Name: 비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 학습하세요 비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석 방법을 통해 259명의 환자에서 유전자 변이와 융합을 신속하게 검출하는 기술을 익히세요. 이 워크플로우는 조직 소모를 최소화하면서 정밀 의료를 위한 신속한 진단을 가능하게 합니다.

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Thermo Fisher Scientific의 장치와 재료를 사용할 수 있는 기회를 제공해 주셔서 감사합니다.

모든 절차는 지역 윤리 위원회(Human Research Ethics Committee, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothèque BB-0033-00025)의 승인을 받았습니다. 샘플 및 생성된 데이터를 사용하기 위해 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 모든 샘플은 2022년 9월 20일부터 1월 31일까지 LPCE(프랑스 니스)에서 NS-NSCLC 진단을 받은 환자로부터 의료의 일환으로 획득했습니다.
1. 자동 정제 기기(API)를 사용하여 FFPE DNA 및 RNA 샘플 준비(처리 시간: 5시간 15분)
<ol><li>기기에서 평탄화를 실행합니다.<ol><li>계측기의 전원을 켜고 사용자 이름과 암호(자료 표)로 로그인합니다. Run(실행), Add Plan(계획 추가)을 차례로 클릭하고 실행 계획에 이름을 지정하여 정화 실행 계획을 작성하십시오.</li>
		<li>그런 다음 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플에서 DNA 및 RNA를 순차적으로 정제하기 위한 적절한 정제 키트 및 프로토콜을 선택합니다. 정제 후 정량 분석이 가능합니다.</li>
		<li>드롭다운 목록에서 원하는 용리 부피(50μL)를 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다. 추출할 샘플 수를 선택합니다.</li>
		<li>그런 다음 각 샘플을 선택하고 편집을 클릭하고 샘플 ID를 입력한 다음 저장을 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>GPI를 사용한 FFPE DNA 및 RNA 시료 사전 분석<ol><li>FFPE 조직 샘플(마이크로톰이 있는 10μm의 절단 섹션 4개)을 준비하거나 FFPE 블록에서 직접 거시해부를 수행합니다. 각 FFPE 조직 샘플을 분리되고 식별된 FFPE 샘플 처리 튜브에 넣습니다(재료 표).</li>
		<li>2000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 튜브 바닥의 조직을 수집합니다.</li>
		<li>핵산 정제 키트에서 준비한 프로테아제 분해 마스터 믹스를 각 FFPE 시료 처리 튜브에 추가하고 60°C에서 최소 60분 동안 배양합니다(재료 표). 샘플을 90°C에서 60분 동안 배양합니다.</li>
		<li>배양 후 샘플을 실온(RT)에서 5분 동안 식힙니다.</li>
		<li>각 FFPE 시료 처리 튜브에 대해 내부 튜브를 들어 올리고 왼쪽으로 돌려 잠근 다음 2000 x g 에서 10분 동안 시료를 원심분리합니다.</li>
		<li>우회전하여 내부 튜브의 잠금을 해제하고 외부 튜브에서 분리한 다음 폐기하십시오. API에 적재될 때까지 외부 튜브의 샘플을 얼음에 보관하십시오.</li>
		<li>DNase 분해 마스터 믹스를 준비하고 미리 채워진 FFPE DNA 및 RNA 정제 플레이트 2에 로드합니다. 그런 다음 준비된 샘플을 FFPE DNA 및 RNA 정제 플레이트 1(재료 표)에 로드합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>API에서 정제 실행을 시작합니다.<ol><li>API 화면에서 Run(실행)을 클릭하고 Run Plan(실행 계획)을 선택한 후 Next(다음)를 클릭합니다.</li>
		<li>화면 표시에 따라 정제 실행에 필요한 소모품 및 시약과 함께 API를 로드합니다(재료 표).</li>
		<li>모든 시약이 로드되면 다음을 클릭합니다. API 도어를 닫고 시작을 클릭합니다.</li>
		<li>실행이 끝나면 터치스크린에서 « 언로드(unload) » 를 클릭하고 정제된 샘플 DNA 및 RNA가 포함된 48웰 핵산 아카이브 플레이트를 즉시 제거합니다.</li>
		<li>정량 분석 결과를 내보냅니다. 플레이트를 밀봉하고 정제된 샘플을 -80°C에서 보관합니다. 96웰 플레이트를 분석할 시퀀서로 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플을 만들고 실행을 만듭니다.<ol><li>소프트웨어를 열고 로그인한 다음 메뉴 표시줄에서 Samples 를 선택하고 Create Sample을 클릭합니다.</li>
		<li>샘플의 이름, 성별 및 종양 세포의 비율을 입력하고 필요한 경우 필수 필드와 선택 필드를 작성합니다.</li>
		<li>세부 정보를 저장합니다(종양 세포의 성별과 비율은 복제 수 변이체[CNV]를 분석하는 데 중요합니다).</li>
		<li>메뉴 모음에서 Runs and Nucleic Acid to Result(실행 및 핵산)를 선택하여 결과를 선택합니다.</li>
		<li>설정 단계에서 실행 이름을 입력합니다. 다음을 클릭합니다.</li>
		<li>Assay(분석) 단계에서 assay(분석)를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.</li>
		<li>샘플(Samples) 단계에서 분석과 함께 실행할 샘플을 선택합니다.</li>
		<li>그런 다음 Selected Assay(선택한 어세이 ) 창에서 Assign(할당)을 클릭합니다. 다음을 클릭합니다.</li>
		<li>Review 샘플 입력 플레이트의 샘플 위치. 다음을 클릭합니다.</li>
		<li>실행 계획 요약을 검토한 후 Save & Print 또는 Save를 검토합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 시퀀서의 자동 NGS (처리 시간 : 30 분)
<ol><li>샘플 플레이트를 로드합니다. 알림: 최적 핵산 농도는 0.5ng/μL입니다. 검증된 핵산 농도 범위는 0.33-1ng/μL입니다. DNA 및 RNA의 경우 실험실에서 1ng/μL 농도를 검증했습니다.<ol><li>시퀀서에는 총 부피가 20μL가 필요합니다. 샘플 로딩을 위한 충분한 부피가 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>양성 대조군(DNA 및 RNA) 및 NTC(DNA 및 RNA)를 추출하지 않고 정제 기기의 1단계에 추가합니다. 각 실행에 대해 DNA 및 RNA 제어를 사용하여 실행을 검증하고 사용된 배치를 검증합니다. API 실행이 끝날 때 플레이트에 DNA 및 RNA 컨트롤을 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시퀀서를 로드하고 실행을 시작합니다.<ol><li>냉장고나 냉동고의 상자에서 모든 시약을 꺼내고 최소 30분(재료 표)에서 최대 12시간 동안 실온에서 해동합니다.</li>
		<li>실험실에서는 현장 교육 중에 공급업체가 제공한 조언에 따라 시퀀서를 항상 켜진 상태로 유지하십시오. 시스템에 로그인합니다.</li>
		<li>접착 PCR 플레이트 호일 시트로 플레이트를 밀봉한 후 샘플이 포함된 정제 기기에서 플레이트를 로드합니다(재료 표).</li>
		<li>데크에 모든 소모품을 설치합니다. 시퀀서는 강조 표시된 위치에 필요한 각 소모품을 로드하기 위한 단계별 지침을 제공합니다(재료 표).</li>
		<li>Strip 3-HD의 튜브 2에 침전물이 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 튜브를 튕기거나 스트립을 부드럽게 소용돌이쳐 침전물을 녹입니다.</li>
		<li>스트립 1과 스트립 3에는 마그네틱 비드가 포함되어 있습니다. 이 단계는 매우 중요합니다: 비드가 다시 매달려 있는지 확인하십시오. 튜브 상부에 비드가 남아 있지 않아야 합니다.</li>
		<li>스트립을 거꾸로 뒤집고 3-4회 뒤집어 구슬을 제거합니다. 스트립 씰이 위쪽을 향하도록 스트립의 한쪽 끝을 잡습니다. 그런 다음 빠른 원심 암 움직임을 사용하여 스트립을 아래로 빠르게 휘두르고 손목을 세게 튕겨 마무리합니다.</li>
		<li>300 x g 에서 15초 동안 원심분리기. 필요한 경우 반복합니다. 어댑터와 스트립 홀더로 스트립을 원심분리하여 스트립 상부의 볼 잔류물과 관련하여 무작위로 관찰되는 고장을 최소화합니다.</li>
		<li>시스템을 닫고 다음을 클릭합니다. 시퀀싱 시약 베이 도어를 설치합니다(재료 표). 문을 닫으세요. 시퀀서가 자동으로 실행을 시작합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>청소<ol><li>실행 후 정리하려면 실행이 완료되면 다음을 클릭합니다.</li>
		<li>문이 연속적으로 열립니다. 화면의 지시에 따라 폐기물을 비우고 모든 소모품을 제거하십시오. 다음을 클릭합니다.</li>
		<li>완료되면 데크를 닫고 다음을 클릭합니다. 2분 UV 클리닝이 시작됩니다. 시퀀서가 새 실행을 시작할 준비가 되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 통합 소프트웨어를 이용한 결과 분석(환자별 분석 시간[샘플 ADN 및 ARN]: 15분)
참고: 이 기술은 프랑스 인증 위원회(COFRAC) ISO 15189(https://www.cofrac.fr/)의 인증을 받았습니다.
<ol><li>데이터 및 결과<ol><li>결과 메뉴에서 실행 결과 또는 샘플 결과를 선택합니다. 결과/실행 결과 화면에 모든 실행이 나열됩니다.</li>
		<li>열 머리글을 필터링하여 결과 목록을 검색합니다.</li>
		<li>Results(결과)를 클릭하고 Sample Results(샘플 결과)를 클릭합니다. 그런 다음 샘플 이름 열에서 관심 있는 샘플의 이름을 클릭하여 고유한 샘플에 대한 염기서열 분석 결과를 확인합니다.</li>
		<li>화면 왼쪽 상단에 있는 열을 클릭하거나 표에서 열을 선택 취소합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>QC 결과와 앰플리콘 커버리지를 확인합니다.<ol><li>결과 화면에서 QC 탭을 클릭합니다.</li>
		<li>DNA의 경우 복제 수 변이체(CNV) 분석을 검증하기 위해 절대 쌍별 차이(MAPD)의 중앙값이 0에서 0.5 사이인지 확인합니다. 매핑된 읽기는 150만 개보다 커야 합니다.</li>
		<li>RNA의 경우 매핑된 판독값이 150,000에서 400,000 사이인지 확인합니다. 그 아래에는 거짓 음성의 위험이 있고 그 이상에는 거짓 양성의 위험이 있습니다.</li>
		<li>샘플 이름을 클릭하여 Key Findings(주요 결과 ) 탭을 엽니다.</li>
		<li>amplicon 커버리지 그래프(amplicon Coverage Graphs)로 스크롤합니다.</li>
		<li>커버리지 그래프를 검토합니다. 앰플리콘 커버리지에 대한 최소 임계값을 정의하십시오(공급자가 제공하지 않음). 범위와 임계값을 정의하려면 대조군과 WT(야생형) 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 하나 이상의 선택된 돌연변이에 대한 앰플리콘 커버리지의 가장 작은 값을 관찰합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이형 상품 결과를 봅니다.<ol><li>데이터를 표 형식으로 내보내려면 화면 오른쪽 상단에 있는 내보내기 를 클릭합니다.</li>
		<li>단일 뉴클레오티드 변이체/삽입-결실 변이체(SNV/INDEL) 결과를 보려면 Variants 탭을 클릭한 다음 SNVs/Indel을 클릭합니다. Edit Filters(필터 편집 )를 클릭하고 No Filter(필터 없음)를 선택합니다. 참고: 민감도 임계값은 INCA (프랑스 국립 암 연구소) 그룹(https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes)의 권장 사항에 따라 5%로 정의되었습니다.</li>
		<li>Fusion 결과 보기 및 RNA Exon Variants 보기: Variants 탭을 클릭한 다음 Fusions를 클릭합니다.</li>
		<li>오른쪽 상단에서 시각화 및 RNA 엑손 변이체를 클릭한 다음 RNA 엑손 변이체 플롯을 검토합니다.</li>
		<li>이 키트를 사용하면 EGFR, MET 및 AR 유전자의 엑손 스키핑을 검출할 수 있습니다. 시각화를 클릭합니다. 분석하기가 더 쉽습니다.</li>
		<li>RNA 엑손 타일 융합 불균형 보기: Variants 탭을 클릭한 다음 Fusions를 클릭합니다.</li>
		<li>오른쪽 상단에서 시각화 및 RNA 엑손 타일 융합 불균형을 클릭한 다음 RNA 엑손 타일 융합 불균형 플롯을 검토합니다. 불균형 융합은 알려진 파트너와 패널에서 다루지 않는 파트너 간의 융합입니다.</li>
		<li>CNV 결과 보기: 변형 탭에서 CNV를 클릭하여 데이터를 표시합니다. 참고: 성별 샘플의 준비 및 샘플의 종양 세포 비율을 알려줌으로써 CNV 결과에 주의를 기울일 필요가 있습니다. AR 유전자는 X 염색체에 의해서만 운반됩니다. 성별을 명시하지 않으면 남성 성별이 손실되어 남성 환자에서 위양성 결과가 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플러그인 결과를 검토합니다.<ol><li>커버리지 분석 플러그인 결과 검토: 오른쪽 상단에서 을 클릭하고 파일 다운로드를 선택합니다.</li>
		<li>커버리지 분석 플러그인은 커버리지 분석 보고서를 생성합니다.</li>
		<li>분자 커버리지 분석 플러그인 결과 검토: 오른쪽 상단에서 을 클릭하고 다운로드 파일을 선택합니다. 이 분석은 모든 앰플리콘이 덮여 있는지 확인하고 소프트웨어에서 제공하는 복제 수 변이체(CNV) 결과를 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 메트릭 및 실행 보고서 보기<ol><li>Run Summary(실행 요약)에서 Run Report(보고서 실행) 탭을 클릭합니다.</li>
		<li>Run Report를 보려면 드롭다운 메뉴에서 Select Sample 옵션을 선택합니다.</li>
		<li>분석 메트릭 및 실행 보고서: 화면 상단에서 염기서열분석 메트릭을 찾은 다음 Run Samples 테이블에서 샘플별 메트릭을 찾습니다. 참고: CSA(고객 지원 아카이브) 파일의 정보는 결과 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있지만 직접 분석할 수는 없습니다. CSA 파일은 전체 실행 데이터의 데이터를 요약하고 실행이 실패한 경우 문제의 원인을 강조 표시합니다.</li>
		<li>실행 보고서 다운로드하기: 보고서 탭을 클릭하십시오.</li>
		<li>Download Report(보고서 다운로드)를 클릭하여 실행 보고서 요약을 PDF 형식으로 다운로드합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이형 상품 보고서를 생성합니다.<ol><li>설정 단계에서 보고서 생성을 활성화하여 실행의 데이터 분석 중에 각 샘플에 대한 변형 보고서를 자동으로 생성합니다.</li>
		<li>샘플에 대한 이형 보고서를 생성한 후 시스템은 다음 두 위치에서 보고서를 사용할 수 있도록 합니다. 먼저 결과/샘플 결과 화면에서 링크를 사용할 수 있습니다. 링크를 클릭하여 PDF를 다운로드합니다.</li>
		<li>그런 다음 보고서 탭의 Variant 보고서 창으로 이동하여 보고서 다운로드 버튼을 클릭합니다. 변형 보고서에 전자 또는 수동으로 서명합니다. 참고: 전자 서명된 보고서에는 Sample Results(샘플 결과) 화면의 샘플 이름 뒤에 (Sign off)가 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

비편평 비소세포폐암 환자의 게놈 변화 평가

<ol><li>Howlader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+advances+in+lung-cancer+treatment+on+population+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of advances in lung-cancer treatment on population mortality.</a> New England Journal of Medicine. 383 (7), 640-649 (2020).</li>
<li>Melosky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rapidly+evolving+landscape+of+novel+targeted+therapies+in+advanced+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">The rapidly evolving landscape of novel targeted therapies in advanced non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 160, 136-151 (2021).</li>
<li>Hanna, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+for+stage+IV+non-small-cell+lung+cancer+with+driver+alterations%3A+ASCO+and+OH+%28CCO%29+joint+guideline+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Therapy for stage IV non-small-cell lung cancer with driver alterations: ASCO and OH (CCO) joint guideline update.</a> Journal of Clinical Oncology. 39 (9), 1040-1091 (2021).</li>
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<li>Mosele, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+use+of+next-generation+sequencing+%28NGS%29+for+patients+with+metastatic+cancers%3A+a+report+from+the+ESMO+precision+medicine+working+group%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO precision medicine working group.</a> Annals of Oncology. 31 (11), 1491-1505 (2020).</li>
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<li>Li, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trastuzumab+deruxtecan+in+HER2+-mutant+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Trastuzumab deruxtecan in HER2 -mutant non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 386 (3), 241-251 (2022).</li>
<li>Bontoux, C., Hofman, V., Brest, P., Ilié, M., Mograbi, B., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+practice+assessment+of+KRAS+status+in+NSCLC+patients%3A+A+new+challenge+for+the+thoracic+pathologist+is+right+around+the+corner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Daily practice assessment of KRAS status in NSCLC patients: A new challenge for the thoracic pathologist is right around the corner.</a> Cancers. 14 (7), 1628(2022).</li>
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<li>Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+evaluating+predictive+biomarkers+using+small+biopsy+tissue+samples+and+liquid+biopsies+from+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">The challenges of evaluating predictive biomarkers using small biopsy tissue samples and liquid biopsies from non-small cell lung cancer patients.</a> Journal of Thoracic Disease. 11, S57-S64 (2019).</li>
<li>Ilié, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+up+an+ultra-fast+next-generation+sequencing+approach+as+reflex+testing+at+diagnosis+of+non-squamous+non-small+cell+lung+cancer%3B+experience+of+a+single+center+%28LPCE%2C+Nice%2C+France%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Setting up an ultra-fast next-generation sequencing approach as reflex testing at diagnosis of non-squamous non-small cell lung cancer; experience of a single center (LPCE, Nice, France).</a> Cancers. 14 (9), 2258(2022).</li>
<li>Zacharias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflex+testing+in+non-small+cell+lung+carcinoma+using+DNA-and+RNA-based+next-generation+sequencing-a+single-center+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reflex testing in non-small cell lung carcinoma using DNA-and RNA-based next-generation sequencing-a single-center experience.</a> Translational Lung Cancer Research. 10 (11), 4221-4234 (2021).</li>
<li>Miller, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+reflex+testing+using+focused+nextgeneration+sequencing+for+management+of+patients+with+advanced+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of reflex testing using focused nextgeneration sequencing for management of patients with advanced lung adenocarcinoma.</a> Journal of Clinical Pathology. 71 (12), 1108-1115 (2018).</li>
<li>Al-Ahmadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+advanced+non-small+cell+lung+cancer%3A+utilization+based+on+race+and+impact+on+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of advanced non-small cell lung cancer: utilization based on race and impact on survival.</a> Clinical Lung Cancer. 22 (1), 16.e1-22.e1 (2021).</li>
<li>Kim, J. H., Yoon, S., Lee, D. H., Jang, S. J., Chun, S. M., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-world+utility+of+next-generation+sequencing+for+targeted+gene+analysis+and+its+application+to+treatment+in+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-world utility of next-generation sequencing for targeted gene analysis and its application to treatment in lung adenocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 10 (10), 3197-3204 (2021).</li>
<li>Sheffield, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+care+molecular+testing%3A+Community-based+rapid+next-generation+sequencing+to+support+cancer+care%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology%22%5BJournal%5D)">Point of care molecular testing: Community-based rapid next-generation sequencing to support cancer care.</a> Current Oncology. 29 (3), 1326-1334 (2022).</li>
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<li>Rosas, D., Raez, L. E., Russo, A., Rolfo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+gene+%28Nrg1%29.+A+potentially+new+targetable+alteration+for+the+treatment+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 gene (Nrg1). A potentially new targetable alteration for the treatment of lung cancer.</a> Cancers. 13 (20), 5038(2021).</li>
<li>Shapiro, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phase+1+study+of+RO6870810%2C+a+novel+bromodomain+and+extra-terminal+protein+inhibitor%2C+in+patients+with+NUT+carcinoma%2C+other+solid+tumours%2C+or+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A Phase 1 study of RO6870810, a novel bromodomain and extra-terminal protein inhibitor, in patients with NUT carcinoma, other solid tumours, or diffuse large B-cell lymphoma.</a> British Journal of Cancer. 124 (4), 744-753 (2021).</li>
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<li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+value+and+cost-effectiveness+of+next-generation+sequencing-based+testing+for+treatment+of+patients+with+advanced%2Fmetastatic+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic value and cost-effectiveness of next-generation sequencing-based testing for treatment of patients with advanced/metastatic non-squamous non-small-cell lung cancer in the United States.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 24 (8), 901-914 (2022).</li>
<li>Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., Li, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next+generation+sequencing+in+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Application of next generation sequencing in laboratory medicine.</a> Annals of Laboratory Medicine. 41 (1), 25-43 (2020).</li>
<li>Bruno, R., Fontanini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+gene+fusion+analysis+in+lung+cancer%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for gene fusion analysis in lung cancer: A literature review.</a> Diagnostics. 10 (8), 521(2020).</li>
<li>Hofman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+gene+fusion+assessment+for+non-squamous+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22JTO+Clinical+and+Research+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast gene fusion assessment for non-squamous non-small cell lung cancer.</a> JTO Clinical and Research Reports. 4 (2), 100457(2022).</li>
<li>Horgan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine+perspective+identifying+the+steps+required+to+effectively+implement+next-generation+sequencing+in+oncology+at+a+national+level+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Personalized+Medicine%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine perspective identifying the steps required to effectively implement next-generation sequencing in oncology at a national level in Europe.</a> Journal of Personalized Medicine. 12 (1), 72(2022).</li>
<li>Cohen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+mutation+and+fusion+detection+in+NSCLC+by+sequential+DNA+and+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Optimizing mutation and fusion detection in NSCLC by sequential DNA and RNA sequencing.</a> Journal of Thoracic Oncology. 15 (6), 1000-1014 (2020).</li>
<li>Goswami, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+factors+affecting+the+success+of+next-generation+sequencing+testing+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Identification of factors affecting the success of next-generation sequencing testing in solid tumors.</a> American Journal of Clinical Pathology. 145 (2), 222-237 (2016).</li>
<li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+Lung+Cancer+Molecular+Pathology%3A+How+to+Limit+them+in+Routine+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in Lung Cancer Molecular Pathology: How to Limit them in Routine Practice.</a> Current Medicinal Chemistry. 19 (16), 2638-2651 (2012).</li>
</ol>

Christophe Bontoux는 유료 연사 활동에 참여하고 Thermo Fisher Scientific의 혜택을 받습니다. Paul Hofman은 유료 연사 활동에 참여하며 Thermo Fisher Scientific으로부터 혜택과 자금을 지원받습니다.

모든 단계의 진단 시 분자 변화 평가를 위한 반사 검사로서 초고속 앰플리콘 기반 NGS 접근법의 개발은 NS-NSCLC 5,22,23에서 지침에서 권장하는 모든 바이오마커 및 새로운 바이오마커를 검출하기 위한 최적의 옵션입니다. 순차적 방법(IHC, PCR, FISH)은 특정 유전자에만 초점을 맞추고 조직 물질 고갈을 초래할 수 있지만, 이 NGS 워크플로우는 적은 양의 핵산(본 연구에 따르면 각 DNA 및 RNA 염기서열분석에 대해 최소 13ng)으로도 돌연변이, 융합 및 증폭을 포함한 50개 유전자의 상태에 대한 특이적이고 민감한 평가를 가능하게 합니다.
또한 이 방법은 NS-NSCLC 환자 관리를 위한 빠르고 적절한 결과를 제공합니다. 맞춤형 접근법에 비해 종양 단계에 따라 분석할 사례를 초기에 선택할 필요가...

지난 10년 동안 표적 및 면역 치료제의 개발로 비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC)의 전체 생존율(OS)이 크게 증가했습니다1,2. 이와 관련하여, NS-NSCLC를 치료할 때 분석해야 하는 필수 유전자 및 분자 표적의 수는 지난 몇 년 동안 증가했습니다 3,4.
현재 국제 가이드라인은 진행성 NS-NSCLC 5 진단 시 EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET 및 MET를 검사할 것을 권장하고있다. 더욱이 최근 신약이 임상시험에서 매우 유망한 결과를 내놓으면서 BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 및 NUT 6,7,8,9와 함께 KRAS 및 HER2와 같은 여러 추가 유전자에서 추가 게놈 변형이 곧 스크리닝될 것입니다. 또한 STK11, KEAP1 및 TP53과 같은 다양한 관련 유전자의 상태는 일부 표적 치료제 및/또는 면역관문억제제(ICI)10,11,12에 대한 반응 또는 내성을 더 잘 예측하는 데 큰 도움이 될 수 있습니다.
중요한 것은 신중한 임상 의사 결정을 보장하기 위해 분자 변화를 큰 지체 없이 보고해야 한다는 것입니다. 종양의 분자 특성 분석이 없으면 EGFR 돌연변이 또는 유전자 융합과 같은 실행 가능한 변화가 있는 환자에서 화학요법 반응이 제한되기 때문에 면역요법 유무에 관계없이 화학요법과 같은 비표적 요법의 시작으로 이어질 수 있으며, 이는 차선의 치료 전략으로 이어질 수 있다13.
더욱이, 신보조요법 및/또는 보조요법 환경에서 표적치료제/면역요법의 현재 개발은 ICI가 EGFR 및 ALK14에 대해 야생형 종양에만 투여되어야 하기 때문에 초기 단계의 NS-NSCLC에서 적어도 EGFR 및 ALK 변형을 체계적으로 찾을 수 있습니다. EGFR 돌연변이 NS-NSCLC15에서 오시머티닙(osimertinib, 3세대 EGFR 티로신 키나아제 억제제)을 보조요법으로 사용할 수 있기 때문에 초기 단계의 NS-NSCLC에서 EGFR 돌연변이의 존재 여부를 검사하는 것도 필수입니다.
NS-NSCLC 환자에서 다양한 표적 치료제 및/또는 면역 요법에 대한 반응을 예측할 때 다양한 바이오마커를 평가하는 전략은 빠르게 진행되고 있으며, 이로 인해 이러한 바이오마커를 순차적으로 식별하기가 어렵습니다 3,16. 이와 관련하여 차세대 염기서열분석(NGS)은 이제 NS-NSCLC 5,17에서 유전자 변형에 대한 고처리량 병렬 평가를 위한 최적의 접근 방식입니다.
그러나 NGS 워크플로우는 마스터하기 어려울 수 있으며 더 긴 TAT18,19까지 수행될 수 있습니다. 따라서 많은 센터가 여전히 순차적 접근법(면역조직화학(IHC), 형광 in situ hybridization(FISH) 및/또는 표적 염기서열분석)을 수행합니다. 그러나 이 전략은 샘플 크기가 작은 경우, 그리고 무엇보다도 NS-NSCLC20에서 테스트해야 하는 실행 가능한 돌연변이의 수가 증가하기 때문에 제한적입니다. 따라서 유전자 변형을 신속하게 평가할 수 있는 초고속의 간단한 검사 방법은 최적의 임상 의사 결정을 위해 점점 더 중요해지고 있습니다. 더욱이, 분자 검사를 위한 승인 및 공인된 시스템은 특정 표적 치료제의 처방을 위해 의무화되고 있습니다.
여기에서는 프랑스 니스 대학병원의 임상 및 실험 병리학 실험실(LPCE)에서 사용되고 프랑스 인증 위원회(COFRAC)(https://www.cofrac.fr/)의 ISO 15189 표준에 따라 인증된 NS-NSCLC의 분자 검사를 위한 초고속 자동 앰플리콘 기반 DNA/RNA NGS 분석에 대해 설명합니다. COFRAC는 실험실이 실험실에서 수행한 패널을 사용하여 시퀀서의 자동화된 NGS에서 분자 분석의 테스트/보정 활동에 대한 표준 ISO 15189 및 COFRAC 적용 규칙의 요구 사항을 충족함을 인증합니다. 공인된 국제 표준 ISO 15189에 따른 인증은 정의된 범위에 대한 실험실의 기술적 역량과 이 실험실에서 적절한 관리 시스템의 적절한 작동을 입증합니다. 조직 생검 샘플 준비부터 보고서 획득에 이르기까지 이 워크플로우의 이점과 한계에 대해 논의합니다.

<table><tbody><tr><td>96 웰 하드 쉘 플레이트 클리어</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>4483354</td><td></td></tr><tr><td>접착제 PCR 플레이트 호일</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>AutoLys M 튜브&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>A38738</td><td>FFPE 시료 처리 튜브</td></tr><tr><td>Genexus 바코드 1-32 HD</td><td>Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>A40261</td><td></td></tr><tr><td>Genexus GX5 칩 및 Genexus 커플러</td><td>Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>A40269</td><td></td></tr><tr><td>Genexus 피펫 팁</td><td>Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>A40266</td><td></td></tr><tr><td>Genexus 정제 기기</td><td>Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>A48148</td><td>자동 정제 기기(API)</td></tr><tr><td>Genexus 염기서열분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>A40271</td><td></td></tr><tr><td>Genexus 템플릿 스트립 3-GX5 및 4</td><td>Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>A40263</td><td></td></tr><tr><td>Genexus 통합 시퀀서</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)</td><td>A45727</td><td></td></tr><tr><td>이온 토렌트&nbsp; Genexus FFPE DNA/RNA 정제 콤보 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>A45539</td><td></td></tr><tr><td>Oncomine&nbsp; 정밀 분석 GX(OPA) 패널(스트립 1 및 2-HD 포함)</td><td>Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>A46291</td><td></td></tr></tbody></table>

비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석

Ultra-Fast Amplicon-Based Next-Generation Sequencing in Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer

비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC) 환자의 표적 치료를 위해 검사해야 하는 분자 변형의 수는 지난 몇 년 동안 크게 증가했습니다. 진행성 또는 전이성 NS-NSCLC 환자의 최적 치료를 위해서는 분자 이상 검출이 필수적이며, 이를 통해 표적 치료제를 투여하여 전체 생존율을 개선할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 종양은 새로운 치료법을 사용하여 잠재적으로 표적화할 수 있는 내성 기전을 발달시킵니다. 일부 분자 변화는 치료 반응을 조절할 수도 있습니다. NS-NSCLC의 분자 특성 분석은 국제 지침에서 권장하는 대로 영업일 기준 10일 이내에 짧은 처리 시간(TAT) 내에 수행되어야 합니다. 또한 게놈 분석을 위한 조직 생검의 기원은 다양하며 덜 침습적인 방법 및 프로토콜의 개발로 크기가 지속적으로 감소하고 있습니다. 결과적으로, 병리학자들은 효율적이고 신속한 진단 전략을 유지하면서 효과적인 분자 기술을 수행해야 하는 과제에 직면해 있습니다. 여기에서는 NS-NSCLC 환자의 진단 시 일상 진료에 사용되는 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석(NGS) 워크플로우에 대해 설명합니다. 우리는 이 시스템이 적절한 TAT에서 흉부 종양학의 정밀 의학에 사용되는 현재 분자 표적을 식별할 수 있음을 보여주었습니다.

최근 간행물21에 자세히 설명된 여기에 제시된 절차를 사용하여 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열 분석 접근법을 사용하여 NS-NSCLC 환자의 진단을 위해 일상적으로 수행되는 임상 실습에서 반사 검사로서 분자 변화를 평가하기 위한 최적의 워크플로우를 개발했습니다. 이 방법의 분자 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 패널에 포함된 유전자 목록은 보충 그림 1에 나와 있습니다.
분자 분석은 NS-NSCLC 환자 259명을 대상으로 수행되었습니다. 여기에는 기관지 생검 153건, 경흉부 생검 47건, 수술 검체 39건, 흉막 삼출액 13건과 EBUS 7건에서 채취한 25개의 세포블록이 포함되었다(표 1). KRAS (25.4%), EGFR (18.2%), BRAF (6.3%), ERBB2 ...

비편평 비소세포폐암(NS-NSCLC) 치료 관리를 위해 검사해야 하는 분자 바이오마커가 증가함에 따라 빠르고 신뢰할 수 있는 분자 검출 방법의 개발이 촉진되었습니다. 초고속 차세대 염기서열분석(NGS) 접근법을 사용하여 NS-NSCLC 환자에 대한 게놈 변형 평가를 위한 워크플로우를 설명합니다.

The number of molecular alterations to be tested for targeted therapy of non-squamous non-small cell lung cancer (NS-NSCLC) patients has significantly ...

오늘날 비소세포폐암에 대한 표적 치료는 여러 게놈 변이를 신속하게 검출해야 합니다. 따라서 흉부 생검은 크기가 작고 종양 세포가 거의 없는 경우가 많기 때문에 최적의 치료를 위해 매우 중요합니다. 따라서 우리는 병리학 실험실에서 일상적인 비소세포폐암 진단을 위해 구현되는 초고속 차세대 염기서열분석 워크플로우를 제시합니다.현재 다양한 패널 크기를 사용하는 표적 NGS, RT-PCR을 사용한 하나의 유전자 염기서열 분석, 디지털 PCR, 형광 in situ hybridization 및 면역조직화학은 분자 변형을 검출하는 데 사용되는 다양한 방법입니다. 그러나 이러한 방법의 대부분은 시간과 조직 재료를 소모하여 진단이 지연되고 조직 활동의 위험이 있을 수 있습니다. 문제는 여러 분자 변형을 효율적으로 검출하는 동시에 재료를 절약하고 빠른 진단에 답하는 것입니다.이 워크플로우는 흉부 종양 전문의에게 조직학적 진단, PD-L1 상태 및 표적 유전체 이상을 포함한 포괄적인 종양 정보를 제공합니다. 최적의 치료법 선택을 위한 신속한 치료 의사 결정이 가능합니다. 당사의 프로토콜은 ESMO, NCCN 및 ASCO 권장 사항을 기반으로 흉부 종양학의 모든 주요 분자 표적을 식별하고, 작은 샘플 크기와 제한된 DNA/RNA에서도 적시에 결과를 제공합니다.따라서 자동화 시스템은 단 3시간의 습식 실험실 조작으로 기술자의 작업량을 줄였습니다. 우리는 향후 조직 및 혈장 샘플에 대한 대형 NGS 패널을 개발하여 종양의 신속하고 포괄적인 게놈 프로파일링 특성 분석에 집중하는 것을 목표로 합니다. 그러나 큰 패널을 사용하여 작은 샘플 크기와 세포학적 샘플에서 수많은 분자 변화를 검출하기 위한 전략 강화가 시급히 필요합니다.

ultra-fast-amplicon-based-next-generation-sequencing-non-squamous-non

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 원고는 두 개의 차세대 염기서열분석 패널에 대한 임상 프로토콜을 설명합니다. 한 패널은 혈액학적 악성 종양을 조사하고 다른 패널은 고형 종양에서 일반적으로 돌연변이가 발생하는 유전자를 대상으로 합니다. 인간 악성 종양에서 드라이버 돌연변이의 분자 분류는 귀중한 예후 및 예측 정보를 제공합니다.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

종양 조직에서 높은-품질 게놈 DNA를 얻는 유전 변경 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석 하기 위한 필수적인 첫 번째 단계입니다. 이 문서에서는, 우리는 종양 세포를 풍부 하 게 하 고 그대로 DNA 터치에서 인쇄물 세포학 표본 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

이 프로토콜은 비소세포폐암(NSCLC) 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 표적 가능한 게놈 변경을 검출하기 위한 자동화된 ISO15189 인증 차세대 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다.

차세대 시퀀싱을 사용한 비소세포폐암의 표적 변화 검출

우리는 전체 마운트 immunohistochemistry를 소개하고 레이저 마우스 배아 사지 피부에 복잡한 혈관 네트워크 형성을 분석하는 데 여러 상표와 공촛점 현미경을 검사합니다.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

이 문서에서 우리는 murine 주민 폐 mesenchymal 줄기 세포 (MSC 폐), 그들의 확장, 특성화 및 immunomodulatory 속성의 분석의 절연을 보여줍니다.

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

형광 - 현미경 검사와 차세대 장면 : Organelle 무결성에 관련된 유전자의 식별을위한 유용한 도구

우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

학습하세요 비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석 방법을 통해 259명의 환자에서 유전자 변이와 융합을 신속하게 검출하는 기술을 익히세요. 이 워크플로우는 조직 소모를 최소화하면서 정밀 의료를 위한 신속한 진단을 가능하게 합니다.

비편평 비소세포폐암의 초고속 앰플리콘 기반 차세대 염기서열분석

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