Name: 망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 47 s
Description: 학습하세요 망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비 방법으로, 취약한 망막 조직의 장기 보존과 향후 분석을 가능하게 합니다. 이 기법은 퇴행성 시신경병증 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 후베이 핵심 연구소 개설 프로젝트(보조금 번호 2021KFY055), 후베이성 자연 과학 재단(보조금 번호 2020CFB240) 및 중앙 대학 기초 연구 기금(보조금 번호 2042020kf0065)의 지원을 받았습니다.

모든 단계는 달리 지시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 사용된 모든 C57BL/6J 마우스는 우한대학교 동물실험센터에서 입수하였으며, 모든 관련 실험은 우한대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다. 생쥐의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
1. 눈의 적출 및 고정
<ol><li>생쥐를 이산화탄소 질식으로 안락사시키고 이빨이 없는 핀셋을 사용하여 안구를 부드럽게 적출합니다.</li>
	<li>인산염 완충 식염수(PBS)로 안구를 한 번 헹굽니다.</li>
	<li>현미경으로 각막에 주사기 바늘로 안구를 뚫습니다(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x-4.5x) 안구로의 고정을 가속화하고 고정 효율을 향상시킵니다.</li>
	<li>4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 24웰 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>안구를 4% PFA에 45분 동안 고정한 다음 1x PBS로 옮겨 과잉 PFA를 즉시 제거합니다(3회 세척, 5분/회).</li>
</ol>2. 망막 분리 및 평탄화
<ol><li>안구를 유리 슬라이드로 옮기고 해부 현미경(접안렌즈 WF: 10x/22, 연속 배율 대물렌즈: 0.67x-4.5x) 아래에 놓습니다.</li>
	<li>한 손으로 집게를 잡고 각막의 가장자리를 고정하여 안구 움직임을 방지합니다. 다른 손으로 해부 가위를 잡고 각막 공막 윤부를 통해 약 1mm 깊이의 각막 주위를 자릅니다. 수정체와 유리체를 제거합니다.</li>
	<li>시신경을 중앙에 놓고 해부 가위를 사용하여 4 개의 사분면을 따라 방사상으로 망막을 절단하여 망막 반경의 약 2/3에 도달합니다.</li>
	<li>톱니 집게를 사용하여 공막 가장자리 중 하나를 클램프하십시오. 다른 손으로 톱니가 없는 집게로 공막의 가장자리를 잡고 공막이 톱니가 있는 집게에 의해 고정되는 곳에서 공막 바닥으로 이동합니다. 망막을 조심스럽게 껍질을 벗기십시오.</li>
	<li>피펫(200 μL)을 사용하여 PBS를 빼내어 망막을 플러시하고 적신 다음 작은 흡수성 종이로 과도한 PBS를 제거합니다. 필요한 경우 작은 강모 브러시로 망막을 부드럽게 평평하게 만듭니다.</li>
	<li>차가운 메탄올(-20°C 냉동고에서 예냉)을 망막 내부 표면에 한 방울씩 천천히 피펫팅합니다(망막이 메탄올로 완전히 덮일 수 있는 한 메탄올의 부피는 고정되지 않음). 망막이 하얗게 변하고 끈기가 증가합니다.</li>
	<li>망막을 부드럽게 평평하게하고 작은 강모 브러시로 잔류 색소 막과 유리체와 같은 불순물을 제거합니다. 작은 강모 브러시를 사용하여 망막을 뒤집고 위에서 언급 한 과정을 반복하십시오.</li>
	<li>메탄올-처리된 망막을 24-웰 플레이트의 웰로 옮기고, 메탄올에 담근 상태로 유지한다.</li>
	<li>즉각적인 면역 염색을 위해 -20°C에서 1-2시간 동안 보관하거나 망막을 메탄올에 그대로 두고 장기 보관을 위해 -20°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>24-웰 플레이트로부터 메탄올을 제거하고, 망막을 1x PBS로 헹구었다.</li>
</ol>3. RGC의 면역형광 염색
<ol><li>망막을 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 24웰 혈구 응집 플레이트로 조심스럽게 옮기고, 5% PBS-TX-BSA (1x PBST 용액 100mL에 용해된 소 혈청 알부민 분말 5g; PBST는 1 x PBS 2,000mL에 Triton X-100 10mL를 첨가하여 형성됨)를 실온에서 4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 차단합니다. 신경절 쪽을 위로 유지하십시오.</li>
	<li>PBS-TX-BSA를 제거하고, 1:400 희석액을 사용하여 선택된 1차 항체(기니피그 항-RBPMS 항체) 100 μL를 첨가하여 4°C에서 48-96시간 동안 망막을 배양합니다.</li>
	<li>1차 항체를 제거하고, 실온에서 진탕하면서 1x PBS로 망막을 3회(각각 20분) 헹구었다.</li>
	<li>1:400 희석액을 사용하여 해당 2차 항체( 재료 표 참조), 시아닌 Cy3 affiniPure 당나귀 항기니피그 IgG(H+L)와 함께 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들면서 망막을 배양합니다.</li>
	<li>1x PBS로 망막을 세 번(각 20분) 헹굽니다.</li>
	<li>신경절 세포층이 위를 향하도록 슬라이드에 망막을 평평하게 놓고 피펫으로 망막 주위에 적절한 양의 형광 소광제를 떨어뜨린 다음 슬라이드를 커버슬립으로 덮습니다(기포가 생기지 않도록 주의). 알림: 적절한 양의 항형광 소광제를 결정하려면 전체 망막을 덮고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 망막이 뜨지 않고 슬라이드를 덮고 쉽게 움직입니다.</li>
	<li>슬라이드가 움직이지 않도록 밀봉제로 슬라이드 전체를 밀봉하십시오. 샘플을 -20°C에서 보관하고 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	<li>형광/컨포칼 현미경을 사용하여 망막을 이미지화합니다.</li>
</ol>

망막 신경절 세포 연구를 위한 마우스 망막 분리 및 메탄올 치료

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</ol>

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고정은 망막을 보존하기 위한 필수 단계이며, 이는 형태학을 기반으로 한 후속 RGC 조사에 영향을 미칠 수 있습니다. 성공적인 고정은 망막을 고정 매체에 노출시키는 순간 망막의 구조와 상태를 빠르게 포착하며, 이는 추가 분석에 중요합니다. 포름 알데히드는 조직 및 세포 고정 및 보존을위한 가장 일반적인 고정제 중 하나로 간주되어 왔지만, 포름 알데히드만으로는 일부 조사에서 최적의 화학 고정제로 항상 잘 작동하는 것은 아닙니다10,14. 고정제의 종류에 따라 아미노산과 뉴클레오티드를 침전시키고, 단백질을 안정화하며, 세포 형태를 유지하는 능력이 다양하다15. 두 가지 유형의 고정제를 혼합하여 사용함으로써 각각의 강점을 충분히 활용할 수 있습니다16,17. 메탄올은 조직이 신선하게 ...

망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 망막에 있는 유일한 투영 뉴런으로, 외부 시각 정보를 통합하여 뇌에 전달한다1. 녹내장 및 외상성 시신경병증과 같은 많은 신경퇴행성 질환은 비가역적 손상과 RGC의 손실을 특징으로 한다 2,3. RGC의 형태학적 및 정량적 변화를 분석하는 것은 신경퇴행성 질환이 어떻게 발생하고 진행되는지를 결정하는 중요한 단계입니다 4,5.
간접 면역형광 분석은 단백질 분포 및 세포 계수를 모니터링하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 실험실에서 망막의 생리학적 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 전체 마운트 망막 면역염색법이 일반적으로 사용됩니다6. 전체 망막에서 RGC 정량화에 사용되는 가장 일반적인 마커는 Brn3a, 다중 스플라이싱을 갖는 RNA 결합 단백질(RBPMS) 등을 포함합니다 7,8. RGC의 양과 분포를 특성화하려면 고품질의 전체 마운트 망막 면역염색이 필요합니다. 일반적으로, 면역염색 프로토콜에서, 망막은 항체에서 배양되기 전에 화학적 고정제에 담근다. 이상적인 고정제는 세포의 모양, 항체에 대한 에피토프의 접근성 또는 친화도, 또는 조직의 선형 치수를 변화시키지 않아야 한다 9,10.
망막의 복잡한 구조로 인해 망막의 취약성 및 접힘과 같은 문제뿐만 아니라 세포 수축 및 불분명한 핵을 포함한 몇 가지 일반적인 어려움이 전체 마운트 망막 패치를 만들 때 발생하기 쉬우며 이는 실험 연구에 부정적인 영향을 미칩니다. 또한, 모든 망막이 즉시 면역염색되는 것은 아니며, 특히 귀중한 기원의 값비싼 가격을 가진 형질전환 마우스의 망막의 경우 추가 사용을 위해 여분의 망막 샘플을 보존해야 합니다.
적절한 고정액은 조직을 신속하게 고정하고, 조직 자가분해를 피하고, 조직 세포의 정상적인 형태와 구조를 보존하고, 단백질 및 기타 물질의 항원성을 유지할 수 있다10. 현재, 포름알데히드계 고정술은 분리된 망막, 반절제된 안구, 안구 전체를 포함한 다양한 조직에서 널리 사용되고 있다10. 조직 수축과 세포의 형태학적 변화는 포름알데히드에 담근 후 직면하게 되는 두 가지 중요한 문제이다11. 또한, 망막 및 표적 세포의 본래 특성의 보유를 최대화하기 위해 변형된 고정 제형이 점점 더 등장하고 있다 9,10. 다른 망막 고정 치료는 망막 구조, 단백질 면역원성, 형광 여기 및 감쇠 소멸 주기에 다르게 영향을 미칠 수 있습니다12,13. 데이비슨 용액으로 고정된 망막은 포르말린으로 고정된 망막에 비해 형태학적으로 더 온전하지만, 데이비슨 용액은 소교세포 마커-이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 112와 같은 일부 항체와의 호환성이 떨어진다. 망막의 깨지기 쉬운 특성을 고려할 때 연구자들은 망막 무결성과 표적 세포의 특성 및 형태가 장기 보관 후에 변할지 여부를 자연스럽게 궁금해할 것입니다. 그러나 수개월 보관 후 망막 및 RGC 세포 형태에 대한 고정 용액의 가능한 효과는 거의 보고되지 않았습니다. 망막 고정의 최적화는 RGC의 평가 및 보존에 중요합니다.
우리는 전체 마운트 쥐 망막 염색에 사용하는 신뢰할 수 있고 기술적으로 간단한 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리의 방법은 망막 조직의 장기 보관의 필요성과 형광단 형성 또는 분해의 특정 측면을 고려하여 RGC 조사를 위한 망막의 적절한 준비 및 보관을 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>24웰 세포 배양 클러스터</td><td>Costar</td><td></td><td>안구 고정</td></tr><tr><td>24웰 혈구응집 플레이트</td><td>Labedit Company</td><td></td><td>배양 항체</td></tr><tr><td>접착 현미경 슬라이드</td><td>Citotest</td><td></td><td>또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>항형광 담금질 장착제</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td>Slow down 형광 담금질</td></tr><tr><td>BSA(소 혈청 알부민)</td><td>Servicebio</td><td>GC305010</td><td>차단 시약</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td>적용 40x 대물 렌즈</td></tr><tr><td>곡선 가위</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>RWD Life science Co.,LTD&nbsp;</td><td>77001S</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>겸자</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>20210624</td><td>GC&ge; 99.5%</td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>SecheVite</td><td></td><td>밀봉제</td></tr><tr><td>바늘&nbsp;</td><td>상하이 친절 기업 개발 그룹 Co., Ltd.</td><td></td><td>고정</td></tr><tr><td>가속화 파라포름알데히드 용액</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>안구 고정</td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수 pH 7.4)</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>안구 헹굼&nbsp;</td></tr><tr><td>1차 항체: 기니피그 다중 스플라이싱을 통한 항-RNA 결합 단백질(RBPMS)</td><td>PhosphoSolutions</td><td>Cat. #1832-RBPMS</td><td>면역형광용. 1:400</td></tr><tr><td>2차 항체: Cy3 affiniPure 당나귀 항기니피그 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-165-148</td> 면역형광<td>용. 1:400</td></tr><tr><td>스트레이트 가위에서</td> 사용 <td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>해부 도구</td></tr></tbody></table>

망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

망막의 투영 뉴런인 망막 신경절 세포(RGC)는 외부 시각 정보를 뇌로 전파합니다. RGC의 병리학 적 변화는 수많은 망막 퇴행성 질환과 밀접한 관련이 있습니다. 전체 마운트 망막 면역염색은 망막의 발달 및 병리학적 상태를 평가하기 위해 RGC에 대한 실험적 연구에서 자주 사용됩니다. 어떤 상황에서는 형질전환 마우스의 샘플과 같은 일부 귀중한 망막 샘플을 RGC의 형태나 수에 영향을 미치지 않고 장기간 보관해야 할 수도 있습니다. 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험 결과를 위해서는 효과적인 보존 배지를 사용하는 것이 필수적입니다. 여기에서 우리는 망막 전체 장착 준비 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로서의 메탄올의 효과를 설명합니다. 간단히 말해서, 분리 과정에서 차가운 메탄올(-20°C)을 망막 표면에 피펫팅하여 조직을 고정하고 투과성을 촉진한 다음 망막을 면역염색하기 전에 차가운 메탄올(-20°C)에 보관할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RGC 조사에 유용하고 실용적인 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 보관 프로토콜을 설명합니다.

해부 후 망막은 편평한 네잎 클로버처럼 보일 것입니다. 이 연구에서는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 메탄올을 첨가한 후 망막이 하얗게 변했습니다(그림 1). 한편, 망막은 부드러움에서 유연하고 평평한 것으로 바뀌었습니다. 다음으로, RGC는 anti-RBPMS8로 라벨링되었습니다. 컨포칼 현미경(접안렌즈: 10x, 대물렌즈: 40x)을 사용하여 전체 마운트 망막(n = 3)에서 4개의 이미지 필드를 촬영했습니다. 메탄올 처리 전과 메탄올에서 12개월 동안 장기간 보존한 후 망막의 시각화된 RGC의 대표적인 모습이 그림 2에 나와 있습니다. 형광 강도는 큰 변화를 나타내지 않았다. 메탄올 보존은 RGC 면역염색에 영향을 미치지 않았다.
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메탄올은 망막 전체 마운트 제제 및 장기 보관을 위한 보조 고정 배지로 사용할 수 있으며, 이는 망막 신경절 세포의 조사에 유용합니다.

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

이 연구는 RGC를 조사하는 데 유용하고 실용적인 수정된 망막 분리 워크플로 및 조직 샘플 저장 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 망막은 깨지기 쉽고 접혀 있어 전체 마운트 망막 패치를 만들 때 실험적 연구를 제한합니다. 또한 모든 망막은 즉각적인 면역 염색이 필요하지 않습니다.때때로, 여분의 망막 샘플은 추가 사용을 위해 보존이 필요합니다. 우리는 RGC 조사를 위한 망막의 적절한 준비와 장기 보관의 필요성을 강조하는 전체 마운트 망막 염색의 신뢰할 수 있고 기술적으로 간단한 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리는 퇴행성 시신경 병증의 기초 연구를 계속할 것입니다.또한, 시신경 손상 및 사고 재생의 분자 메커니즘과 신경퇴행성 질환의 진단 및 치료를 위한 잠재적인 임상 표적을 탐구할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

이 프로토콜은 망막의 시냅스 회로 및 단백질 국소화를 탐색하는 데 중점을 두고 면역전자 현미경을 사전 삽입하는 세부 단계를 간략하게 설명합니다.

Investigating retinal circuits and molecular localization by pre-embbedding immunoelectron microscopy (면역전자 현미경 사전 임베딩을 통한 망막 회로 및 분자 국소화 조사)

이 프로토콜은 전체 마운트 마우스 망막을 분리하고 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 표지하기 위해 면역염색을 수행하는 절차를 설명합니다. 그 다음에는 AI 기반 소프트웨어를 사용하여 망막 신경절 세포를 이미징하고 자동으로 계수하여 전체 마우스 망막에서 망막 신경절 세포를 정량화하는 간단하고 빠르며 정확한 방법을 제공합니다.

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

여기에서는 NMDA 유도 흥분 독성 하에서 마우스 망막의 해부학적 특징과 표현형을 조사하기 위해 유전적으로 지시된 알칼리성 포스파타제(AP) 표지 방법의 사용을 설명합니다. 여러 망막 신경절 세포(RGC) 하위 유형 특이적 리포터 라인과 함께 퇴행성 과정 전반에 걸쳐 죽어가는 RGC에서 새로운 표현형을 발견합니다.

N-메틸-D-아스파르트산(NMDA) 유발 흥분독성 하에서 망막신경절세포의 해부학적 특징 검사

학습하세요 망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비 방법으로, 취약한 망막 조직의 장기 보존과 향후 분석을 가능하게 합니다. 이 기법은 퇴행성 시신경병증 연구에 활용됩니다.

망막 신경절 세포 조사를 위한 메탄올 기반 전체 마운트 준비

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