Name: 어린 생쥐의 만성 사극 기록을 위한 경량 드라이브 임플란트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 배우세요 어린 생쥐의 만성 신경 기록을 위한 경량 마이크로 드라이브 임플란트 기법을 통해 뇌 네트워크 발달을 연구하는 방법을. 이 기술은 최대 16개 양측 뇌 영역에서 동시 기록이 가능하여 신경발달 장애 메커니즘 이해에 기여합니다.

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이 작업은 National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) 및 F99NS12053 (L.D.Q.) 및 UT Southwestern GSO Endowment Award (RJP 및 LDQ)의 지원을 받았습니다. 저자는 기술 지원에 대해 Jenny Scaria (Texas Tech University Health Sciences Center School of Pharmacy)와 방법 론적 제안에 대해 Brendon Watson 박사 (University of Michigan)에게 감사드립니다.

어린 마우스의 일일 신경 활동을 기록하기 위한 Micro-Drive Implant

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설치류에서 생체 내 신경 회로 기능을 탐구하는 현대 실험은 종종 영구적으로 이식된 전극을 통해 세포외 전기생리학을 활용하여 개별 뉴런(즉, 단일 단위) 또는 지역 개체군(국소 전위, LFP를 통해)의 활동을 모니터링하지만 이러한 방법은 기술적인 문제로 인해 어린 마우스에 거의 적용되지 않습니다. 이 원고는 p20에서 p60 및 그 이상의 발달적으로 중요한 창에 걸쳐 마우스에서 생체 내 전기생리학적 기록을 얻는 방법을 설명합니다. 이 방법론에는 마이크로 드라이브 임플란트의 인쇄 및 구성을 위한 제조 공정, 외과적 임플란트 절차 및 수술 후 회복 전략이 포함되며, 이 모든 것은 특히 어린 마우스에 사용하도록 맞춤화되었습니다. 이 프로토콜의 개발에는 성인 마우스에 비해 어린 마우스의 작은 크기와 상대적 약점, 마이크로 드라이브를 부착해야 하는 어린 마우스 두개골의 골화 감소를 포함하여 몇 가지 고려 사항이 영향을 미쳤습니다.
생체 내 전기생리학을 수행하기 위해 일반적으로 사용되는 두 가지 주요 방법은 전극(예: 테트로드) 및 실리콘 프로브의 어레이입니다. 실리콘 프로브는 가볍고, 단위 중량 당 많은 수의 기록 부위를 제공할 수 있으며, 이전에 어린 쥐25마리에서 활용되어 왔다. 그러나 실리콘 프로브는 단위당 상대적으로 비쌉니다. 대조적으로, 이 원고에 설명된 마이크로 드라이브는 미화 50달러 미만의 원자재를 사용하여 구성할 수 있으므로 생체 내 기록을 위한 비용 효율적인 옵션입니다. 또한 실리콘 프로브는 종종 고정선에 이식되어야 하므로 공간적으로 다양한 뇌 영역의 기록이 금지됩니다. 대조적으로, 이 원고에 설명된 마이크로 드라이브 설계는 독립적으로 조정 가능한 테트로드를 사용하여 최대 16개의 서로 다른 위치에서 동시 녹음을 수용할 수 있으며 해당 위치 간의 공간적 관계에 대한 거의 제한이 없습니다. 이 마이크로 드라이브 설계는 캐뉼라 구멍 돌출부를 원하는 전방/후방 및 내측/원위 위치로 이동하여 여기에 설명된 것과 다른 위치를 타겟팅할 수 있도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 대체 뇌 영역을 목표로 삼을 때 사극이 종종 직선으로 이동하지만 이러한 가는 와이어가 마이크로 드라이브 캐뉼라를 빠져나갈 때 약간 편향될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 뇌 영역이 작거나 복부가 많을수록 사극으로 해당 영역을 성공적으로 표적으로 삼는 것이 더 어려워집니다.
이 원고에 기술된 마이크로-드라이브 임플란트는 개별 테트로드가 나사에 부착되어, 각 테트로드의 기록 깊이를 미세하게 제어할 수 있다는 점에서 이전의 여러 테트로드 기반 마이크로-드라이브 설계들(23,32,33,34,35)과 근본적으로 유사하다. 현재 마이크로 드라이브 설계의 몇 가지 기능은 공간적으로 분산된 뇌 영역을 쉽게 표적으로 삼을 수 있다는 점을 포함하여 독특하지만, 현재 원고의 주요 참신함은 외과적 이식 및 수술 후 회복 전략에 대한 설명으로, 이는 아직 발달 중인 어린 마우스의 네트워크 활동에 대한 만성적인 연구를 가능하게 합니다. 실제로, 여기에 설명된 수술 및 회복 방법론은 어린 생쥐의 다른 임플란트를 지원하도록 조정할 수 있습니다.
여러 날에 걸쳐 일관된 기록을 유지하려면 와이어 또는 프로브를 두개골에 단단히 부착해야 합니다. 쥐 두개골의 전체 구조는 p20 이후에 약간의 변화만 겪지만, 두개골은 p20에서 p45 사이에 상당히 두꺼워집니다36. 실제로 p20의 두개골은 손상 없이 부착된 임플란트를 지지하기에 충분히 단단하지 않습니다. 이러한 생물학적 한계를 극복하기 위해 이 프로토콜은 이식 수술 중에 시아노아크릴레이트를 통해 인위적으로 두개골을 두껍게 만듭니다. 이 전략을 사용하여 p20보다 어린 마우스에 이식하는 것이 가능할 수 있지만 마우스 두개골은 대략 p2036까지 상당한 크기와 모양 변화를 겪습니다. 따라서 p20보다 어린 마우스에 장기간 이식하는 것은 아직 발달 중인 두개골의 시아노아크릴레이트 및 고정 뼈 나사가 두개골의 자연적인 성장과 기본 뇌 조직 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 권장되지 않습니다. 중요하게도, 이 연구에서 p20에서 시작하는 만성 이식 후 두개골 또는 뇌 크기의 총 측정에 미치는 영향이 관찰되지 않았다는 것입니다(그림 5C).
이 원고에 설명된 방법의 중요한 단계는 수술 후 회복 전략입니다. 이 전략에 따르면, 임플란트의 무게는 마우스가 성숙하고 근육 및 근골격계 발달을 겪음에 따라 지속적으로 균형을 이루어야 합니다. 이식 후 초기에 마우스는 균형 없이 임플란트의 무게를 성공적으로 견딜 수 없어 마우스가 케이지의 음식과 수원에 적절하게 도달할 수 없기 때문에 영양실조와 탈수로 이어집니다. 카운터 밸런스 시스템은 구성하기 쉽고 저렴하며 구현하기 쉬우며 이식 가능한 모든 연령의 마우스가 홈 케이지 전체를 자유롭게 탐색할 수 있도록 하여 적절한 영양과 수분 공급을 보장합니다. 생쥐가 나이가 들어감에 따라 성인 생쥐에서 완전히 제거 될 수있을 때까지 균형의 양을 줄일 수 있습니다. 그러나 실험 기간 동안 최소한 공칭 균형추를 항상 부착한 상태에서 카운터밸런스 시스템을 계속 사용하는 것이 좋습니다. 성인 마우스는 시간이 지남에 따라 마이크로 드라이브의 크기와 무게를 견딜 수 있지만, 균형추를 개선하지 않고 자유로운 행동 중에 자연스러운 움직임을 계속하면 마이크로 드라이브를 두개골에 고정하는 뼈 나사에 토크와 전단력이 발생하여 특히 더 긴 만성 실험 중에 분리될 가능성이 높아집니다.
현재 연구에서 주목해야 할 두 가지 중요한 제한 사항이 있습니다. 첫째, p20에서의 이식이 두개골과 뇌 발달에 미치는 영향을 평가하기 위해, 장기간 이식 후 여러 마우스의 코호트를 희생시켰다(그림 5C). 이러한 분석은 이식이 두개골 구멍 크기나 뇌 질량에 미치는 유의미한 영향을 나타내지 않았지만(그림 5C), 현재 연구에서는 p20-p60의 초기 발달 기간 동안 여러 시점에서 두개골 크기나 뇌 질량을 조사하지 않았습니다. 선행 연구에서는 뇌강의 발달이 p2036에 의해 완료됨을 보여주지만, 이 초기 창에서의 이식은 여기에서 평가된 성인 연령에 의해 수정되거나 보상되는 예상치 못한 변화를 일으킬 수 있습니다. 둘째, 도 3 및 도 4 에 도시된 전기생리학적 데이터를 생성한 실험은 세포 수율을 최대화하도록 설계되지 않았다. 따라서 여기에 제시된 데이터는 안정적이고 만성적인 기록과 잘 분리된 단일 장치를 보여주지만 이 장치의 최대 잠재적 수율을 나타내는 것으로 간주해서는 안 됩니다.
많은 인간의 신경 및 정신 장애는 자폐증 및 정신 분열증을 포함하여 초기 발달 기간 또는 청소년기에 걸쳐 나타납니다. 그러나 사용 가능한 마우스 모델이 많음에도 불구하고 이러한 질병의 기초가 될 수 있는 회로 수준 기능 장애에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이러한 초기 네트워크 변화의 식별은 조기 발견 전략 및 치료 패러다임을 만드는 데 중요합니다. 그러나 기술적 문제로 인해 신경 정신 질환의 마우스 모델 개발 전반에 걸쳐 네트워크 기능이 어떻게 중단되는지는 불분명합니다. 여기에 설명된 마이크로 드라이브 및 복구 전략은 마우스 뇌의 다지역 뇌 네트워크 발달에 대한 조사를 지원하도록 설계되었으며, 따라서 연구자들은 건강한 뇌 발달을 측정할 수 있을 뿐만 아니라 마우스 질병 모델에서 해당 발달의 변화를 식별할 수 있습니다.

뇌는 아동기와 청소년기의 중요한 발달 기간 동안 대규모 변화를 겪습니다 1,2,3. 자폐증과 정신분열증을 포함한 많은 신경학적 및 정신과적 질환은 이 청소년 및 청소년 뇌 발달 기간 동안 행동적, 생물학적으로 처음 나타납니다 4,5,6. 초기 발달 전반에 걸쳐 발생하는 세포, 시냅스 및 유전적 변화에 대해서는 많이 알려져 있지만, 이 기간 동안 회로 또는 네트워크 수준 프로세스가 어떻게 변하는지에 대해서는 비교적 알려진 바가 거의 없습니다. 중요하게도, 궁극적으로 복잡한 행동, 기억 및 인지의 기초가 되는 회로 수준의 뇌 기능은 세포 및 시냅스 기능의 예측할 수 없고 창발적인 특성입니다 7,8,9,10. 따라서 네트워크 수준의 뇌 기능을 완전히 이해하려면 온전한 신경 회로 수준에서 신경 활동을 직접 연구해야 합니다. 또한, 신경 정신 장애의 진행 전반에 걸쳐 뇌 활동이 어떻게 변경되는지 확인하기 위해서는 질병의 행동 표현형이 나타날 때 특정 시간 창 동안 유효한 질병 모델에서 네트워크 활동을 조사하고 관찰된 변화를 추적하는 것이 중요합니다.
가장 흔하고 강력한 과학적 모델 유기체 중 하나는 행동 및/또는 니모닉 표현형의 연령 의존적 발병을 동반한 신경 발달 장애를 모델링하는 많은 수의 고유한 유전적 균주를 가진 마우스입니다 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . 인간과 생쥐의 뇌 사이의 정확한 발달 시점을 연관시키는 것은 어렵지만, 형태학적 및 행동적 비교에 따르면 p20-p21 마우스는 2-3세의 인간 연령을 나타내고 p25-p35 마우스는 11-14세의 인간 연령을 나타내며 마우스는 p603까지 인간 20세 성인과 동등한 발달 상태에 도달할 가능성이 높습니다. 22. 따라서 청소년 뇌가 어떻게 발달하는지 더 잘 이해하고 자폐증이나 정신 분열증과 같은 질병에서 뇌의 신경망이 어떻게 기능 장애를 일으키는지 확인하려면 생후 20 일에서 60 일 사이의 생쥐에서 생체 내 뇌 활동을 직접 모니터링하는 것이 이상적입니다.
그러나 생쥐의 초기 발달 전반에 걸쳐 뇌 활동을 모니터링하는 근본적인 문제는 어린 생쥐의 작은 크기와 상대적 약점입니다. 뇌 발달의 종단적 연구에 필요한 전극의 만성 이식은 전형적으로 미세 전극 와이어들 및 인터페이스 보드(23,24)를 보호하기 위해 크고 부피가 큰 하우징을 필요로 하며, 임플란트는 감소된 골화로 인해 어린 마우스에서 더 얇고 덜 단단한, 마우스 두개골에 단단히 부착되어야 한다. 따라서, 생체 내 설치류 생리학에 대한 거의 모든 연구는 상대적인 크기, 강도 및 두개골 두께로 인해 성인 피험자에서 수행되었습니다. 현재까지, 생체 내 청소년 설치류 뇌 생리학을 탐구하는 대부분의 연구는 야생형 청소년 쥐에서 수행되었으며, 이는 인간 장애 25,26,27,28,29,30의 자유롭게 행동하는 모델에서 청소년 뇌 기능을 실험적으로 모니터링하는 능력을 필연적으로 제한합니다.
이 원고는 발달적으로 중요한 기간(p20에서 p60 이상)에 걸쳐 어린 마우스의 장기(최대 4주 이상) 생체 내 뇌 기능을 만성적으로 연구하기 위한 새로운 임플란트 하우징, 외과적 이식 절차 및 수술 후 회복 전략을 설명합니다. 이식 절차는 어린 생쥐의 두개골에 전극을 안정적이고 영구적으로 부착할 수 있도록 합니다. 또한, 마이크로 드라이브 설계는 완전히 조립되었을 때 무게가 ~4-6g이고 임플란트의 무게를 상쇄하는 데 필요한 최소한의 균형으로 인해 일반적인 행동 패러다임 동안 어린 마우스의 행동 성능에 영향을 미치지 않기 때문에 가볍습니다.

<table><tbody><tr><td>10V 비디오 추적 LED</td><td>Neuralynx</td><td>HS-LED-Red/Green-omni-10V</td><td>헤드스테이지 프리앰프와 함께 사용 움직임 추적 목적의 LED 소켓이 포함된 liifier</td></tr><tr><td>16TT EIB 보드</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36-16TT</td><td>전자 인터페이스 보드- 오메네틱스 커넥터</td></tr><tr><td>16TT 헤드스테이지 프리앰프</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36-LED</td><td>레코딩 애플리케이션을 위한 EIB 보드와 테더 케이블 사이의 Omnetics 44소켓 신호 증폭기; 헤드스테이지용 커넥터가 포함되어 있습니다. 움직임 추적을 위한 LED</td></tr><tr><td>Baby-Mixter hemostat</td><td>FST</td><td>13013-14</td><td>Fine curved hemostat</td></tr><tr><td>Bone anchor screw</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>EIB 보드를 메인 드라이브 바디에 부착하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Burpenorphine</td><td>ZooPharm</td><td>Lot #BERLAB0.5-221207</td><td>Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL 수량</td></tr><tr><td>케이블 테더</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36 Litz 테더</td><td>오메네틱스 헤드스테이지용 경량 차폐 와이어 테더; 1m/2m/3m/5m의 길이 옵션</td></tr><tr><td>Carprofen/Rimadyl</td><td>Bio-Serve</td><td>MD150-2</td><td>수술 후 항염증제</td></tr><tr><td>투명 레진 v4</td><td>Formlabs</td><td>FLGPGR04</td><td>3D 프린팅 공정 중 3D 프린터로 광중합되는 액체 레진</td></tr><tr><td>Custom(셔틀) 스크류</td><td>Advanced Machining and Tooling, Inc.</td><td>맞춤형</td><td>가공 및 나사식 맞춤형 나사</td></tr><tr><td>치과 아크릴 액체 구성 요소</td><td>Teets 의치 재료</td><td>Lot# 329801</td><td>액체&nbsp; 의치 재료의 구성 요소 (위 참조)</td></tr><tr><td>치과 아크릴 분말 구성 요소</td><td>Teets 의치 재료</td><td>Lot# 583987</td><td>"cold cure" 의치 재료, 메틸 메타크릴레이트; 기록 장치를 제자리에</td></tr> <tr><td>고정하기 위한 적용을 위해 액체 구성 요소와 혼합DietGel Boost</td><td>ClearH2O</td><td>72-04-5022</td><td>젊은/회복 중인 쥐를 위한 고칼로리 건강 보조 식품</td></tr><tr><td>Digital Lynx 16SX</td><td>Neuralynx</td><td>DigitalLynx 16SX Base</td><td>최대 512개의 녹음 채널을 위한 16개의 콤보 보드 슬롯이 있는 메인 녹음 장치</td></tr><tr><td>해부 가위-무거운 블레이드</td><td>FST</td><td>14082-09</td><td>다양한</td></tr><tr><td>Dumont #5 세라믹 코팅 집게</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td>테트로드 핸들링/스레딩/핀닝</td></tr><tr><td>Dumont #5SF 집게</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>다목적 조립 사용</td></tr><tr><td>Dumont #5SF 집게</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>다목적 수술</td></tr>용 <tr><td>Dumont #7 미세 집게(곡선형)</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>다양한</td></tr><tr><td>Dumont #7 미세 집게(곡선형)</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>다목적 수술용</td></tr><tr><td>EIB-36 도금 어댑터</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36 도금 어댑터</td><td></td></tr><tr><td>EIB-36 도금 어댑터</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36 도금 어댑터</td><td>수술 중 두개골에 드라이브를 낮추기 위한 정위 액세서리</td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>안락사용 펜토바르비탈 나트륨</td></tr><tr><td>Extra fine Bonn scissors</td><td>FST</td><td>14083-38</td><td>Various</td></tr><tr><td>Extra fine graefe 집게</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>작은 직선 톱니 겸</td></tr>자 <tr><td>엑스트라 파인 graefe 집게</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>작은 직선 톱니 겸</td></tr>자 <tr><td>미세 지혈</td><td>FST</td><td>13006-12</td><td>미세 지혈</td></tr><tr><td>미세 가위 - CeramaCut</td><td>FST</td><td>14958-09</td><td>테트로드 절단</td></tr><tr><td>미세 가위 - ToughCut</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td>다양</td></tr><tr><td>Form 3+</td><td>Formlabs</td><td>PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC</td><td>3D 프린터, 모든 인쇄 부품/재료 제작을 위한 프린터; 저력 광조형 3D 프린터(LFS)</td></tr><tr><td>젤 슈퍼 글루</td><td>록타이트</td><td>1363589</td><td>다양한 단계</td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>FST</td><td>11049-10</td><td>작은 각진 톱니 집게</td></tr><tr><td>접지선</td><td>A-M 시스템</td><td>Lot# 582335</td><td>스테인레스 스틸 베어 와이어, .005" 직경, 단련, 100피트</td></tr><tr><td>제모 젤</td><td>제모 젤 제네릭</td><td>상업적으로 이용 가능</td><td>수술 전 마우스 머리 상단의 털 제거용</td></tr><tr><td>히트 건</td><td>Dewalt</td><td>D26960K</td><td>회전 후 테트로드 융합</td></tr><tr><td>고온 소작 키트</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>해당되는 경우 뼈 왁스와 함께 사용</td></tr><tr><td>핫 비드 살균기</td><td>FST</td><td>18000-45</td><td>수술 절차 중 임시 기기 살균을 위한 전기 살균</td></tr><tr><td>장치 Isoflurane</td><td>Covetrus</td><td>11695067771</td><td>최대 5%까지 이소플루란 기화기에 사용하기 위한 표준 이소플루란 액체 마취</td></tr> 이<tr><td>소프로필 알코올 91%</td><td>일반</td><td>상업적으로 이용 가능</td><td>표준 수술 전 살균 절차용</td></tr><tr><td>보석 나사(어린 마우스용 뼈 나사)</td><td>Component supply co. (부품 공급 공동)</td><td>MX-000120-02SFL</td><td>S/S 기계 나사 #000-120 x 1/8'' 필리스터 헤드, 슬롯 드라이브</td></tr><tr><td>LaGrange 가위</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>다양한</td></tr><tr><td>대형 폴리이미드 튜빙</td><td>Nordson medical</td><td>Lot # 13564</td><td>폴리이미드 튜빙- 내경 0.0071"; 외경 0.0115"; 길이 36"</td></tr> <tr><td>액체 슈퍼 글루</td><td>록타이트</td><td>1365882</td><td>다양한 단계</td></tr><tr><td>마이크로 드릴</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>K.1070 고속 로터리 마이크로모터 키트; 컨트롤 박스, 3/32" 콜릿, 가변 속도 풋 컨트롤, 핸드피스 크래들; 입체적으로 적합 가능; 100&ndash; 115V 사용</td></tr><tr><td>마이크로 드릴 버(0.5mm+)</td><td>FST</td><td>19007-05/07/09</td><td>개두술</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마</td><td>Pcode 1002076577; M5904-500mL</td><td>다양한 단계</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마</td><td>Pcode 1002076577; M5904-500mL</td><td>개두술 구멍을 열어 두는 사용</td></tr><tr><td>소형 일자 드라이버</td><td>FST</td><td>30051-10</td><td>뼈 나사의 삽입/조임</td></tr><tr><td>Neosporin 삼중 항생제 연고</td><td>Johnson & Johnson</td><td>512373700</td><td>항생제 연고</td></tr><tr><td>Omnetics 44 소켓 나노 커넥터</td><td>Neuralynx Neuralynx</td><td>부품 #A70427-801</td><td>비표준 항목 - Omnetics 44 소켓 (암) 맞춤형 카운터 밸런스 장치와 함께 사용하기위한 2 개의 가이드 핀 (남성)이있는 이중 행 직선 다리 나노 커넥터</td></tr><tr><td>플래티넘 10 % 이리듐 와이어</td><td>캘리포니아 미세 와이어</td><td>MO # M374710</td><td>terode assembly station 및 spinner 2.0을 사용하여 녹음하는 동안 사용하기 위해 사극체로 회전한 미세 녹음 와이어(아래 참조); HML NATRL VG 본드 코트; 크기 .0007 X 200FT</td></tr><tr><td>플래티넘 블랙 도금 솔루션</td><td>Neuralynx</td><td>플래티넘 블랙 도금 솔루션</td><td></td></tr><tr><td>도금 폴리카보네이트 케이지 바닥</td><td>Thomas Scientific/Maryland 플라스틱</td><td>1113M35; 제조업체 번호 E0270</td><td>표준 케이지 바닥; 이식되지 않은 마우스를 위한 chow+water bottle이 포함된 와이어 메시 장치를 위에 장착할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>N10 마이크로 필터가 있는 폴리카보네이트 케이지 탑</td><td>Ancare</td><td>N/A</td><td>평형 장치 용 PVC 파이프로 수정 될 표준 케이지 탑</td></tr><tr><td>포비돈 요오드 10 %</td> <td>일반</td><td>상업적으로 이용 가능</td><td>표준 수술 전 살균 절차</td></tr><tr><td>용 PVC 파이프</td><td>샬롯 파이프</td><td>N / A</td><td>1/2 "x 600 PSI 일정 40 흰색 PVC 파이프; 마우스 복구 중 평형 장치에 사용 / 조립</td></tr><tr><td>메스 블레이드 - # 4</td><td>FST</td><td>10060-00</td><td>절개 </td></tr><tr><td>메스 손잡이 사용 - # 4 총 해부학</td><td>FST</td><td>10060-13</td><td>절개 사용</td></tr><tr><td>셀프 홀딩 핀 및 뼈 나사 집게</td> 두<td>개골에 삽입하는 동안 뼈 및 접지 나사 용</td><td>FST</td><td>26100-00</td> 홀더</tr><tr><td>작은 EIB 핀</td><td>Neuralynx</td><td>작은 EIB 핀 EIB 보드</td><td>에 사극선 부착</td></tr><tr><td>작은 폴리이 미드 튜브</td><td>Nordson 의료</td><td>Lot # 19102423</td><td>폴리이 미드 튜브 - 내경 0.004 ''; 외경 0.0044''; 길이 36 "</td></tr><tr><td>솔리드 웍스</td><td>다쏘 시스템</td> 마이크로 드라이브 디자인을위한 <td>솔리드 웍스</td><td>3D CAD 프로그램</td></tr><tr><td>주걱 및 프로브</td><td>FST</td><td>1090-13</td><td>바셀린 / 미네랄 오일 용 애플리케이터 + 임시 사극 교정을위한 선택적 사용</td></tr><tr><td>스프링 가위 - 8 mm</td><td>FST</td><td>15024-10</td><td>두개골 조직 절개 용 가위</td></tr><tr><td>스프링 가위 - 8 mm</td><td>FST</td><td>15024-10</td><td>초기 절개</td></tr><tr><td>표준 패턴 겸자</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td>대형 톱니 겸</td></tr>자 <tr><td>수술 용 가위 - 날카롭고 뭉툭한</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>다양한</td></tr><tr><td>수술 용 가위 - ToughCut</td><td>FST</td><td>14054-13</td><td>다양한</td></tr><tr><td>Tetrode 조립 스테이션</td><td>Neuralynx</td><td>Tetrode 조립 스테이션</td><td>Tetrode</td></tr><tr><td>어셈블리 Tetrode 스피너 2.0</td><td>Neuralynx</td><td>Tetrode 스피너 2.0</td><td>테트로드 어셈블리</td></tr><tr><td>2액형 에폭시</td><td>고릴라 브랜드</td><td>4200102</td><td>다양한 단계</td></tr></tbody></table>

어린 생쥐의 만성 사극 기록을 위한 경량 드라이브 임플란트

A Lightweight Drive Implant for Chronic Tetrode Recordings in Juvenile Mice

생체 내 전기생리학은 온전한 뇌의 초급 회로 역학에 대한 비할 데 없는 통찰력을 제공하며 인간 신경 정신 장애의 마우스 모델을 연구하는 데 특히 중요한 방법을 나타냅니다. 그러나 이러한 방법은 종종 큰 두개골 임플란트를 필요로 하며, 이는 초기 발달 시점에서 마우스에서 사용할 수 없습니다. 따라서 이 중요한 창에서 신경학적 발달에 대한 더 나은 이해가 자폐증이나 정신분열증과 같은 연령 의존적 발달 장애에 대한 고유한 통찰력을 제공할 가능성이 있음에도 불구하고 자유롭게 행동하는 유아 또는 청소년 마우스에서 생체 내 생리학에 대한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 여기에서는 출생 후 20일(p20)부터 출생 후 60일(p60)까지 나이가 들어감에 따라 생쥐에서 동시에 여러 뇌 영역의 만성 필드 및 단일 단위 기록을 허용하는 마이크로 드라이브 설계, 외과적 이식 절차 및 수술 후 회복 전략에 대해 설명합니다. 기록 전극 및 최종 기록 부위의 수는 쉽게 수정하고 확장할 수 있으므로 발달 전반에 걸쳐 행동 또는 질병 관련 뇌 영역의 생체 내 모니터링을 유연하게 실험적으로 제어할 수 있습니다.

상술한 프로토콜은 p20에서 p60까지 동일한 마우스에서 수행된 일일 기록과 함께 마우스에서 동시에 여러 뇌 영역의 국소 필드 전위 신호 및 단일 단위를 기록하는 데 사용되었습니다. 여기에 보고된 것은 두 마리의 생쥐의 대표적인 전기생리학적 기록과 최종 기록 위치를 보여주는 실험 후 조직학입니다.
마이크로 드라이브를 p20 마우스에 외과적으로 이식 마이크로 드라이브(그림 1)를 구성하고(그림 2) 위에서 설명한 대로 p20 마우스에 외과적으로 이식했습니다. 수술 직후, 마우스를 카운터밸런스 시스템(도 2G-I)에 부착하고 회복시켰다. 마우스가 완전히 움직이면 마이크로 드라이브를 생체 내 전기 생리학 기록 시스템에 연결했습니다. 마이크로 드라이브를 녹음 장비에 연결하는 케이블이 마우스 위에 매달려 있었습니다. 전기생리학적 기록(32kHz)은 마우스가 홈 케이지에서 자연스럽게 행동하는 동안 1시간 동안 모든 채널에서 얻어졌습니다. 녹음 후 마우스는 녹음 시스템에서 플러그를 뽑고 카운터 밸런스 시스템에 다시 부착 한 다음 물과 차우에 자유롭게 접근 할 수있는 동물 사육장으로 돌아 왔습니다.
신경 활동의 일일 기록 전기 생리학적 기록은 p20-p60의 중요한 발달 창에서 동일한 뇌 영역의 만성 모니터링을 가능하게 하기 위해 몇 주 동안 매일 수집되었습니다. 만성 기록 전반에 걸친 샘플 원시 국소 전위(LFP)는 그림 3A,C에 나와 있습니다. 분리된 단일 유닛은 여러 테트로드에서 동시에 얻어졌습니다(그림 3B). 유사한 파형을 가진 단위가 여러 날에 걸쳐 식별되었지만(그림 3B, 중간 및 오른쪽) 기록 전극의 잠재적인 드리프트로 인해 동일한 단위가 며칠 동안 식별되고 있다고 단정적으로 주장할 수 없었습니다. p20에 이식되고 몇 주 동안 매일 기록된 별도의 마우스에서 등쪽 영역 CA1을 표적으로 하는 사극에서 신경 활동을 조사했습니다. 큰 진폭의 리플과 잘 격리 된 단일 단위가 기록의 각 날에 확인되었습니다 (그림 4). 이러한 데이터는 안정적이고 고품질의 생체 내 전기생리학적 기록이 초기 개발 전반에 걸쳐 동일한 마우스에서 나올 수 있음을 나타냅니다.
기록 부위의 조직학적 확인 및 만성 이식의 발달적 영향 최종 기록일 이후, 마우스는 이소플루란 마취를 통해 완전히 마취된 후 펜토바르비탈 나트륨의 치명적인 주사를 받았고, 전류가 전극 팁을 통과하여 기록 부위에 작은 병변을 생성했습니다. 실험 후 마우스 뇌의 조직학적 절편을 통해 최종 기록 부위를 시각화할 수 있었습니다(그림 5A, B). 별개의 코호트에서, 3마리의 수컷 마우스와 3마리의 암컷 마우스를 상기 기재된 바와 같이 p20에 외과적으로 이식하였다. 동일한 수의 새끼가 이식되지 않은 채로 남아 동일한 주거 조건에서 유지되었습니다. 마우스를 p62(이식된 코호트에 대한 수술 후 6주)에서 희생시켰다. 두개골을 조심스럽게 청소하고 브레그마에서 람다까지의 거리(그림 5C, 왼쪽 상단)와 람다에서 외부 최대 두개골 너비(그림 5C, 오른쪽 상단)를 외부 측정했습니다. 두개골의 정중선을 따라 절개하고 두개골의 절반을 제거하여 질량 측정을 위해 뇌를 절제했습니다(그림 5C, 오른쪽 하단). 브레그마에서 두개골 공동의 높이는 손상되지 않은 두개골 절반에서 측정되었습니다(그림 5C, 왼쪽 하단). 이식된 코호트와 이식되지 않은 코호트 간에 유의미한 차이는 없었으며(Wilcoxon rank-sum test), 이는 p20에서 시작하는 장기 이식이 두개골이나 뇌 부피의 자연적인 발달에 큰 영향을 미치지 않음을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig01.jpg"> 그림 1: 마이크로 드라이브 구성 요소 (A) 마이크로 드라이브 본체, (B) 캐뉼라, (C) 원뿔, (D) 뚜껑, (E) 나사 부착물 및 (F) 사극 전진 나사의 3차원 렌더링. 각 구성 요소의 중요한 기능이 표시됩니다. 측정 세부 정보는 https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/ 에서 사용할 수 있는 모델 파일에서 추출할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig02.jpg"> 그림 2: 마이크로 드라이브 구조 . (A) 측면 및 (B) 상단 및 하단 나사 부착물이 연결된 테트로드 전진 나사의 상단 보기. (C) 본체 및 캐뉼라가 부착된 마이크로 드라이브의 측면 및 (D) 평면도 및 각 캐뉼라 구멍을 통과하고 캐뉼라의 바닥으로 트리밍된 대형 폴리이미드 튜브. (E) 나사와 작은 폴리이미드 튜브가 제자리에 있는 마이크로 드라이브의 측면도. 작은 폴리이미드 튜브의 상단은 사극 로딩 직전에 다듬어집니다. (F) 입체 장치에 부착된 완성된 마이크로 드라이브. 일반적으로 마이크로 드라이브를 둘러싸고 있는 보호 원뿔은 시각화를 위해 제거되었습니다. 일부 나사 부착물은 이 마이크로 드라이브를 위해 검은색 레진으로 인쇄되었습니다. (G) 평형 지원 시스템. (에이치) 측면 및 (I) 카운터밸런스 지지 시스템이 부착된 마우스 케이지의 상단 모습. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig03.jpg"> 그림 3: 대표적인 전기생리학적 기록. p20 마우스를 상기와 같이 마이크로 드라이브를 이식하였다. p21에서 시작하여 그 후 2주 동안 매일 마우스를 기록 장치에 부착하고 신경 활동을 최소 1시간 동안 기록했습니다. (A) 양측으로부터의 원시 국소 전위(LFP) 기록(L = 왼쪽; R = 오른쪽) 전대상 피질(ACC), 해마 영역 CA3(CA3) 및 해마 영역 CA1(CA1). 데이터는 매일 수집되었습니다. 명확성을 위해 홀수 날의 데이터만 표시됩니다. 모든 흔적은 홈 케이지에서 움직이지 않는 기간 동안 촬영되었습니다. 스케일 바: 1mV, 2초(B) 패널 A의 녹음을 위해 해마 영역 CA3(왼쪽) 및 CA1(오른쪽)에서 분리된 대표적인 단일 단위. 각 전극의 모든 원시 파형은 검은색으로 표시됩니다. 평균은 빨간색입니다. 스케일 바: 50μV, 0.2ms. (C) p20에 이식된 두 번째 마우스에 대해 p60에서 최종 기록일까지 10일마다 대표적인 원시 LFP 추적. 데이터는 매일 수집되었습니다. 명확성을 위해 10일마다 데이터만 표시됩니다. 모든 흔적은 홈 케이지에서 움직이지 않는 기간 동안 촬영되었습니다. 스케일 바: 1 mV, 2 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig04.jpg"> 그림 4. 만성 녹음의 안정성. p20 마우스를 상기와 같이 마이크로 드라이브를 이식하였다. p21에서 시작하여 그 후 4주 동안 마우스를 기록 장치에 부착하고 신경 활동을 최소 1시간 동안 기록했습니다. 등쪽 해마 CA1을 표적으로 하는 사극의 데이터가 표시됩니다. (A) p21, p30 및 p40에서 식별된 리플 이벤트에 대한 원시(위) 및 리플 필터링(아래) LFP. 리플 이벤트를 식별하기 위해 원시 LFP는 125Hz와 300Hz 사이에서 대역 통과 필터링되었으며 리플 이벤트는 평균보다 3 표준 편차 큰 리플 대역 전력의 일시적인 증가로 식별되었습니다. 각 리플의 시작과 끝은 리플 대역 전력이 평균으로 돌아온 지점으로 정의되었습니다. 식별된 잔물결은 빨간색으로 표시됩니다. 스케일 바: 100 ms, 위에서 아래로: 1,000 μV, 140 μV, 1,800 μV, 180 μV, 9,000 μV, 1,200 μV, 10,000 μV, 1,000 μV. (B) 패널 A의 녹음을 위한 CA1 표적 사극에서 매일 대표되는 단일 단위. 각 전극의 모든 원시 파형은 검은색으로 표시됩니다. 평균은 빨간색입니다. 스케일 바 0.2 ms, 위에서 아래로: 50 μV, 100 μV, 100 μV. (C) 패널 B의 단일 장치에 대한 모든 스파이크의 자동 대응. 이 데이터는 몇 주에 걸쳐 해마 피라미드 층 내에서 안정적인 전극 배치를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig05.jpg"> 그림 5: 대표적인 조직학 및 두개골 발달에 미치는 영향. p20 마우스를 상기와 같이 마이크로 드라이브를 이식하였다. p60의 최종 기록일 이후, 기록 부위에서 전해질 병변이 생성되었고, 뇌는 4% 파라포름알데히드로 관류되었다. 기록 부위를 식별하기 위해 50μm 섹션이 생성되었습니다. (A) 해마의 CA1 및 CA3의 병변. 화살촉은 CA3 기록 사이트를 나타냅니다. 이중 화살촉은 CA1 기록 사이트를 나타냅니다. 스케일 바: 0.5mm. (B) 양측 ACC의 병변. 화살촉은 ACC 기록 사이트를 나타냅니다. 스케일 바: 0.5mm. (C) p20(회색)에서 마이크로 드라이브를 이식한 p62 마우스와 이식되지 않은 새끼(흰색)의 두개골 크기 및 뇌량 측정. Wilcoxon 순위합 검정의 p-값이 각 측정값에 대해 보고됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 출생 후 20일(p20)부터 출생 후 60일(p60) 및 그 이후까지 중요한 발달 기간에 걸쳐 청소년 및 청소년 마우스의 여러 뇌 영역에서 동시에 여러 뇌 영역의 만성 필드 및 단일 단위 기록을 허용하는 마이크로 드라이브 설계, 외과적 이식 절차 및 수술 후 회복 전략에 대해 설명합니다.

In vivo electrophysiology provides unparalleled insight into the sub-second-level circuit dynamics of the intact brain and represents a method of ...

우리는 뇌가 네트워크 수준에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 관심이 있습니다. 이 방법은 자폐증, 정신 분열증 또는 양극성 장애와 같은 연령 의존성 질병의 발달 변화를 식별하기 위해 뇌 네트워크의 발달을 탐구하려는 우리의 시도입니다. 실리콘 프로브 기술은 생체 내에서 네트워크 활동을 기록하는 더 간단하고 일관된 방법을 제공합니다.그러나 이것에도 불구하고, 만성 테트라 기록은 뇌 영역의 더 넓은 공간 분포를 동시에 기록하는 것과 같은 실리콘 프로브에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 만성 기록은 기록 부위의 신경교증, 시간 경과에 따른 기록 부위의 이동 또는 부착 방법의 실패를 포함한 여러 요인으로 인해 생체 내 전기생리학에 고유한 문제를 제기합니다. 우리의 최근 연구는 매 100 밀리 초마다 동물의 활발한 움직임 동안 해마의 세타 진동에 의해 인코딩 된 스윕이 반복적으로 앞으로 순환하여 가능한 미래 상태를 전향 적으로 평가하고 이전 행동을 소급 적으로 평가한다는 것을 보여주었습니다.어린 생쥐에서 이러한 생체 내 기록을 수행하는 것은 생쥐의 작은 크기, 상대적 약점 및 두개골의 발달 부족으로 인해 몇 가지 공학적 문제를 제기합니다. 우리의 방법론은 이러한 한계를 극복하고 발달중인 마우스 뇌에서 매일 네트워크 수준 활동을 만성적으로 기록 할 수있게합니다. 어린 생쥐에서 만성적으로 기록하는 것 외에도, 우리의 방법을 사용하면 해당 영역의 공간적 관계에 관계없이 최대 16 개의 별개의 양측 뇌 영역을 기록 할 수 있습니다.이러한 발전을 통해 우리는 네트워크가 건강한 뇌와 자폐 스펙트럼 장애와 같은 신경 발달 장애의 마우스 모델 모두에서 발달 전반에 걸쳐 기능적 의사 소통을 설정하는 방법을 식별 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜에서는 쥐에서 만성 electrophysiological 레코딩을위한 마이크로 드라이브 배열을 조작하는 방법을 보여줍니다.

만성에 대한 마이크로 드라이브 배열 생체내에 녹화 : 드라이브 제작

이 프로토콜에서는 쥐에서 만성 electrophysiological 레코딩을 위해 설계되었습니다 마이크로 드라이브 어레이와 함께 사용하기 위해 조작 및 조건 tetrodes하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 지상 설치 와이어 및 보호 원추형을 포함 마이크로 드라이브 배열 건설의 마지막 단계를 보여줍니다.

만성에 대한 마이크로 드라이브 배열 생체내에 녹화 : Tetrode 조립

디자인, 제조 및 초경량 전동 microdrive의 조립이 설명되어 있습니다. 이 장치는 작은 행동 동물의 단일 단위의 만성 레코딩을위한 비용 효율적이고 사용하기 쉬운 솔루션을 제공합니다.

작은 동물의 만성 신경 레코딩을위한 초경량 동력 Microdrive의 설계 및 조립

마우스의 뇌 신호의 생체 전기 생리학 기록에 대한 마이크로 드라이브의 설계와 어셈블리가 설명되어 있습니다. 튼튼한 driveable 캐리어 미세 번들을 부착하여,이 기술은 장기적이고 안정적​​인 신경 녹음을 허용합니다. 경량 디자인은 동물 다음과 같은 드라이브 주입에 의한 제한 행위 성능을 할 수 있습니다.

깨어있는 행동을 한 쥐의 만성 신경 녹음을위한 마이크로 드라이브 배열의 건설

우리 18 독립적으로 조정 가능한 tetrodes와 3D 인쇄 하이퍼 드라이브의 건설을 제시. 하이퍼 드라이브는 자유롭게 행동 하는 쥐의 몇 주 동안에 두뇌 활동을 기록 하기 위해 설계 되었습니다.

쥐 행동에 대규모 신경 기록에 대 한 향상 된 멀티 Tetrode 하이퍼 드라이브의 건설

이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스에서 두 개의 뇌 영역에서 9개의 독립적으로 조정 가능한 테트로데스와 하나의 조정 가능한 광실리콘 프로브를 이식할 수 있는 하이브리드 마이크로드라이브 어레이의 구성을 설명합니다. 또한 광실리콘 프로브를 여러 목적으로 안전하게 회수하고 재사용하는 방법이 입증되었다.

자유롭게 움직이는 마우스에서 이중 사이트 고밀도 레코딩을 위한 회수 가능한 광실리콘 프로브 및 Tetrode가 있는 하이브리드 마이크로드라이브 시스템

여기에서 우리는 현재 최대 10개의 분산된 뇌 영역에서 대칭적인 양측 와이어 전극 기록이 가능한 TD Drive라는 독특한 쥐용 3D 프린팅 가능한 임플란트를 소개합니다.

TD Drive: 행동하는 쥐와 잠자는 쥐의 다중 영역 전기생리학적 기록을 위한 파라메트릭 오픈 소스 임플란트

여기에서는 설치류의 만성 전기 생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 프로브 임플란트 시스템을 소개하며, 사용 편의성, 프로브 회수율, 실험적 다양성 및 행동과의 호환성에 최적화되어 있습니다.

DREAM Implant: 머리가 고정되고 자유롭게 행동하는 마우스의 만성 전기생리학을 위한 가볍고 비용 효율적인 모듈식 임플란트 시스템

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

우리는 조작 음향 신호 가수의 자연 청각 피드백을 대체하기에 적합 소형화 헤드폰의 디자인과 조립에 대해 설명합니다. 온라인 사운드 처리 하드웨어, 노래 출력을 조작하는 헤드폰을 통해 청각의 의견에 실시간으로 오류를 소개하고, 보컬 모터 학습을 유도하는 데 사용됩니다.

노래하는 새는에 청각 피드백을 조작하기위한 경량, 헤드폰 기반의 시스템

배우세요 어린 생쥐의 만성 신경 기록을 위한 경량 마이크로 드라이브 임플란트 기법을 통해 뇌 네트워크 발달을 연구하는 방법을. 이 기술은 최대 16개 양측 뇌 영역에서 동시 기록이 가능하여 신경발달 장애 메커니즘 이해에 기여합니다.

어린 생쥐의 만성 사극 기록을 위한 경량 드라이브 임플란트

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