IFATS(International Federation for Adipose Therapeutics and Science)와 ISCT(International Society for Cellular Therapy)는 ASC가 CD73, CD90 및 CD105를 발현하는 반면 CD11b, CD14, CD19, CD45 및 HLA-DR14의 발현은 부족하다고 정의했습니다. 따라서 양성 및 음성 모두 이러한 마커는 ASC의 특성화에 신뢰할 수 있는 것으로 간주됩니다.
이 프로젝트는 쥐의 AT에서 추출한 성체 중간엽 세포의 분리 및 식별 절차를 설명하는 데 중점을 두었는데, 이 세포 공급원은 배아 줄기 세포와 달리 윤리적 문제를 나타내지 않기 때문입니다. 이것은 골수 유래 줄기 세포에 비해 접근이 용이하고 최소 침습적 방법으로 인해 실행 가능한 옵션으로 절차를 굳건히 합니다. 
이 조직 공급원의 중간엽 세포는 면역 조절 능력과 낮은 면역 거부 반응으로 인해 재생 의학에서 중요한 역할을 합니다. 따라서 본 연구는 그들의 세크레톰과 당뇨병과 같은 대사 질환을 포함한 다양한 질병에서 재생 요법으로서의 적용에 대한 향후 연구의 근본적인 부분입니다.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>HyClone</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Sartorius</td><td>AX224</td><td></td></tr><tr><td>항체 항 CD9 (C-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-13118</td><td></td></tr><tr><td>항체 항 CD34 (C-18)</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-7045</td><td></td></tr><tr><td>항체 항 C63</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-5275</td><td></td></tr><tr><td>항체 항 Endoglin / CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 </td><td>Santa Cruz</td><td>sc-18838A594</td><td></td></tr><tr><td>항체 anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-18916AF680</td><td></td></tr><tr><td>항체 염소 anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 </td><td>Novus</td><td>NB 120-6939</td><td></td></tr><tr><td>항체 당나귀 anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 </td><td>Invitrogen</td><td>SA5-10087</td><td></td></tr><tr><td>항체 anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab&acute;)</td><td>RD 시스템.</td><td>No. F103B</td><td></td></tr><tr><td>보틀 탑 필터 멸균</td><td>코닝</td><td>10718003</td><td></td></tr><tr><td>세포 및 조직 배양 플라스크</td><td>BIOFIL</td><td>170718-312B</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기 Bright-Line 혈구계(세포 계수 챔버 슬라이드 포함</td>) <td>SIGMA Aldrich </td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Cell well: 뚜껑이 있는 6웰</td><td>CORNING</td><td>25810</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 원추형 튜브</td><td>HeTTICH</td><td>ROTANA460R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 에펜도르프 튜브</td><td>Fischer Scientific</td><td>M0018242_44797</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV </td><td>Worthington</td><td>LS004186</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>SPL Life Science</td><td>43112</td><td></td></tr><tr><td>배양 튜브</td><td>Greiner Bio-One </td><td>191180</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert 2.0</td><td>Beckman Coulter</td><td>무료 버전</td><td></td></tr><tr><td>CytoFlex LX 세포분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>FLOW-2463VID03.17</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA Aldrich</td><td> 67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>DraQ7 염료</td><td>Thermo Sc. </td><td>D15106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>에오신 황색</td><td>Hycel</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 96%</td><td>Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 튜브 15mL</td><td>Greiner Bio-One </td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 튜브 50mL</td><td>Greiner Bio-One </td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 </td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴,</td><td>시그마, 알드리치</td><td>, 128111163</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td>, <td>GIBCO</td><td>15750045</td><td></td></tr><tr><td>글리세린-고순도</td>, <td>Herschi, 트레이딩</td>, <td>56-81-5</td><td></td></tr>, 헤라셀, <tr><td></td><td>AMRESCO </td><td>0701-25G</td><td></td></tr><tr><td>, 헤라셀, 240i, CO2 인큐베이터</td>, <td>Thermo Sc.</td><td></td><td></td>50116047</tr><tr><td>케타민 애완 동물 (케타민 클로 히드 레이트)</td> <td>아란다</td><td>SV057430</td><td></td></tr><tr><td>L- 글루타민 </td><td>GIBCO / Thermo Sc. </td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LSM 소프트웨어 Zen 2009 V5.5</td><td></td><td>무료 버전</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛 클래스 II</td><td>NuAire</td><td>12082100801</td><td></td></tr><tr><td>에피 형광 현미경 </td><td>Zeiss Axiovert 100M</td><td>21.0028.001</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경 </td><td>Olympus CK40</td><td>CK40-G100 </td><td></td></tr><tr><td>비 필수 아미노산 100X</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브 2 mL </td><td>Sarstedt </td><td>72695400</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브 1,5 mL</td><td>Sarstedt </td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 0.2-2 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>E97743</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 2-20 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>F54167</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 20-200 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>G32419</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 100-1000 &mu; L</td><td>Finnpipette</td><td>FJ39895</td><td></td></tr><tr><td>질소 탱크 액체</td><td>Taylor-Wharton</td><td>681-021-06</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>SLBC3029V</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 </td><td>GIBCO/Thermo Sc. </td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>페트리 접시 세포 배양</td><td>CORNING Inc</td><td>480167</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips</td><td>Axygen Scientific</td><td>301-03-201</td><td></td></tr><tr><td>Pisabental (pentobarbital sodium)</td><td>PISA Agropecuaria</td><td>Q-7833-215</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride </td><td>J.T.Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate</td><td>Dibasic J.T Baker</td><td>2139900</td><td></td></tr><tr><td>S1 피펫 필러</td><td>Thermo Sc</td><td>9531</td><td></td></tr><tr><td>혈청 학적 피펫 5 mL</td><td>PYREX</td><td>L010005</td><td></td></tr><tr><td>혈청 학적 피펫 10 mL</td><td>PYREX</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>J.T Baker</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 </td><td>J.T.Baker</td><td>15368426</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염 기성 무수</td><td>J.T 베이커</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>GIBCO BRL</td><td>11840-048</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 멸균</td><td>CORNING</td><td>431222</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>PerkinElmer Lambda 25</td><td>L6020060</td><td></td></tr><tr><td>역가 플레이트 쉐이커</td><td>LAB-LINE</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>Samco/Thermo Sc</td><td>728NL</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 돼지</td><td></td> 췌장에서 추출한 <td>GIBCO</td> 1198566 <td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>염색 SIGMA Aldrich</td><td>102H0234</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>유니버설 블로킹 시약 10x</td><td>BioGenex</td><td>HK085-GP</td><td></td></tr><tr><td>Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)</td><td>Pet' s 제약</td><td>Q-7972-025</td><td></td></tr></tbody></table>

sprague dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

성인 중간엽 세포는 최근 수십 년 동안 분자 및 세포 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 그들은 자가 재생, 이동 및 증식을 위한 큰 능력 외에도 다양한 특수 세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 지방 조직은 중간엽 세포의 가장 침습적이지 않고 가장 접근하기 쉬운 공급원 중 하나입니다. 또한 다른 공급원에 비해 수율이 높고 면역 조절 특성이 우수한 것으로 보고되었습니다. 최근에, 상이한 조직 공급원 및 동물 종으로부터 성체 중간엽 세포를 얻기 위한 상이한 절차가 발표되었다. 일부 저자의 기준을 평가한 후 다양한 목적에 적용할 수 있고 쉽게 재현할 수 있는 방법론을 표준화했습니다. 신장 주위 및 부고환 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF) 풀을 통해 최적의 형태와 기능을 갖춘 1차 배양을 개발할 수 있었습니다. 세포는 24시간 동안 플라스틱 표면에 부착된 것으로 관찰되었으며, 연장 및 콜로니 형성 경향과 함께 섬유아세포와 유사한 형태를 나타냈습니다. 유세포 분석 (FC) 및 면역 형광 (IF) 기술을 사용하여 막 마커 CD105, CD9, CD63, CD31 및 CD34의 발현을 평가했습니다. 지방 유래 줄기 세포(ASC)가 지방 유래 계통으로 분화하는 능력은 또한 인자 칵테일(4μM 인슐린, 0.5mM 3-메틸-이소-부틸-크산틴 및 1μM 덱사메타손)을 사용하여 평가되었습니다. 48시간 후, 섬유아세포양 형태의 점진적인 손실이 관찰되었고, 12일째에 오일 레드 염색에 양성인 지질 방울의 존재가 확인되었습니다. 요약하면, 재생 의학에 적용하기 위한 최적의 기능적 ASC 배양을 얻기 위한 절차가 제안됩니다.

지방 조직은 생후 3-4개월의 성인 Sprague Dawley 쥐에서 얻었으며 체중은 401g± 41g(기하 평균 ± SD)입니다. 부고환 및 신장 주위 지방 조직의 평균값 3.8 g은 15 개의 실험 추출 분석에 해당한다. 배양 24시간 후, 세포 집단은 플라스틱 표면에 부착된 상태를 유지하고 이질적인 형태를 나타냈습니다. 첫 번째 계대배양은 8 ± 2일째에 실현되었으며, 총 8번의 실험에서 0.6 x 106 세포± 1.4 수율로 실현되었다. 직접 명시야 관찰(그림 1)과 헤마톡실린-에오신 염색(그림 2)은 광학 현미경으로 형태학적 특성 분석을 용이하게 했습니다. 길쭉한 연장과 풍부한 세포 내 미세 필라멘트, 중간 엽 기질 세포의 특징과 함께 광범위한 세포질이 보였습니다.
ASC는 서로 다른 하위 통로(1, 3, 7 및 9)에서 간접 면역형광에 의해 구...

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

중간엽 줄기 세포는 측분비 기능으로 인해 세포 통신에서 매우 광범위한 역할을 합니다. 이 프로토콜은 췌장 재생 및 당뇨병 치료법 연구에 사용하기 위한 형태학적, 면역표현형 및 적절한 기능을 가진 지방 유래 중간엽 줄기 세포를 얻습니다. 당뇨병 치료에서 세포 요법의 사용이 증가했습니다.이러한 치료법에는 췌장 세포의 동종 이식, 인슐린 생산 세포의 자가 줄기 세포 유래 제품, 생물학적 잉크를 사용한 3D 프린팅 췌장 조직이 포함됩니다. 대부분의 연구는 주로 세크레톰 성분과 다양한 세포 과정의 조절에 대한 역할을 연구했습니다. 마이크로어레이 및 차세대 시퀀싱과 같은 새로운 기술은 miRNA의 기능을 조사할 수 있습니다.이 분야의 과제는 중간엽 세포를 더 많이 자극하여 세크레톰의 정확한 분자 구성에 도달하고 특정 조건의 치료로 유도하는 것입니다. 우리는 miRNA가 산화 스트레스에 노출된 췌장 조직 변성에 어떻게 기여하는지 평가할 것입니다. 이 연구에는 지방 조직의 줄기 세포 사용이 포함됩니다.

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연구

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생물학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

이 프로토콜은 소화 효소, 밀도 구배 분리, 수지 밀착성 및 CD146 + 자성 비드의 선택을 이용하여, 래트에서 일차 폐 상주 간엽 기질 세포를 얻기위한 분리 기술을 설명한다.

CD146의 분리<sup&gt; +</sup쥐 폐에서&gt; 주민 폐 중간 엽 기질 세포

이 프로토콜은 다능성 검사를 통해 피하 지방 조직에서 돼지 지방 유래 줄기 세포(pADSC)를 분리하는 방법을 설명합니다. 다분성 pADSC는 지방 세포 분화 과정을 설명하고 재생 연구를 위해 중배엽 중간엽의 여러 세포 계통 또는 외배엽 및 내배엽의 추가 계통으로의 전분화를 연구하는 데 사용됩니다.

돼지 피하 지방이 조직에서 분리 및 지방이 유래 줄기 세포의 분화

이 프로토콜은 배식물 방법을 사용하여 복부 성형술 및 지방 흡입구 샘플로부터 중간엽 줄기 세포를 분리하는 효소 없는 방법을 제공한다. 가혹한 효소 또는 원심 분리 단계의 부재는 시험관 내 연구에 사용되거나 클리닉으로 다시 전송될 수 있는 임상적으로 관련된 줄기 세포를 제공합니다.

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

이 기사에서는 효소 조직 소화 프로토콜을 사용하여 붉은털 원숭이 유래 지방 유래 줄기 세포(ADSC)의 분리에 대해 설명합니다. 다음으로, 세포 분리, 계수 및 도금을 포함하는 ADSC 증식에 대해 설명합니다. 마지막으로, ADSC 분화는 특정 지방 생성 유도제를 사용하여 설명됩니다. 또한 차별화를 확인하기 위한 염색 기술을 설명합니다.

붉은털원숭이 지방유래 줄기세포의 분리, 증식 및 분화

지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포 (Ad-MSCs)는 인슐린 생산 세포 (IPCs)로 분화되는 MSCs의 잠재적 인 원천이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 래트 부고환 Ad-MSCs의 분리 및 특성화를위한 상세한 단계를 제공하고, 동일한 래트 Ad-MSCs로부터의 IPC의 생성을위한 간단하고 짧은 프로토콜을 제공한다.

인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

쥐 MSCS는 대퇴골과 tibias으로부터 격리하고 자기 세포 분류에 의해 풍부하게되었다. 정렬 세포 유동세포계측법에 의해 표면 마커의 표현에 대해 확인했다. 이러한 세포는 하나의 식민지를 형성 clonal 밀도에 교양 있었다 그리고 이들 식민지는 복제 실린더로 구분했다.

분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리

배우세요 Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포를 분리하고 식별하는 방법을. 이 기술은 췌장 재생 및 당뇨병 치료 연구에 활용됩니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

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