Name: 포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 배우세요 저산소 환경에서 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 측정하는 산소 비의존적 분석법을. 안정 동위원소 추적과 고분해능 질량분석을 활용하여 대사 스트레스 적응 메커니즘을 규명하고 세포 에너지 대사 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 원고에서 제작 된 그림은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 기사에 대한 피드백을 제공해 주신 Amy Walker에게 감사드립니다. JBS는 우스터 생물 의학 연구 보조금 재단의 지원을 받았습니다.

DHODH 및 SDH 활성을 측정하기 위한 안정 동위원소 추적 및 LC-MS 분석

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<li>Chandel, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+generated+at+mitochondrial+complex+III+stabilize+hypoxia-inducible+factor-1alpha+during+hypoxia%3A+A+mechanism+of+O2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).</li>
<li>Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+radicals+and+hydrogen+peroxide+by+NADH-ubiquinone+reductase+and+ubiquinol-cytochrome+C+reductase+from+beef-heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).</li>
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<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).</li>
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<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
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<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
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<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
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저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.

포유류의 미토콘드리아가 분자 산소를 소비하지 않고도 기능할 수 있다는 새로운 연구가 입증됨에 따라 연구자들은 미토콘드리아 기능을 정확하게 정량화하기 위해 OCR 측정을 넘어 직교 분석을 사용하는 것이 가장 중요합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아 NAD+/NADH 균형, 적응 말단 전자 수용체의 활용, ATP 생성, de novo 피리미딘 생합성 및 미토콘드리아 유래 ROS를 측정하여 복합체 I, 복합체 II, 복합체 V 및 DHODH의 활성을 직접 평가하는 데 사용할 수 있는 일련의 분석을 수집했습니다. 특히, 이러한 분석은 OCR 측정보다 미토콘드리아 기능을 더 직접적으로 측정합니다. 또한, 이러한 분석은 연구자들에게 저산소증 동안 미토콘드리아 기능을 정량화할 수 있는 다루기 쉬운 방법을 제공하며, 이는 푸마레이트가 선호되는 말단 전자 수용체로 사용되기 때문에 OCR 측정이 크게 관련이 없습니다. 마지막으로, 여기에 설명된 증식 기반 방법은 기존의 호흡기 측정 실험보다 비용 효율적이므로 포유류 시스템에서 미토콘드리아 기능을 연구할 수 있는 광범위하게 접근 가능한 방법을 제공합니다.
배양된 세포에서 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 이러한 분석을 사용할 때 주요 고려 사항이 있습니다. 증식 분석과 관련하여, 각 세포주의 배가 속도를 위해 시딩된 세포의 수를 조정하는 것이 중요하다. 세포는 증식의 차이를 정량화할 수 있도록 최소 10%의 합류점과 3-4배의 배가를 허용할 수 있는 충분한 공간이 있어야 합니다. 각 분석에 대한 또 다른 고려 사항은 각 ETC 복합체의 활성에 대한 대조군으로 사용되는 소분자의 농도입니다. 서로 다른 세포주가 이러한 억제제에 대해 서로 다른 민감도를 나타낼 수 있으므로 최적의 농도를 확인하기 위해 이러한 소분자의 용량을 테스트하는 것이 중요합니다.
OCR 측정 및 여기에 설명된 모든 분석을 포함하여 시험관 내에서 미토콘드리아 기능을 연구하는 분석의 보편적인 한계는 배양 배지의 대사 구성입니다. 표준 세포 배양 배지는 시스템을 표면적으로 높은 수준의 미토콘드리아 기능으로 편향시키는 경향이 있습니다. 예를 들어, 초생리학적 글루타민 수치는 미토콘드리아 NADH 합성을 촉진하고 결과적으로 산화적 인산화를 증가시키는 TCA 주기25의 역고세균을 증가시킵니다. 유사하게, 산소 분압은 포유동물 조직에서 3 mmHg 내지 100 mmHg (대략 0.1%-13%O2) 사이이지만, 시험관 내에서는 대기 (140 mmHg, 대략 21%)이다 26,27. 이러한 과잉O2는 미토콘드리아 호흡 능력과 과산화물 생산을 최대화한다28. 최근에, 보다 생리학적으로 배양 배지를 설계하려는 노력이 이루어지고 있다29,30. 특히, 인간 혈장 유사 배지에서 세포를 배양하면 일부 암 세포주(30)에서 미토콘드리아 호흡, T 세포(31)에서 미토콘드리아 ROS, 암 치료제에 대한 미토콘드리아 적응(32)이 감소합니다. 따라서 사용되는 배양 배지의 구성을 염두에 두고 이것이 미토콘드리아 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다.
미토콘드리아 기능의 해석에서 또 다른 중요하고 보편적인 한계는 미토콘드리아 수의 차이에 대한 가능성입니다. 그러므로, mtDNA33의 정량화, 막 전위-비감응성 염료(34)를 이용한 미토콘드리아 질량의 측정, 또는 미토콘드리아 마커의 웨스턴 블로팅을 통해 미토콘드리아 함량을 측정하는 것이 중요하다. 이것은 미토콘드리아 수의 감소가 미토콘드리아 기능의 감소로 오인되지 않도록 하는 중요한 제어입니다.
여기에 설명된 분석에 적용되는 특정 제한 사항 및 문제 해결도 있습니다. 첫째, 분화된 세포가 증식하지 않는다는 점을 감안할 때, 증식 기반 분석은 이러한 맥락에서 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 유용하지 않을 것입니다. DHODH 활성을 측정하기 위한 13C4-아스파르테이트 추적 프로토콜의 주요 한계는 세포에서의 아스파르테이트 흡수가 매우 비효율적일 수 있다는 것이다35. 이러한 잠재적 한계를 극복하기 위해, 연구자들은 아스파르테이트 수송체인 SLC1A3을 과발현시켜 13C4-아스파르테이트 흡수를 촉진할 수 있다35.
SDH 활성을 측정하기 위해 13C5-글루타민 추적을 사용하는 프로토콜의 한계는 이 분석에서 세포가 역활성을 측정하기 위해 M+3 동위원소를 풍부하게 하기 위해 환원성 카르복실화 경로를 활용해야 한다는 것입니다. 일부 세포주는 낮은 ATP 시트레이트 분해효소 발현36, 불충분한 HIF 안정화 37, 또는 너무 낮은 α-KG:시트레이트 비율38로 인해 환원성 카르복실화 플럭스가 불가능합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, SDH 정방향 및 역방향 활성을 측정하기 위해 13C4-아스파르테이트 추적을 이용할 수 있다7. 이 분석에서, SDH 정방향 활성은 푸마르산염 M+2:숙시네이트 M+2의 비율과 숙신산염 M+4:푸마르산염 M+4에 의한 역반응에 의해 측정될 수 있다. 특히, 이 추적은 환원성 카르복실화 경로에서 대부분의 효소를 우회합니다.
판독으로 DCPIP 감소를 사용하는 복합체 I 활성 분석의 한계는 미토콘드리아가 구조적으로 손상되지 않는다는 것입니다. 분석을 위한 그들의 NADH 흡수를 가능하게 하기 위해 미토콘드리아를 동결-해동시키는 과정은 확실히 미토콘드리아 막의 구조적 완전성을 손상시킬 수 있다39. 이 분석은 관찰된 복합체 I 활성의 변화가 온전한 세포에서도 사실임을 보장하기 위해 복합체 I 증식 분석과 같은 분석과 병행하여 수행되어야 합니다.
향후 연구에서 이러한 기술 중 일부는 마우스 및 Caenorhabditis elegans 와 같은 모델 유기체를 사용하여 생체 내에서 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 적용될 수 있습니다.생체 내에서 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 사용되는 현재 방법은 유기체 수준 OCR, 특히 마우스 모델을 사용할 때의 호흡 교환률에 중점을 둡니다. 이 방법의 분명한 한계는 산소가 미토콘드리아 ETC에서 유비쿼터스 말단 전자 수용체로서의 역할을 넘어 많은 생화학적 및 신호 전달 기능을 수행한다는 것입니다. 예를 들어, 산소는 디옥시게나제 계열의 효소의 촉매 활성에 의해 "소비"됩니다. 이러한 효소는 세포 산소 소비율에 기여하지만 미토콘드리아 기능에 참여, 조절 또는 반영하지 않습니다. 시험관 내 고전적인 호흡 측정 실험은 일반적으로 "비미토콘드리아 OCR"을 제어하는 반면, 유기체 호흡 교환비(RER) 실험은 이를 제어할 수 없으므로 RER을 생체 내 미토콘드리아 기능에 대한 메트릭으로 해석하는 것이 제한됩니다. 그러나, 생체 내에서 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 13C4-아스파르테이트 추적을 통한 DHODH 활성, 13C5-글루타민 추적을 통한 복합체 II 활성, 조직으로부터 정제된 미토콘드리아에 대한 복합체 I 활성, 및 미토콘드리아 ROS를 통해 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 프로토콜을 적용하는 것이 가능하다. 미토콘드리아 기능을 조사하기 위한 이러한 직접적인 분석은 고전적인 호흡 측정 실험과 함께 연구자들에게 포유류 세포 및 조직의 미토콘드리아 기능에 대한 보다 포괄적이고 정확한 평가를 제공합니다.

미토콘드리아 기능은 포유류 세포에서 중요한 생합성, 생체 에너지 및 신호 전달 기능을 유지하기 때문에 세포 건강의 중요한 지표입니다1. 대부분의 미토콘드리아 기능은 전자 수송 사슬(ETC)을 통한 전자 흐름을 필요로 하며, ETC의 전자 흐름 중단은 심각한 미토콘드리아 질환을 유발합니다2. ETC는 내부 미토콘드리아 막에 내장된 일련의 환원 및 산화(산화환원) 반응으로 구성되며, 이러한 전자 전달 반응은 ATP 합성, 열 발생과 같은 생리학적 과정, 새로운 피리미딘 생합성과 같은 생합성 경로 및 NADH와 같은 보조 인자의 산화 환원 상태의 균형을 지원하는 데 활용할 수 있는 자유 에너지를 방출합니다. ETC 복합체 I 및 III은 활성 산소 종(ROS)3,4,5를 생성하며, 이는 차례로 HIF, PI3K, NRF2, NFκB 및 MAPK6과 같은 신호 전달 주요 경로를 조절합니다. 결과적으로, ETC의 전자 흐름 메트릭은 포유류 세포에서 미토콘드리아 기능의 프록시로 고전적으로 사용됩니다.
호흡 측정 실험은 포유류 세포에서 미토콘드리아 기능을 측정하기 위해 자주 사용됩니다. O2는 포유류 ETC에 대한 가장 보편적인 말단 전자 수용체이기 때문에 그 환원은 미토콘드리아 기능의 프록시로 사용됩니다. 그러나 포유류의 미토콘드리아는 새로운 피리미딘 생합성7, NADH 산화7,황화수소 해독8을 포함하여 ETC에 의존하는 미토콘드리아 기능을 유지하기 위해 푸마레이트를 전자 수용체로 사용할 수 있음을 보여줍니다. 따라서, 특정 상황에서, 특히 저산소 환경에서,O2 소비율 (OCR)의 측정은 미토콘드리아 기능의 정확하거나 정확한 지시를 제공하지 않는다.
여기에서는 OCR과 독립적으로 미토콘드리아 기능을 측정하는 데 사용할 수 있는 일련의 분석에 대해 간략하게 설명합니다. 자사는 복합체 I-매개 NADH 산화, 디히드로오로테이트 탈수소효소 매개 de novo 피리미딘 생합성, 복합체 V-의존성 ATP 합성, 숙신산 탈수소효소(SDH) 복합체의 순 방향성 및 미토콘드리아 유래 ROS를 직접 측정하기 위한 분석을 제공합니다. 이러한 분석은 배양된 포유류 세포에서 수행되기 위한 것이지만, 많은 세포 가 생체 내에서 미토콘드리아 기능을 연구하는 데 적용될 수 있습니다.특히, 이 프로토콜에 설명된 분석은 OCR보다 미토콘드리아 기능의 보다 직접적인 측정입니다. 또한, 저산소증에서 미토콘드리아 기능의 측정을 가능하게 하며, 이는 OCR이 지표 측정이 아닌 맥락입니다. 종합하면, 이러한 분석은 고전적인 호흡 측정 실험과 함께 연구자들에게 포유류 세포의 미토콘드리아 기능에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 1.5 mL 튜브</td><td>세포 치료</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 튜브</td><td>세포 치료</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>세포 치료</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>세포 치료</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C4-aspartate</td><td>시그마-알드리치</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-Glutamine</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>세포 처리</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리 튜브</td><td>세포 처리</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 조직 배양 접시</td><td>세포 치료</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6- 디클로로페놀린도페놀</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 카보네이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>안티마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>병 상단 필터 500 mL, 0.22 &micro; m, PES 9 9mm 멤브레인 직경</td><td>세포 치료</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>시그마-알드리치</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>세포 리프터, 양단 평면 및 좁은 블레이드</td><td>세포 치료</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 콜드 트랩</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>완전한 프로테아제 억제제 정제</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>쿨터 카운터 컵</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>데실루비퀴논</td><td>시그마-알드리치</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>인비트로젠</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>무포도당 DMEM</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>글루타민 무함유 DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청</td><td>시그마-알드리치</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 35% 수산화암모늄</td><td>Thermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 아세토니트릴</td><td>시그마-알드리치</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 클로로포름</td><td>시그마-알드리치</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 포름산</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 이소프로판올</td><td>시그마-알드리치</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 MeOH</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td>900688</tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Human Osteosarcome Cell Line 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>이소톤 버퍼</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222,</td><td></td></tr><tr><td>만니톨</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>M4125</td><td></td></tr>, <tr><td>MitoSox, 레드</td><td>, 인비트로겐</td>, <td>M36008</td><td></td></tr>, <tr><td>N-아세틸-L-시스테인</td><td>, 시그마-알드리치,</td><td>A9165</td><td></td></tr>, <tr><td>올리고마이신</td><td>, 시그마-알드리치,</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr>, <tr><td>펜슬린, 스트렙토마이신,</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr>, <tr><td>Potter-Elvehjem 티슈 그라인더, 크기 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate-free DMEM media</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus 질량분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver 인큐베이터</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 Centrivap 벤치탑 진공 농축기</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 버퍼</td><td>Millipore 시그마</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>시그마-알드리치</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu; m 150 x 2.1 mm 분석 컬럼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 가드 키트</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨, 펠릿</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>수당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>Tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Coulter 입자 수 및 크기 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

미토콘드리아 전자 수송 사슬(ETC)의 전자 흐름은 포유류 세포에서 다면적 생합성, 생체 에너지 및 신호 전달 기능을 지원합니다. 산소(O2)는 포유류 ETC에 대한 가장 보편적인 말단 전자 수용체이기 때문에O2 소비율은 미토콘드리아 기능의 프록시로 자주 사용됩니다. 그러나 새로운 연구에 따르면 푸마레이트는 저산소증에서 미토콘드리아 기능을 유지하기 위한 대체 전자 수용체로 사용될 수 있기 때문에 이 매개변수가 항상 미토콘드리아 기능을 나타내는 것은 아닙니다. 이 기사는 연구자들이 O2 소비율과 독립적으로 미토콘드리아 기능을 측정할 수 있도록 하는 일련의 프로토콜을 컴파일합니다. 이러한 분석은 저산소 환경에서 미토콘드리아 기능을 연구할 때 특히 유용합니다. 구체적으로, 우리는 미토콘드리아 ATP 생산, 새로운 피리 미딘 생합성, 복합체 I에 의한 NADH 산화 및 과산화물 생산을 측정하는 방법을 설명합니다. 고전적인 호흡 측정 실험과 함께 이러한 직교하고 경제적인 분석은 연구자들에게 관심 시스템에서 미토콘드리아 기능에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공할 것입니다.

DHODH, 복합체 I 및 복합체 V의 활성은 모두 증식 분석을 사용하여 평가할 수 있습니다. 배양 배지에서 우리딘이 제거되면 세포는 피리미딘 생합성을 위한 새로운 경로에 더 의존하게 됩니다. 따라서, 세포가 우리딘이 없는 배지에서 증식하도록 도전을 받았을 때, 그들은 우리딘을 함유한 배지에서 배양된 세포보다 브레퀴나에 의한 DHODH 활성의 억제에 더 민감하였다(도 6A). 유사하게, 배양 배지로부터의 피루브산의 박탈은 세포를 증식을 위한 복합체 I 활성에 더 의존하게 만든다. 따라서, 세포가 피루브산이 없는 배지에서 증식하도록 도전을 받았을 때, 그들은 피루브산-함유 배지에서 배양된 세포보다 로테논에 의한 복합체 I 활성의 억제에 더 민감하였다(도 6B). 복합체 V 활성은 포도당 대신 갈락토오스를 함유하는 배지에서 증식하도록 세포에 도전함으로써 평가할 수 있습니다. 갈락토오스는 해당과정에서 순 제로 ATP를 생성하므로 이 연료에서 성장하는 세포는 복잡한 V 활성을 통한 미토콘드리아 ATP 합성에 더 의존합니다. 따라서, 갈락토오스-함유 배지에서 증식하는 세포는 글루코스-함유 배지에서 증식하는 세포보다 올리고마이신에 의한 복합체 V 억제에 더 민감하였다 (도 6C).
SDH 활성은 13C5-글루타민 추적을 사용하고 푸마르산염 및 숙신산 동위원소로의 결합을 모니터링하여 측정할 수 있습니다. 비히클-처리된 조건에서, SDH 복합체는 순방향 활성을 선호하였고, 13C4-푸마레이트 내로의 13C4-석시네이트의 혼입은 13C3-석시네이트 내로의 혼입보다 더 높았다 (도 7). 항마이신 처리 조건에서, SDH 복합체는 역활성을 선호했고, 13C3-석시네이트로의 13C3-푸마르산염의 혼입은 13C4-석시네이트를 13C4-푸마르산염으로의 혼입보다 더 컸다(도 7).
미토콘드리아 내부의 슈퍼옥사이드 생성은 슈퍼옥사이드와의 반응 시 2-하이드록시미토에티듐을 생성하는 형광 리포터 MitoSox를 사용하여 측정할 수 있습니다. 이 연구에서, tertbutyl hydrogen peroxide의 존재 하에서 MitoSox로 처리 된 세포는 세포 ROS를 소멸시키는 항산화 제 인 NAC의 첨가에 의해 억제되는 방식으로 2- 하이드 록시 - 미토에 티듐 (2- hydroxy-mitoethidium)의 수치가 더 높았다 (그림 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> 그림 1: 복잡한 V 증식 분석에 대한 기계론적 기초. 해당과정을 통한 포도당과 갈락토오스의 산화. 포도당은 해당 과정에서 순 2 개의 ATP를 생성하는 반면, 갈락토오스는 UTP 합성이 UDP- 갈락토오스에 필요하기 때문에 순 제로 ATP를 산출합니다. 따라서 갈락토오스에서 성장한 세포는 해당과정에서 생성된 ATP가 부족하기 때문에 미토콘드리아 ATP 합성에 더 의존합니다. 약어: GALK = 갈락토키나제; GALT = 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제; PGM1 = 포스포글루코뮤타제 1; GPI = 포도당-6-포스페이트 이성질화효소, UGP = UDP-글루코스 피로포스포릴라제; GALE = UDP-갈락토오스-4-에피머라제; NDK = 뉴클레오티드 디포스페이트 키나아제; UMPK = 우리딘 모노포스페이트 키나아제; HK = 헥소키나제; PFK = 포스포프럭토키나제; 알도 = 알돌라아제; TPI = 트리오오스포스페이트 이성질화효소; GAPDH = 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소; PGK = 포스포글리세레이트 키나아제; PGM = 포스포글루코뮤타제; ENO = 에놀라아제; PK = 피루브산 키나아제. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> 그림 2: 복합체 I 증식 분석에 대한 기계론적 기초. 복합체 I 활성의 억제에 따라 변경되는 대사 경로의 개략도. 고-피루브산 매질에서, 복합체 I 억제는 LDH-매개 NADH 산화를 통해 우회된다. 저 피루브산 배지에서 이러한 적응은 실현 가능성이 낮아 세포가 NADH를 재산화하기 위해 복합체 I 활성에 더 의존하게 만듭니다. 약어: LDH = 젖산 탈수소효소; TCA 사이클 = 트리카르복실산 사이클. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> 그림 3: 13C4-아스파르테이트 추적에 따른 DHODH 반응의 개략도. Brequinar는 디히드로로테이트 산화가 오로테이트로 산화되는 것을 억제하여 UMP의 다운스트림 합성을 방지합니다. 13C4-아스파르테이트는 DHODH 활성을 통해 13C3-UMP에 혼입된다. 약어: OMM = 외부 미토콘드리아 막; IMM = 내부 미토콘드리아 막; DHODH = 디히드로오로테이트 탈수소효소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> 그림 4: 13C5-글루타민 추적을 통한 정방향 및 역방향 복합체 II 활성 측정. 순방향 콤플렉스 II 활성을 측정하기 위해(왼쪽), 13C5-글루타민을 13C4-숙시네이트 및 13C4-푸마레이트로 혼입시키는 것을 모니터링합니다. 역 복합체 II 활성을 측정하기 위해(오른쪽), 13C5-글루타민을 13C3-숙시네이트 및 13C3-푸마레이트에 혼입시키는 것을 모니터링합니다. 약어: SDH = 숙시네이트 탈수소효소; CytC = 시토크롬 C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> 그림 5: MitoSox Red와 과산화물의 반응. MitoSox와 미토콘드리아 과산화물의 반응은 2-OH-MitoE2+를 형성합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> 그림 6: 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 증식 기반 분석 법 (A) ±100ug/mL 우리딘이 함유된 배지에서 DHODH 억제제인 5uM 브레키나로 처리된 143B 골육종 세포의 증식. 데이터는 SEM± 평균입니다. 조건당 N = 3. (B) ±5 mM 피루브산으로 배지에서 복합체 I 억제제인 2 uM 로테논으로 처리된 143B 골육종 세포의 증식. 데이터는 SEM± 평균입니다. 조건당 N = 3. (C) 10mM 포도당 또는 10mM 갈락토오스를 유일한 중심 탄소원으로 하는 배지에서 복합체 V 억제제인 5uM 올리고마이신으로 처리된 143B 골육종 세포의 증식. 데이터는 SEM± 평균입니다. 조건당 N = 3. *는 Graphpad Prism에서 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용한 p &lt; 0.05를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> 그림 7: 복합체 II 활성을 측정하기 위한 13개의 C5-글루타민 추적. DMSO 및 500 nM 안티마이신 A-처리된 Caki1 및 DLD1 세포에서의 숙신산 산화 및 푸마레이트 환원(SDH 역방향). 데이터는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 조건당 N = 3. GraphPad Prism에서 unpaired t-검정을 사용하여 p &lt; 0.05를 나타냅니다. 약어: SDH = 숙신산 산화; SDH 역방향 = 푸마레이트 환원. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> 그림 8: 과산화물을 검출하기 위한 LCMS 기반 MitoSox 분석. Nac tBuOOH의 존재 하에 30분 동안 MitoSox로 처리된 Caki1 세포로부터 분리된 2-OH-Mito E2+ 의 추출된 이온 크로마토그램±. 약어: LCMS = 액체 크로마토그래피-질량 분석법; NAC = N- 아세틸 시스테인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 이 프로토콜에 사용된 시약, 완충액 및 배지의 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

우리의 연구는 미토콘드리아가 대사 스트레스 요인을 감지하고 적응하는 방법에 중점을 둡니다. 주요 대사 스트레스 요인 중 하나는 세포에 산소가 부족할 때 발생하는 저산소증입니다. 우리는 저산소 환경에서 미토콘드리아 기능을 연구하기 위해 더 나은 분석법을 개발하고 있습니다.세포 및 조직 대사 산물 수준을 연구하기 위해 고해상도 질량 분석법이 사용되었습니다. 우리는 안정 동위원소 추적 연구를 사용하여 특정 대사 산물의 운명을 추적하고 건강하고 병든 포유류 생리학과 관련된 새로운 대사 경로를 밝혔습니다. 그룹은 포유류 미토콘드리아가 저산소 환경에서 중요한 기능을 유지할 수 있음을 발견했습니다.기계적으로, 그들은 전자 수송 사슬의 대체 전자 홀로 푸마르산염을 사용합니다. 이 프로토콜은 연구자들이 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 더 잘 평가하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 분석을 컴파일합니다. 중요하게도, 이러한 프로토콜은 저산소증에서 미토콘드리아 기능을 연구하는 데 사용될 수 있습니다., 고전적인 호흡 측정 실험으로는 충분하지 않기 때문입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을...

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

샘플 간의 미토콘드리아 막 전위를 비교하면 세포 상태에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 형광을 사용하여 미토콘드리아를 분리하고 억제제 및 언커플러에 대한 반응을 평가하기 위한 자세한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜의 방법과 유용성은 세포 배양 및 세포 스트레스의 동물 모델을 사용하여 설명됩니다.

분리 및 배양 세포 및 마우스 조직에서 미토콘드리아의 기능적 분석

제시된 방법은 최소한의 마우스 골격근에서 분리된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석 모음의 수행을 위한 단계별 지침을 제공합니다. 이러한 분석은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 산소 소비량의 기계론적 변화/적응을 측정할 수 있습니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

우리는 신선한 종양 균질화에서 미토콘드리아 산화 인산화 및 전자 전달 용량을 평가하기 위한 실용적인 프로토콜 및 분석 접근법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 암 개시, 진행 및 치료 반응에 기여하는 다양한 미토콘드리아 기능을 조사하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다.

절제된 고형 종양 균질화의 미토콘드리아 기능의 분석 적 결정

여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

프로토콜은 tRNA (UUU)의 생산 및 효소 TcdA와 복합체로 된 tRNA (UUU)의 분석을 아가로 오스 겔 지연 분석법을 통해 제시합니다.

단백질 분석을위한 Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA 기능

배우세요 저산소 환경에서 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 측정하는 산소 비의존적 분석법을. 안정 동위원소 추적과 고분해능 질량분석을 활용하여 대사 스트레스 적응 메커니즘을 규명하고 세포 에너지 대사 연구에 활용할 수 있습니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

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