Name: 잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 EM-Visible Gold Nanoparticles의 직접 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 학습하세요 EM 가시성 금 나노입자를 이용한 세포 내 단백질 국소화 분석 기법을. 알데히드 고정제를 피하고 미세 구조를 보존하면서 단일 분자 수준에서 정밀한 단백질 시각화를 달성하는 혁신적인 방법입니다.

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여기에 설명된 프로토콜은 Jiang et al. (2020). 이 작업은 MOST(973 프로그램 번호 2011CB812502 및 2014CB849902)의 보조금과 베이징 시 정부의 자금 지원으로 지원되었습니다.

이 실험에 사용된 모든 소모품은 재료 표에 나열되어 있습니다. 현재 프로토콜의 단계별 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 사파이어 디스크에서의 세포 배양
<ol><li>3mm x 0.16mm 사파이어 디스크를 에탄올 1mL가 들어있는 2mL 원심 분리기 튜브로 옮기고 초음파 세척기에서 10 분 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>표면에 눈에 띄는 침전물이 없을 때까지 각 사파이어 디스크를 알코올 램프 불꽃에 태우십시오. 알림: 위의 방법을 통해 사파이어 디스크를 여러 번 재활용할 수 있습니다.</li>
	<li>내용제성 펜을 사용하여 각 사파이어 디스크의 한 면에 숫자를 표시합니다(그림 1A). 알림: 사용된 마커 펜은 마크 손실을 방지하기 위해 사전에 아세톤 및 메탄올 용매에 내성이 있는지 여부를 테스트해야 합니다.</li>
	<li>라벨이 붙은 면이 위를 향하도록 하여 라벨이 붙은 사파이어 디스크를 35mm 배양 접시의 바닥에 놓습니다.</li>
	<li>세포 배양 접시를 자외선 하에서 사파이어 디스크로 30분 동안 소독합니다.</li>
	<li>핀셋으로 사파이어 디스크를 뒤집고(라벨이 붙은 면이 아래를 향함) 자외선 아래에서 추가로 30분 동안 살균합니다. 이제 사파이어 디스크가 들어 있는 배양 접시가 세포 배양을 위한 준비가 되었습니다. 알림: 사파이어 디스크는 오토클레이빙으로도 멸균할 수 있습니다.</li>
	<li>세포를 위에서 제조된 사파이어 디스크 상에 시딩하고, 37°C, 95% 습도 및 5%CO2 에서 세포 인큐베이터에서 80%-90% 컨플루언시로 성장시킨다(도 1B). 참고: MTn 태그를 발현하는 안정한 HeLa 세포주는 Jiang et al.26에 기재된 바와 같이 생성되었다.</li>
</ol>2. 고압 냉동(HPF)
주의: 이 실험에는 액체 질소가 사용됩니다. 액체 질소로 작업 할 때는 동상 및 질식을 방지하기 위해 적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용하십시오.
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 실험 최소 2시간 전에 고압 냉동 기계를 준비하십시오.</li>
	<li>A형 HPF 알루미늄 담체(홈: 0.025/0.275mm)를 에탄올 1mL가 들어 있는 2mL 원심분리기 튜브에 옮기고 초음파 세척기에서 10분 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>질적 여과지로 덮인 페트리 접시에서 캐리어를 건조시킵니다 (중간 속도).</li>
	<li>사전 세척된 캐리어를 1-헥사데센에 담그십시오. 참고: BSA는 후속 금 나노입자 합성을 방해할 수 있으므로 현재 실험에서 동결 방지제로 권장되지 않습니다.</li>
	<li>미세 핀셋을 사용하여 배양 접시에서 세포가 있는 사파이어 디스크를 집어 올리십시오. 정성적 여과지(중간 속도)로 라벨이 붙은 표면을 터치하여 초과 매체를 제거합니다. 알림: 물의 열전도율은 매우 낮고 잔여 물이 너무 많으면 동결 효과에 영향을 미칩니다. 세포가 마르지 않도록 최소한의 물을 유지하십시오.</li>
	<li>사파이어 디스크를 HPF 시편 홀더에 장착하고 1-헥사데센이 포함된 0.025mm 깊이의 알루미늄 캐리어로 디스크를 빠르게 덮습니다(그림 1C).</li>
	<li>정성적 여과지(중간 속도)로 과잉 용액을 흡인합니다.</li>
	<li>고압 동결을 위해 시편 홀더를 로드합니다(그림 1D). 참고: 시편 로딩 과정은 온도, 습도, pH 및 산소 함량의 변화로 인한 생리학적 변화를 최소화하기 위해 가능한 한 빠르게(1분 이내) 진행되어야 합니다.</li>
	<li>액체 질소 하의 사파이어 디스크 캐리어 어셈블리를 폼 크라이오박스에 넣고 사용하기 전에 액체 질소의 극저온에 어셈블리를 보관하십시오. 참고: 여기서 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다. 극저온 생물의 표본은 액체 질소 듀어에 수년간 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 동결 치환 고정(FSF) 및 재수화(그림 1E)
<ol><li>자동 동결 대체 기계(AFS)에 액체 질소를 채우고 챔버를 -90°C로 냉각합니다. 주의: 이 실험에는 액체 질소가 사용됩니다. 액체 질소로 작업 할 때는 동상 및 질식을 방지하기 위해 적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용하십시오.</li>
	<li>흄 후드의 20mm 원형 폴리프로필렌 용기(그림 1E)에 아세톤(FSF 용액 1)에 2mL의 0.01% 탄닌산(w/v)을 준비하고 액체 질소로 동결합니다.</li>
	<li>한 쌍의 사전 냉각 핀셋을 사용하여 LN2에서 동결된 FSF 용액 1과 함께 시편(사파이어 디스크 캐리어 어셈블리)을 용기에 넣습니다.</li>
	<li>-90°C에서 FSF 처리를 위해 용기를 예냉된 AFS 챔버로 옮깁니다.</li>
	<li>시편을 -90°C에서 1시간 동안 유지합니다. 그런 다음 미리 냉각된 핀셋을 사용하여 캐리어에서 사파이어 디스크를 분리하고 사파이어 디스크의 표시된 면이 아래를 향하도록 합니다. 알림: 핀셋은 온도 변화를 방지하기 위해 충분히 미리 냉각되어야 합니다. 사파이어 디스크는 쉽게 분리되어야 합니다.</li>
	<li>-90 ° C에서 8-10 시간 더 유지하십시오. 그런 다음 3시간 이내에 -60°C로 예열합니다.</li>
	<li>용기의 FSF 용액 1을 예냉된 아세톤으로 교체하고 1시간 동안 배양합니다. 이 아세톤 세척을 2회 반복합니다.</li>
	<li>3시간 이내에 -30°C로 예열합니다. 이 기간 동안 2mL 원심분리기 튜브에서 아세톤 중 0.01% 우라닐 아세테이트 2mL(메탄올 중 10% 우라닐 아세테이트에서 희석된 FSF 용액 2)를 준비하고 예냉각합니다. 주의 : 현재 실험에 사용 된 우라닐 아세테이트는 방사성이며 독성이 강합니다. 적절한 안전 절차에 따라 처리해야 하며 유해 화학 폐기물로 처리해야 합니다.</li>
	<li>아세톤을 FSF 용액 2로 교체하고 -30°C에서 3시간 동안 인큐베이션합니다.</li>
	<li>용기 내의 FSF 용액 2를 예냉된 아세톤으로 교체하고, -30°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이 아세톤 세척을 2회 반복합니다.</li>
	<li>2시간 이내에 -30°C에서 4°C까지 따뜻하게 합니다.</li>
	<li>아세톤을 pH 5.5에서 1mM CaCl2 및 1mMMgCl2를 함유하는 0.2M HEPES 완충액 2mL로 교체합니다.</li>
	<li>완충액을 한 번 교체하고 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 하룻밤 동안 일시 중지되거나 5단계에서 표본이 다시 동결될 때까지 최소 6시간 동안 계속될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 포유류 세포에 대한 ANSM 기반 AuNP 합성 (그림 1F)
<ol><li>PBS-A 버퍼로 매번 5분 동안 3회 세척합니다.</li>
	<li>실온에서 1mL의 PBS-A 완충액이 들어 있는 35mm 배양 접시에 사파이어 디스크를 옮깁니다. 알림: 항상 사파이어 디스크의 표시된 면이 아래를 향하도록 하고 사파이어 디스크가 겹치거나 셀을 문지르지 않도록 하십시오.</li>
	<li>4.28μL의 2-메르캅토에탄올을 1mL의 PBS-A 완충액이 들어 있는 2mL 원심분리기 튜브에 넣고 흄 후드에서 잘 혼합하여 환원 용액을 준비합니다. 주의 : 2- 메르 캅토 에탄올은 독성이 있으며 매운 냄새가납니다. 적절한 안전 절차에 따라 취급해야 합니다.</li>
	<li>배양 접시의 PBS-A 완충액을 환원액 1mL로 교체하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>사용하기 전에 금 전구체를 준비하십시오.<ol><li>ddH2O중의 10 mM HAuCl4 80 μL를 1 mL의 환원 용액이 들어 있는 2 mL 원심분리 튜브에 넣고, 즉시 와동시킨다. 알림: 용액이 흐려질 수 있습니다.</li>
		<li>ddH2O에 500mM D-페니실라민 80μL를 위 용액에 넣고 즉시 소용돌이칩니다. 알림: 솔루션이 다시 명확해질 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>배양 접시의 용액을 단계 4.5에서 제조된 금 전구체 용액 1 mL로 교체하고, 4°C에서 2시간 동안 배양한다. 참고: 1밀리리터의 금 전구체는 약 1 × 106 세포(35mm 접시에서 합류)와 반응하기에 충분합니다. AuNP가 현저히 작아지면 더 많은 양의 전구체가 필요합니다.</li>
	<li>0.0038 g의 NaBH4를 1.5 mL 원심분리기 튜브에 넣고, 1 mL의 얼음처럼 차가운ddH2O를 첨가하고, 사용 직전에 신선한 100 mMNaBH4를 만들기 위해 와동시킨다.</li>
	<li>4.6 단계의 용액에 20-100 μL의 100 mMNaBH4 를 첨가하고, 즉시 잘 섞이도록 흔들어 준 후, 실온에서 5분 동안 배양한다. 알림: 즉시 사용할 수 있도록 100mM NaBH4 를 새로 준비하십시오. NaBH4를 첨가하면 용액의 색이 점차 붉어졌다가 짙어집니다. 색상 변화가 관찰되지 않으면 대체로 실험이 실패했음을 나타냅니다.</li>
	<li>용액을 2mL의 PBS-A 완충액으로 교체하여 반응을 중지합니다. 알림: 장기간 반응하면 AuNP가 점차 분해되므로 30분 이내에 반응을 중지하는 것이 중요합니다.</li>
</ol>5. 고압 동결 및 동결 치환 고정(그림 1C-F)
참고: 표본은 다시 HPF와 FSF이며 절차는 이전에 섹션 2 및 섹션 3에서 설명한 것과 거의 동일하지만 약간의 수정이 있습니다.
<ol><li>아세톤에 1 % 사산화 오스뮴과 0.1 % 우라닐 아세테이트를 준비합니다 (FSF 용액 3, 아세톤의 4 % 사산화 오스뮴 및 메탄올의 10 % 우라닐 아세테이트에서 희석). 주의 : 사산화 오스뮴과 우라닐 아세테이트는 독성이 강한 화학 물질입니다. 적절한 안전 절차에 따라 처리해야 하며 유해 화학 폐기물로 처리해야 합니다.</li>
	<li>한 쌍의 사전 냉각 핀셋을 사용하여 LN2 하에서 동결된 FSF 용액 3과 함께 시편(사파이어 디스크 캐리어 어셈블리)을 용기에 넣습니다.</li>
	<li>-90 °C에서 FSF 처리를 위해 컨테이너를 사전 냉각 AFS 챔버로 옮기고 다음과 같이 FSF 프로그램을 실행하십시오 : -90 °C에서 8-10 시간 동안 유지하십시오. 그런 다음 3시간 이내에 -60°C로 예열합니다. -60 ° C에서 3 시간 동안 유지하십시오. 그런 다음 3시간 이내에 -30°C로 예열합니다. -30 °C에서 3시간 동안 유지하십시오. 그런 다음 2시간 이내에 4°C로 예열합니다.</li>
	<li>온도가 4°C에 도달하면 시편을 흄 후드로 옮기고 실온에서 15분 동안 유지합니다.</li>
	<li>매번 아세톤으로 3 분 동안 15 번 씻으십시오.</li>
	<li>실온에서 아세톤에서 최소 2시간 동안 유지하십시오.</li>
</ol>6. 수지 침투, 임베딩 및 중합
<ol><li>사용하기 전에 제조업체의 지침에 따라 에폭시 수지 혼합물을 준비하십시오. 주의 : 현재 실험에 사용 된 에폭시 수지는 중합 전에 독성이 있습니다. 적절한 안전 절차에 따라 취급해야 합니다. 중합되지 않은 수지는 폐기 전에 유해 화학 폐기물로 처리하거나 중합해야 합니다.</li>
	<li>사파이어 디스크를 평평한 바닥 임베딩 캡슐로 옮기고 실온에서 최소 30분 동안 수지에 침투시킵니다. 알림: 사파이어 디스크의 표시된 면이 아래를 향하도록 합니다.</li>
	<li>시편을 60°C의 오븐에서 최소 18시간 동안 중합합니다. 참고: 프로토콜은 중합 후 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 중합된 시편 블록은 건조 용기에 수년간 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 초박형 절편
<ol><li>면도기를 사용하여 중합된 시편 블록을 조심스럽게 다듬어 사파이어 디스크를 노출시킵니다.</li>
	<li>사파이어 디스크로 블록 팁을 액체 질소에 몇 초 동안 담그고 실온에서 해동합니다. 동결-해동 작업을 여러 번 반복하여 블록에서 디스크를 분리합니다. 알림: 시편 블록에 균열이 생길 수 있으므로 장기간 동결을 피하십시오. 샘플을 손상시킬 수 있는 과도한 힘을 피하면서 블레이드로 사파이어 디스크를 부드럽게 분리합니다.</li>
	<li>초박형 절편을 위해 블록 면을 사다리꼴 모양으로 자릅니다(그림 1G).</li>
	<li>울트라마이크로톰으로 70-100nm 초박형 섹션을 얻습니다(그림 1H).</li>
	<li>200메쉬 육각형 구리 그리드에서 섹션을 선택합니다. 참고: 프로토콜은 단면화 후 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 거드의 섹션은 수년간 건조한 용기에 보관할 수 있습니다. 원하는 경우 그리드의 섹션을 2% 우라닐 아세톤으로 염색하여 더 나은 막 대비를 얻을 수 있습니다. 납 염색은 나노골드 입자 신호를 가리기 때문에 피해야 합니다.</li>
</ol>8. TEM 이미징(그림 1I)
<ol><li>투과 전자 현미경을 사용하여 구리 그리드의 초박형 부분을 검사합니다. 일반적으로 11kX에서 30kX까지의 배율 범위는 세포에서 AuNP를 시각화하는 데 적합하며 2-3nm AuNP를 보려면 적절한 디포커스 값이 필요합니다.</li>
</ol>

단백질 국소화 분석을 위한 금 나노입자의 직접 합성

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<li>Ding, S. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+role+for+the+host+Vps4+AAA%2B+ATPase+ESCRT+protein+in+the+formation+of+tomato+bushy+stunt+virus+replicase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087(2014).</li>
<li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+synthesis+of+gold+nanoparticles+on+cysteine-rich+tags+in+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells.</a> Protocol Exchange. , (2020).</li>
<li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+synthesis+of+gold+nanoparticles+on+cysteine-rich+tags+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells.</a> Protocol Exchange. , (2020).</li>
<li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tags+for+direct+synthesis+of+EM-visible+gold+nanoparticles+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells.</a> Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).</li>
<li>Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+thiol-derivatised+gold+nanoparticles+in+a+two-phase+liquid-liquid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society%2C+Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system.</a> Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 연구는 여기에서 미세 구조 분해능으로 세포 환경 내에서 단백질 분자의 단일 분자 시각화를 위한 강력한 복제 가능한 EM 라벨링 기술을 제시합니다. 유전적으로 암호화된 시스테인이 풍부한 태그에서 직접 합성된 AuNP는 표적 단백질의 명확하고 정확한 국소화를 제공합니다. 고압 동결 및 동결 대체 기술은 생물학적 시료의 미세 구조를 우수하게 보존합니다. 종합하면, 여기에 제시된 클로닝 가능한 전자 현미경 라벨링 기술은 EM을 사용한 세포 미세 구조 맥락에서 단일 분자의 효율적인 위치 파악 및 인식을 위한 강력한 도구를 제공합니다.
ANSM 메커니즘은 티올레이트-Au(I) 중합체26의 자가핵형성 과정을 억제하며, 이는 티올레이트 캡핑된 금 나노클러스터를 합성하는 데 널리 사용되는 고전적인 Brust-Schiffrin 방법(BSM)27 의 전형적인 반응입니다. 따라서 ANSM 기반 A...

포스트 게놈 시대에 광학 현미경을 위한 단일 분자 리포터로서 녹색 형광 단백질(GFP)의 개발은 현대 생명 과학 연구 분야에 혁명을 일으켰습니다 1,2. 수십 년 동안 전자 현미경(EM)은 나노 해상도3으로 세포 미세 구조를 직관적으로 관찰할 수 있는 강력한 도구였습니다. 그러나 단백질 분자의 정확한 식별과 국소화는 여전히 어려운 과제입니다.
가장 일반적으로 사용되는 EM 표지 기술은 항원-항체 반응을 기반으로 하는 면역전자 현미경(IEM) 표지 기술입니다. 그러나 IEM 사전 임베딩 및 IEM 사후 임베딩(수지 절편 또는 수화 극저온 절편)을 포함하여 IEM 라벨링 분야에서 많은 기술이 개발되었지만 여전히 낮은 라벨링 효율(<10%)4,5, 이는 샘플 준비 및 항체 품질과 관련이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 유전적으로 암호화된 태그를 개발하는 것은 큰 응용 가능성을 가지고 있습니다.
최근 몇 년 동안 두 가지 주요 유형의 EM 태그가 철저히 조사되었습니다. 한 가지 유형은 EM 시각화6,7,8,9,10,11,12를 위해 APEX2와 같은 태그를 사용하여 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)을 삼온성 폴리머로 산화시키는 DAB 염색 방법입니다. 세포 내 영역에서 고농도 단백질의 표지를 가능하게 하지만 단일 분자 계수에는 적합하지 않습니다. 다른 유형은 페리틴 13 및 메탈로티오네인(MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26과 같은 금속 결합 단백질을 사용하여 전자 밀도가 높은 금속 침전물을 생성합니다 . EM 시각화를 위한 현장. 후자만이 단일 분자 시각화 및 계수에 대한 실질적인 잠재력을 가지고 있습니다. 페리틴의 분자 크기가 너무 커서 유망한 태그로 사용할 수 없는 반면, MT의 작은 크기(~5kD)와 20개의 시스테인을 통해 다양한 이온을 결합하는 능력은 큰 관심을 끌었습니다. 여러 실험실에서 Au+로 직접 배양하여 정제된 MT 융합 단백질 또는 MT 발현 세포에 라벨을 붙이려고 시도했습니다. 이러한 시도는 초기에 MT 태그가 금 이온과 결합하여 고대비 신호를 형성할 수 있다는 것을 증명했지만, 실제로 세포에서 개별 단백질의 효과적인 식별을 달성한 것은 없으며 널리 적용되지 않습니다 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
EM 시각화를 위한 전자 밀도 라벨로 시스테인이 풍부한 태그(예: MT, MT 변이체 MTn 및 MTα, AFP)에서 직접 2-6nm 크기의 AuNP를 합성하는 ANSM 기반 AuNP 합성 기술은 세포에서 단백질 라벨링 및 단일 분자 검출을 위한 최초의 신뢰할 수 있고 적용 가능한 접근 방식입니다24,25,26. 분리된 태그 융합 단백질에서 AuNP의 특이적 합성을 가능하게 하고 비고정 또는 화학적으로 고정된 원핵생물(E. coli) 및 진핵생물(S. pombe) 세포에서 전례 없는 표지 효율을 달성했습니다. 그러나 포유류 세포 또는 조직과 같은 고급 시스템에서 동일한 프로토콜을 구현하려면 더 복잡한 세포 내 산화 환원 항상성 및 더 취약한 세포 구조와 같은 추가적인 문제가 필요합니다.
이 연구는 유전적으로 암호화된 시스테인이 풍부한 태그(MT)를 라벨링하기 위한 새로운 ANSM 기반 AuNP 합성 기술과 HPF/FSF-재수화-HPF/FSF 샘플 준비 방법을 결합한 클로닝 가능한 EM 라벨링 기술을 제시하여 HeLa 세포의 ER 막, ER 내강 및 미토콘드리아 매트릭스에서 태그가 지정된 단백질의 명확한 단일 분자 식별을 가능하게 합니다. 현재의 방법은 높은 표지 효율, 높은 신호 대 잡음비, 단일 분자 표지 및 강력한 보편성의 특성을 결합하고 있으며, 이 방법은 생명 과학 연구에서 광범위한 응용 전망을 가지고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.025 mm / 0.275 mm 알루미늄 캐리어</td><td>Beijing Wulundes Biotech Ltd. 또는 M. Wohlwend</td><td></td><td></td>의 엔지니어링 사무소</tr><tr><td>0.2 M HEPES 완충액</td><td></td><td></td><td>980 mL의 ddH<2 / sub>O에 HEPES (0.2 M)를 용해 한 다음 10 mL의 100 mM MgCl2 및 100 mM CaCl2 (최종 농도 1 mM)의 10 mL를 첨가하고, 각각 pH를 5.5</td></tr><tr><td>1.5 mL MaxyClear 스냅 잠금 마이크로 튜브</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 폴리 프로필렌 나사 캡 마이크로 튜브</td><td>Biologix</td><td>81-0204</td><td></td></tr><tr><td>200 메쉬 육각형 구리 그리드</td><td>Tedpella inc</td><td>G200HEX</td><td></td></tr><tr><td>2- 메르 캅토 에탄올</td><td>Amresco</td><td>0482-250ML</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 세포 배양 접시</td><td>코닝</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>50mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430928</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td><td>31025</td><td></td></tr><tr><td>자동 동결 대체 기계</td><td>Leica</td><td>AFS2</td><td></td></tr><tr>HPF <td>Beijing Wulundes Biotech Ltd</td><td>.용 맞춤형 3.05mm x 0.66mm 시편 홀더</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-페니실아민</td><td>TCI</td><td>P0147</td><td></td></tr><tr><td>둘베코' s modified Eagle medium</td><td>GBICO C11965500BT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>GBICO</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>플랫 바텀 임베딩 캡슐</td><td>Tedpella inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foam cryobox</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 resin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>HAuCl4</td><td>Sigma</td><td>4022-1G</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마&nbsp;</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>HPF 기계</td><td>Wohlwend&nbsp;</td><td>HPF 컴팩트01</td><td></td></tr><tr><td>Methonal&nbsp;</td><td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td><td>12397</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Sigma</td><td>480886-25G</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>PBS-A 버퍼</td><td></td><td></td><td>용해 NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) ddH2O 1 L에 pH 7.4로 조정</td></tr><tr><td>질적 여과지(중속)</td> <td>Beyotime 생명공학</td><td>FFT08</td><td></td></tr><tr><td>사파이어 디스크</td><td>Beijing Wulundes Biotech Ltd. 또는 M. Wohlwend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>내용제 펜</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62053-B</td><td></td></tr><tr><td>SPI-Pon 812 수지</td><td>SPI Inc</td><td>02659-AB</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경 검사:</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 스피릿</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>GBICO</td><td>C25200-056</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramictotome</td><td>Leica</td><td>FC7</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이</td>트 <td>전자 현미경 과학</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 em-visible gold nanoparticles의 직접 합성

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

미세 구조적 분해능으로 세포에서 단백질 분자의 정확한 국소화를 분석하는 것은 모든 살아있는 유기체의 다양한 생리학적 또는 병리학적 과정을 연구하는 데 매우 중요합니다. 따라서 전자 현미경 프로브로 사용할 수 있는 복제 가능한 태그의 개발은 형광 단백질이 광학 이미징 분야에서 중요한 역할을 한 것처럼 큰 가치가 있습니다. 자가핵형성 억제 메커니즘(ANSM)이 최근 밝혀졌으며, 이는 메탈로티오네인(MT) 및 부동액 단백질(AFP)과 같은 시스테인이 풍부한 태그에서 금 나노입자(AuNP)의 특이적 합성을 가능하게 합니다.
ANSM을 기반으로 전자 현미경 표지 기술이 개발되어 전례 없는 표지 효율로 원핵 및 진핵 세포에서 태그가 부착된 단백질을 특이적으로 검출할 수 있습니다. 이 연구는 미세 구조가 잘 보존된 포유류 세포에서 MTn(알데히드 반응성 잔기가 없는 조작된 MT 변이체) 융합 단백질을 검출하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜에서, 고압 동결 및 동결 치환 고정은 비-알데히드 고정제(예: 탄닌산, 우라닐 아세테이트)를 사용하여 수행되었으며, 이는 거의 천연 미세 구조를 보존하고 알데히드 가교결합으로 인한 태그 활성의 손상을 방지하였다.
ANSM계 AuNP 합성 전에 간단한 1단계 재수화를 사용하였다. 그 결과 태그된 단백질이 소포체(ER)의 막과 내강을 포함한 다양한 세포 소기관을 표적으로 삼고 미토콘드리아 매트릭스가 높은 효율과 특이성으로 검출되는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 생물학자들에게 세포 미세 구조적 맥락에서 단일 분자 수준에서 방대한 범위의 생물학적 문제를 해결할 수 있는 강력한 프로토콜을 제공합니다.

ANSM 기반 AuNP 합성 기술은 TEM26으로 MT 태그가 부착된 단백질을 표지하고 검출하는 데 매우 유용한 도구입니다. 포유류 세포에서 그 견고성을 검증하기 위해 Hela 세포에서 EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn 또는 Mito-acGFP-MTn을 발현하는 3개의 안정적인 세포주를 생성했습니다. KDEL은 표준 C-말단 소포체(ER) 유지/회수 서열로, 융합 단백질 EGFP-MTn-KDEL을 ER 내강 또는 핵외피(NE)의 핵주위 공간 내에 유지합니다. Ost4는 올리고사카릴트랜스퍼라제 복합체의 서브유닛으로, 초기 폴리펩타이드의 N-글리코실화를 촉매하는 ER 및 NE에 국한된 막 단백질 복합체입니다. Ost4 융합 단백질 Ost4-EGFP-MTn의 C 말단은 세포질과 마주보고 있습니다. 미토는 미토콘드리아 기질에서 융합 단백질 Mito-acGFP-MTn을 표적으로 하는 미토콘드리아 표적화 서열이다.
알데히드 고정제...

본 프로토콜은 새로운 자가핵형성 억제 메커니즘 기반 금 나노입자 합성 기술을 사용하여 세포에서 메탈로티오네인 태그가 부착된 단백질을 검출하기 위한 클로너블 전자 현미경 표지 기술을 설명합니다.

잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 EM-Visible Gold Nanoparticles의 직접 합성

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various ...

단백질 검출 및 국소화는 생물학 연구에 필수적입니다. 당사의 프로토콜은 유전적으로 인코딩된 태그를 사용하는 새로운 EM 라벨링 기술을 설명하며, 이를 통해 잘 보존된 미세 구조로 현장에서 단일 분자 시각화가 가능합니다. 과도한 고정을 피하는 것이 중요합니다.라벨링 방법은 알데히드 가교에 매우 민감한 태그의 시스테인 활성을 기반으로 합니다. 우리의 프로토콜은 알데히드 고정제의 사용을 피하고 태그 활성과 미세 구조를 보존합니다. 동시에.EM 라벨링은 형태가 좋지 않거나 라벨링이 비효율적이어서 항상 어려웠습니다. 당사의 프로토콜은 개별 단백질에 직접 현장 나노 입자를 합성하여 높은 신호 대 잡음비, 높은 효율성 및 특이성으로 표적 단백질의 명확하고 정확한 국소화를 제공합니다. 우리는 지금까지 분리된 단백질, 대장균 세포, 효모 세포 및 HeLa 세포에서 우수한 표지를 달성했습니다.우리는 조직 샘플에 적용하는 방법을 탐색하고 최적화할 것입니다. 널리 사용되는 Cryo-FIB 및 Cryo-EM 기술을 결합하면 중요한 생물학적 문제를 해결할 수 있습니다.

direct-synthesis-em-visible-gold-nanoparticles-cells-for-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 전자 micrographs에 휘황 태그 단백질을 지역화하는 방법을 설명합니다. 형광 먼저 ultrathin 섹션에 사진 활성 현지화 현미경을 사용하여 지역화되어 있습니다. 이러한 이미지는 다음 같은 섹션의 전자 micrographs으로 정렬되어 있습니다.

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

이 동영상은 단백질과 단백질의 상호작용을 평가하기 위한 BiFC-PALM(광활성화 국소화 현미경과 이분자 형광 보완법의 조합)에 대해 설명합니다. BiFC는 두 개의 형광 단백질 단편과 두 개의 상호 작용하는 관심 단백질의 융합을 포함합니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 단편이 근접하게 되어 두 부분이 함께 모여 기능적 형광 단백질을 재구성할 수 있습니다. 단일 형광단의 형광은 PALM에 의해 세포 내부의 단일 분자 수준에서 국한됩니다.

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

효모, 사카로 미세스 세 레비 시아는, 엔도 좀 시스템의 생합성과 기능을 조절하는 유전자를 확인하고 연구하는 중요한 모델 생물이다. 여기에서 우리는 초 미세 구조 연구를위한 엔도 좀 구획의 특정 표시에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

미세 구조의 분석을위한 효모 엔도 좀의 시스템 Nanogold 라벨링

전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

postembedding immunogold 방법은 특정 분자의 세포 내 국소화에 대한 고해상도 분석을 제공하는 가장 효과적인 방법 중 하나입니다. 여기에서는 망막 리본 시냅스에서 글루타메이트 수용체를 정량적으로 분석하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

우리 생체 10 nm 금 나노 입자, 표면에 폴 리 에틸렌 글리콜을 코팅 하 여 공업화를 합성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 입자 사용 생체 외에서 수 있으며 vivo에서 나노 세포와 세포 외 공간에 치료제를 제공에 대 한 기존의 나노 크기와 접근 하기 어려운.

기능성된 10 nm 폴리머-코팅 된 금 입자 피 대상에 대 한 및 약물 전달의 합성

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

유세포 분석 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경검사법에 의한 기능적, 근적외선 발광 광발광 금 나노클러스터 및 HeLa 세포 내부의 직접 검출을 위한 신뢰할 수 있고 쉽게 재현 가능한 방법이 설명되어 있습니다.

생물학적 응용 을 위한 근적외선 방출 금 나노클러스터의 합성

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

학습하세요 EM 가시성 금 나노입자를 이용한 세포 내 단백질 국소화 분석 기법을. 알데히드 고정제를 피하고 미세 구조를 보존하면서 단일 분자 수준에서 정밀한 단백질 시각화를 달성하는 혁신적인 방법입니다.

잘 보존된 미세 구조를 가진 단백질 국소화 분석을 위한 세포에서 EM-Visible Gold Nanoparticles의 직접 합성

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