Name: 단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 미토콘드리아 2단계 태그 없는 분리법으로 단백질 발견 및 정량 분석을 개선하는 방법입니다. 차등 원심분리와 면역 포획을 활용하여 1차 세포와 조직에서 고품질 미토콘드리아를 분리하고 면역 활성화 및 암 연구에 적용할 수 있습니다.

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도움을 주신 Manfredo Quadroni, 단백질 분석 시설 및 로잔 대학의 전자 현미경 시설에 감사드립니다. 또한 원고에 대한 조언과 피드백을 주신 H.G. Sprenger, K. Maundrell, Jourdain 연구소 구성원들에게도 감사드립니다. 이 작업은 Pierre-Mercier pour la Science 재단과 스위스 국립 과학 재단 (프로젝트 보조금 310030_200796)의 지원을 받았습니다.

장갑은 항상 착용해야 하며 층류 후드 아래에서 세포 배양 단계를 수행해야 합니다. 세포는 5%CO2와 함께 37°C 인큐베이터에서 유지된다. 이 프로토콜에 제시된 연구는 로잔 대학과 동물 사용에 대한 스위스 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다.
1. RAW264.7 대식세포주의 배양
<ol><li>5% 열 비활성화 소 태아 혈청(HI-FBS)과 100IU/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신(P/S)이 보충된 고혈당 및 글루타민이 포함된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)에서 마우스 대식세포 RAW264.7 세포를 성장시킵니다. 참고: 미토콘드리아를 분리하려면 단일 합류 15cm 플레이트(약 70 x 10 7 RAW264.7 세포)로 충분합니다.</li>
	<li>RAW264.7 세포를 조직 배양 플레이트에 유지한다. 1 x 105 cells/mL의 초기 파종 밀도는 3일 안에 합류 플레이트로 이어집니다. 15cm 플레이트에 배지에 25mL의 세포 현탁액을 사용합니다. RAW264.7 세포는 세포 분열 속도가 높으며 대부분의 세포주보다 더 자주 분할해야 합니다.</li>
	<li>RAW264.7 셀 분리<ol><li>배지를 흡인하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척합니다.</li>
		<li>15cm 플레이트의 경우 8mL의 따뜻한 RAW 해리 완충액(270mM 염화칼륨,H2O중 30mM 시트르산나트륨 이수화물, 멸균 여과됨)을 추가하고 세포를 37°C에서 5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>플레이트에 동일한 부피의 배지를 추가하고(해리 완충액의 1:1 희석) 피펫을 사용하여 세포를 분리하고 균질화합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브를 실온에서 3분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다.</li>
		<li>상청액을 흡인하고 세포 계수를 위해 적절한 양의 배지(1.1단계에 설명됨)에 펠릿을 재현탁합니다. 알림: 트립신이나 세포 스크레이퍼와 같은 RAW264.7 세포를 분리하는 다른 방법을 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 세포에 더 가혹하며 분리 후 며칠 동안 M1 유사 대식세포로 분극화될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 골수 유래 대식세포(BMDM)의 분리 및 배양
참고: 여기에 설명된 프로토콜은 단일 마우스용이며 여러 마우스용으로 확장할 수 있습니다. BMDM 분리 및 배양에 대한 상세한 프로토콜은 다른 문헌13,14에 기재되어 있다.
<ol><li>고용량의 CO2가 있는8-12주 된 C57BL/6 마우스를 희생합니다. 참고: 수컷 또는 암컷 마우스를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>마우스에 75% 에탄올을 뿌려 살균합니다.</li>
	<li>마우스에서 엉덩이, 대퇴골 및 경골을 해부하고 수집합니다15.</li>
	<li>대퇴골과 경골에서 골수를 채취하려면 양쪽 뼈의 무릎 관절 끝을 제거하십시오15. 비구를 제거하여 엉덩이에서 골수를 회수합니다.</li>
	<li>얼음 위에 보관된 4mL의 BMDM 배지(5% HI-FBS, P/S 및 10mM HEPES가 보충된 고포도당 및 글루타민이 포함된 DMEM)가 있는 50mL 원뿔형 튜브로 뼈를 옮깁니다. 알림: 해부 중 골수가 건조되지 않도록 뼈를 매체에 보관하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>4mL의 PBS와 4mL의 따뜻한 BMDM 배지를 6웰 플레이트의 서로 다른 두 웰에 추가합니다.</li>
	<li>뼈와 배지를 50mL 원뿔형 튜브에서 6웰 플레이트의 빈 웰로 옮깁니다.</li>
	<li>한 쌍의 집게를 사용하여 뼈를 PBS 웰로 옮겨 씻으십시오.</li>
	<li>따뜻한 BMDM 매체가 들어 있는 웰로 뼈를 옮깁니다.</li>
	<li>집게로 두 개의 0.5mL 튜브 바닥에 직경 1-2mm의 구멍을 뚫고 1.5mL 튜브에 넣습니다. 알림: 이 빠른 단계를 위해 튜브에 미디어를 추가할 필요는 없습니다.</li>
	<li>각 0.5mL 튜브에 노출된 뼈의 골수가 튜브 바닥을 향하도록 대퇴골, 경골 및 엉덩이를 배치합니다.</li>
	<li>튜브를 실온에서 1분 동안 13,000 x g 로 원심분리하여 0.5mL 튜브의 구멍을 통해 골수와 남은 배지를 1.5mL 튜브로 수집합니다. 뼈가 있는 0.5mL 튜브를 폐기합니다.</li>
	<li>골수 펠릿을 BMDM 배지에 재현탁하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>BMDM 배지를 최대 10mL까지 추가합니다.</li>
	<li>50mL 원뿔형 튜브에 40μm 세포 여과기를 놓고 이를 통해 골수 현탁액을 걸러냅니다.</li>
	<li>여과된 현탁액을 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 손상되지 않은 세포를 회수하고 세포 현탁액에서 작은 파편을 제거합니다.</li>
	<li>50ng/mL의 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)가 보충된 BMDM 배지 70mL를 준비합니다.</li>
	<li>펠릿을 10mL의 M-CSF 보충 BMDM 배지에 재현탁합니다.</li>
	<li>9mL의 M-CSF가 보충된 BMDM 배지를 7개의 10cm 페트리 접시 각각에 추가합니다.</li>
	<li>7개의 10cm 페트리 접시 각각에 1mL의 세포(약 1 x 107 세포)를 플레이트합니다.</li>
	<li>플레이트를 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 각 플레이트의 세포 현탁액을 균질화하고 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다.</li>
	<li>3일 후 50ng/mL M-CSF가 보충된 따뜻한 BMDM 배지 5mL를 각 플레이트에 추가합니다.</li>
	<li>3일 후(6일째, 골수 분리 후), 현미경으로 BMDM의 부착 및 분화를 검증한다. 참고: 이 시점에서 미토콘드리아 분리로 직접 진행할 수 있습니다(단계 3). 또는 BMDM을 다시 도금하여 사이토카인과 소분자로 치료할 수 있습니다.</li>
	<li>BMDM 분리<ol><li>각 플레이트에서 배지를 흡인하고 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 보충된 차가운 PBS 7mL를 추가합니다.</li>
		<li>세포를 4°C에서 7-8분 동안 배양합니다.</li>
		<li>10mL 피펫을 사용하여 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 BMDM을 분리합니다.</li>
		<li>7개 플레이트 모두에서 재현탁된 BMDM을 단일 50mL 원뿔형 튜브에 함께 풀링하고 실온에서 3분 동안 300 x g 로 원심분리합니다.</li>
		<li>상층액을 흡인하고 세포 계수를 위해 40mL의 따뜻한 BMDM 배지에 세포를 재현탁합니다. 참고: 마우스당7-9 x 10 7개의 BMDM을 얻을 수 있습니다. 미토콘드리아 분리를 위한 최소 6 x 107 BMDM은 단백질체학에 권장됩니다.</li>
		<li>원하는 경우 실험 목표에 따라 BMDM을 플레이트하고 처리합니다. 그렇지 않은 경우 3.3단계로 바로 진행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 미분 원심분리에 의한 미정제 미토콘드리아 분획의 제조
알림: 4°C에서 모든 원심분리 단계를 수행합니다. 두 개의 원심분리기가 필요한데, 하나는 최소 300 x g의 상대 원심력을 가진 원뿔형 튜브용 스윙 아웃 로터 및 어댑터가 있고, 다른 하나는 1.5 mL 튜브에 적합한 최소 21,000 x g의 상대 원심력을 가진 원심분리기가 필요합니다. 부착 세포를 사용할 때는 세포 스크레이퍼를 사용하십시오.
<ol><li>부착 세포의 경우 배지를 흡인하고 15cm 플레이트당 PBS 10mL를 추가합니다. 알림: PBS에서 세포를 긁으면 동시에 세포를 세척할 수 있습니다. 세포가 이미 현탁액에 있는 경우 3.3단계로 직접 진행합니다.</li>
	<li>세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리하고 단일 50mL 원뿔형 튜브에 풀링합니다. 위아래로 피펫팅하여 세포 현탁액을 균질화합니다. 알림: 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 분리할 수 있는데, 이는 더 빠르고 곧 용해되기 때문입니다.</li>
	<li>각 실험 조건에 대해 세포 현탁액 부피의 5%를 1.5mL 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다. 알림: 현탁 셀을 사용할 때는 FBS와 같은 매체에서 가능한 오염 물질을 제거하기 전에 PBS로 세포를 한 번 세척해야 합니다.</li>
	<li>상청액을 버리고 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. 참고: 이것은 단백질체학에 대한 "총 세포" 분획을 나타냅니다.</li>
	<li>3.1 또는 3.2 단계의 나머지 샘플을 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>얼음 위와 얼음처럼 차가운 버퍼를 사용하여 다음 단계를 모두 수행하십시오.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 5mL의 얼음처럼 차가운 미토콘드리아 완충액(MB)(210mM 만니톨, 70mM 자당, 10mM HEPES/NaOH[pH 7.4] 및 1mM EDTA)에 세포 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하여 세포를 회수한다.</li>
	<li>세포 펠릿을 0.5mL의 차가운 MB에 재현탁하고 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 알림: 이 절차는 1.5 x 10 8 BMDM cells/mL 또는 3 x 108 RAW264.7 cells/mL의 대략적인 세포 농도를 산출합니다.</li>
	<li>25G 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 바늘을 통해 30 계대하여 세포 현탁액을 균질화합니다(그림 1A).</li>
	<li>차가운 MB 1mL를 튜브에 넣고 반전으로 혼합합니다. 균질화된 세포 현탁액을 2,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>세포 펠릿을 방해하지 않고 얼음 위의 신선한 1.5mL 튜브에 상층액 1mL를 옮깁니다. 세포 펠릿을 재현탁하고 3.7단계에서와 같이 다시 균질화합니다.</li>
	<li>균질화된 세포 펠릿과 이전 두 단계의 상청액을 단일 1.5mL 튜브에 풀링하고 4°C에서 5분 동안 2,000 x g 에서 원심분리합니다. 참고: 이 시점에서 펠릿은 대부분 핵과 깨지지 않은 세포를 포함하며 폐기됩니다. 상층액에는 세포 파편, 세포질 및 미토콘드리아를 포함한 세포 소기관이 포함되어 있습니다(그림 1B).</li>
	<li>상청액을 4개의 1.5mL 튜브로 나눕니다. 알림: 이 단계에서 상청액을 여러 튜브로 나누면 다음 단계에서 오염 물질 제거가 향상됩니다.</li>
	<li>MB를 추가하여 4개의 튜브 각각에 1mL의 최종 부피를 만듭니다. 튜브를 13,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 반전하여 혼합합니다. 알림: 이 단계 후, 두 개의 층이 있는 펠릿이 보입니다. 바닥의 단단한 갈색 펠릿에는 미토콘드리아가 포함되어 있으며 추가 정제를 위해 보관됩니다(그림 1C). 상부, 느슨한, 흰색 펠릿은 다른 세포 구조를 포함하고 폐기 될 수 있습니다.</li>
	<li>이 단계를 신중하게 수행합니다. 가능한 한 많은 흰색 상부 펠릿으로 상청액을 제거합니다. 부드럽게 피펫팅하여, 흰색 펠릿을 다시 현탁한 다음 버릴 수 있습니다., 갈색 미토콘드리아 펠릿을 그대로 둡니다.</li>
	<li>미토콘드리아 알갱이가 있는 4개의 튜브 중 하나를 얼음 위에 두십시오. 이것은 단백질체학에 대한 "미토콘드리아" 분획을 나타냅니다.</li>
	<li>다른 3개의 펠릿을 1.5mL 튜브에 모아 1mL의 최종 부피로 만듭니다.</li>
</ol>4. 미토콘드리아의 초상자성 항체 기반 정제
알림: 4°C의 차가운 방에서 다음 단계를 모두 수행하십시오.
<ol><li>3.18 단계에서 미정제 미토콘드리아 제제 1mL를 15mL 원추형 튜브로 옮기고 150mM NaCl(MB + NaCl)이 보충된 MB 7mL를 추가합니다. 참고: NaCl을 첨가하면 항체 결합이 향상되고 비드 및 미토콘드리아에 대한 오염 물질의 비특이적 결합이 감소합니다.</li>
	<li>50μL의 Tomm22 비드를 8mL 미토콘드리아 현탁액(그림 1D)에 추가하고 튜브를 4°C에서 저속으로 회전하는 휠에서 15분 동안 배양합니다. 참고: Tomm22 비드는 마우스에서 자란 Tomm22 단클론 항체에 공유 결합되어 초상자성 비드에 결합됩니다.</li>
	<li>그 동안 자석에 기둥을 놓습니다.</li>
	<li>컬럼을 8mL의 MB + NaCl로 평형화하고 플로우 스루를 버립니다.</li>
	<li>샘플을 Tomm22 비드로 4°C에서 15분 인큐베이션한 후, 샘플을 컬럼으로 옮긴다. 플로우 스루를 폐기합니다. 참고: 미토콘드리아는 컬럼의 마그네틱 비드에 부착된 상태로 유지됩니다(그림 1E).</li>
	<li>컬럼을 8mL의 MB + NaCl로 세 번 세척합니다.</li>
	<li>자석에서 컬럼을 제거하고 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>컬럼에 MB + NaCl 1.5mL를 첨가하여 미토콘드리아를 용출하고 즉시 플런저를 적용하여 정제된 미토콘드리아를 튜브에 용출합니다.</li>
	<li>용출된 미토콘드리아를 1.5mL 튜브로 옮기고 4°C에서 10분 동안 21,000 x g 에서 원심분리합니다. 알림: 갈색 펠릿이 형성됩니다. 여기에는 분리된 미토콘드리아와 일부 항체 결합 비드가 포함됩니다(그림 1F).</li>
	<li>펠릿에서 상청액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿은 단백질체학에 대한 "순수 미토콘드리아" 분획을 나타냅니다. 이 펠릿은 3.4 및 3.17 단계의 펠릿과 함께 -20 °C에서 보관할 수 있으며 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

2단계 미토콘드리아 분리를 사용한 향상된 단백질 정량 분석

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</ol>

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우리는 미토콘드리아 분리를 위한 향상된 순도를 달성하기 위해 차등 원심분리와 면역포획을 결합했습니다. 우리의 절차는 새로운 미토콘드리아 단백질의 식별 및 특성화를 위한 1차 물질에 대한 접근을 허용합니다. 이 프로토콜은 간단하고 강력하며 유전자 변형 없이 세포주, 일차 세포 및 조직에 적용할 수 있습니다. 우리는 정제 절차 전반에 걸쳐 여러 단계에서 채취한 샘플에 대한 면역블로팅 및 단백질체학 분석을 통해 프로토콜을 검증했습니다.
단일 분리 방법과 비교하여 다양한 특성의 농축 단계(여기서는 원심분리 및 면역 표지)의 조합은 미토콘드리아를 분리하기 위한 보다 강력한 프로토콜을 생성합니다. 이는 미토콘드리아 단백질이 두 정제 모두에서 농축되지만 두 농축 단계 후에도 오염 물질도 농축될 가능성이 낮기 때문입니다. 높은 미토콘드리아 순도는 밀도 구배 초원심분리에 의해서도 달성될 수 있지만, 이 접근법은 많은 양의 출발 물질과 초원심분리기에 대한 접근을 필요로 한다. 마지막으로, 태그 기반 미토콘드리아 분리(mitochondrial isolation)20를 기반으로 하는 최근의 방법과는 대조적으로, 우리의 접근법은 샘플의 유전자 변형을 필요로 하지 않기 때문에, 모든 출처의 1차 물질에 적합하다.
프로토콜을 적용할 때 실험 설계에서 몇 가지 기술적 및 생물학적 고려 사항을 고려해야 합니다. (1) 충분한 물질을 얻기 위해서는 출발 물질의 양이 중요합니다. 필연적으로, 소수의 미토콘드리아는 균질화 (단계 3.10) 동안, 모든 세포가 용해되지 않기 때문에, 또는 3 개의 컬럼 세척 (단계 4.6) 동안 손실 될 것이다. 우리의 프로토콜은 수율보다 순도에 초점을 맞추고 있지만, 미토콘드리아 분리의 효율성과 그에 따른 수율은 측정되거나 최적화되지 않았습니다. 더 많은 Tomm22 비드와 더 많은 컬럼을 사용하면 미토콘드리아 회수율이 증가할 것으로 예상됩니다. 동시에, 균질화 단계의 철저한 최적화는 또한 미토콘드리아 수율 향상으로 이어질 수 있다. 이 프로토콜과 RAW264.7 세포 및 BMDM에 대해 여기에서 보고하는 초기 세포 번호는 단백질체학에 적합하며 다른 응용 분야에 맞게 조정할 수 있습니다. 1차 BMDM의 경우 단일 마우스가 한 번의 반복에 충분하다는 것을 발견했습니다. 필요한 경우 절차를 확장하여 여러 동물에서 BMDM을 분리한 다음 풀링하여 충분한 재료를 얻을 수 있습니다. 세포 수는 세포 유형, 크기 및 미토콘드리아 함량에 따라 최적화될 수 있습니다. (2) Tomm22는 모든 세포 유형 및 조직의 미토콘드리아에서 발현됩니다.21, 그러나 그 발현 수준은 다를 수 있습니다. 따라서 서로 다른 조건을 비교하기 위해 실험을 설계할 때 Tomm22의 발현 수준이 비교 가능한지 확인하는 것이 중요합니다. 또한, Tomm22의 유비쿼터스 발현으로 인해 복잡한 조직 내에서 세포 유형 특이적 미토콘드리아 단백질을 연구하는 것은 불가능합니다. (3) 순수한 미토콘드리아를 생성하는 데 필요한 시간(약 2.5시간)은 대사 프로필의 변화와 같은 일시적인 사건에 대한 연구와 양립할 수 없습니다. 이 경우 직접 태그 기반 면역 캡처를 권장합니다9, 또한 세포 유형 특정 미토콘드리아를 연구 할 수 있습니다 in vivo20. (4) Tomm22 항체 표지 비드 단독을 사용하여 얻은 분리된 미토콘드리아에 대한 연구는 기능 분석에서 활성을 나타냈지만11, 우리의 프로토콜로 생성된 미토콘드리아가 다운스트림 활성 기반 분석과 호환되는지 여부는 아직 결정되지 않았습니다. MitoTracker 또는 테트라메틸로다민 메틸 에스테르 과염소산염(TMRM) 염색 또는 호흡 측정 측정은 분리된 미토콘드리아의 기능을 정량화하는 잠재적인 접근 방식입니다22. (5) 컬럼에서 "미토-순수" 샘플을 용리한 후 일부 Tomm22 비드가 순수 미토콘드리아 분획(그림 2B). 트립신 분해 및 단백질 질량 분석에 간섭이 관찰되지 않았지만 이러한 비드와 면역글로불린의 존재는 다른 다운스트림 응용 분야에서 고려되어야 합니다. Tomm22 항체는 마우스에서 생산되는 단클론 항체입니다23따라서 면역 블로팅에서 마우스에 대한 2 차 항체를 사용할 때 면역 글로불린 사슬의 크기에서 비특이적 인 밴드를 생성한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. (6) 세포 현탁액의 완전한 균질화는 미토콘드리아의 성공적인 분리의 핵심입니다. 여기서는 25G 바늘이 있는 주사기를 사용하여 RAW264.7 세포와 BMDM을 모두 용해합니다. 그러나 세포 유형 및 크기에 따라 Dounce 균질화기 사용과 같은 다른 기계적 균질화 방법 또는 세포 균질화 장치와 같은 보다 제어된 접근 방식이 더 적합할 수 있습니다. 부드러운 초음파 처리와 같은 비 기계적 균질화 방법도 고려할 수 있습니다. 조직 균질화 접근법은 다른 연구에서 추가로 논의됩니다24,25. (7) 면역 블로팅에 의한 검증이 가장 간단하고 저렴한 방법이지만 그 결과가 전체 세포 기관 수준의 변화와 항상 상관관계가 있는 것은 아닙니다. 그렇기 때문에 미토콘드리아와 다른 세포 기관의 농축 또는 고갈을 완전히 검증하기 위해 단백질체학을 사용하는 것이 좋습니다.
여기에 설명된 2단계 미토콘드리아 정제 프로토콜은 미토콘드리아 순도가 증가하는 순차적인 샘플을 생성할 수 있게 해주며, 이를 통해 감산 단백질체학(subtractactive proteomics)을 통해 새로운 미토콘드리아 단백질 후보를 발견할 수 있게 해주었다12. 분석을 위해 엄격한 임계값을 사용하여 상당히 풍부한 미토콘드리아 단백질을 선택하며, 이로 인해 알려진 일부 미토콘드리아 단백질을 식별하지 못할 수 있지만(그림 3A) 새로운 미토콘드리아 단백질 발견에 대한 위양성 비율은 감소합니다. 그럼에도 불구하고, 우리의 프로토콜에 의해 밝혀진 모든 후보 단백질은 직교 접근법을 통해 검증되어야한다는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 미토콘드리아와의 연관성을 현미경으로 또는 프로테아제 보호 분석으로 검증하기 위해 카르복시 말단 GFP-태깅 또는 내인성 단백질에 대한 항체 사용을 권장합니다.
변형되지 않은 세포와 조직의 경우 우리 방법을 직접 적용하면 미토콘드리아가 건강 및 질병 조건에서 환경에 어떻게 변화하고 적응하는지 조사할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 세포주, 동물 질병 모델, 인체 체액, 심지어 수술 생검에 대한 우리의 프로토콜을 적용하는 것은 미토콘드리아 및 관련 장애에 대한 이해를 높이는 데 특히 유용할 수 있습니다.

미토콘드리아는 세포의 대사 요구를 감지하고 적응할 수 있는 복잡하고 역동적인 세포 기관입니다. 세포 대사의 복잡성의 중심인 미토콘드리아는 탄수화물, 단백질, 지질, 핵산 및 보조 인자 대사 반응이 수렴하는 대사 허브 역할을 합니다1. 그들은 또한 선천성 면역 반응의 경로와 이온 및 활성 산소 종의 변화에 대한 반응에 대한 신호 소기관 역할을 합니다 2,3. 현재까지 약 1,100개의 단백질이 미토콘드리아 4,5,6에 매핑되었지만, 특히 특정 세포 유형에서만 또는 특정 환경 조건에서 일시적으로 발현되는 단백질은 더 많이 발견되어야 한다고 가정할 수 있습니다. 관심 대사 상태에서 미토콘드리아 구성의 변화를 정량화하기 위한 새로운 접근법을 개발하면 이러한 세포 소기관에 대한 지식이 증가하고 미토콘드리아 기능 장애를 특징으로 하는 장애에 대한 새로운 치료 방법이 강조될 것입니다7.
현재, 다양한 미토콘드리아 분리 프로토콜을 사용할 수 있으며, 수율과 순도 수준이 다르다8. 원심분리 기반 접근 방식은 단순성과 저렴한 비용으로 인해 가장 널리 사용됩니다. 대부분의 응용 분야에 적합하지만, 차등 원심분리는 더 낮은 미토콘드리아 순도를 얻고 더 복잡한 밀도 구배 기반 응용 프로그램이 사용될 때 많은 양의 출발 물질을 필요로 하는 단점이 있습니다. 최근 몇 년 동안, 태그 기반 면역 포획("MITO-IP")9 및 형광 활성화 세포 소기관 분류10와 같은 미토콘드리아 분리를 위한 새로운 방법이 등장했습니다. 두 절차 모두 고순도 샘플을 생성할 수 있지만, 전자는 친화성 정제를 위해 미토콘드리아에 태그를 지정하기 위해 유전 공학이 필요하므로 프로토콜이 변형되지 않은 유기체 또는 인간 기증자의 1차 물질과 양립할 수 없습니다. 한편, 후자는 유세포 분석 및 분류 장비에 대한 접근에 의존합니다. 다양한 분리 방법을 결합하면 보다 강력한 프로토콜을 생성하고 순도를 높일 수 있습니다.
여기에서 우리는 (1) 미토콘드리아 분획을 분리하기 위한 차등 원심분리와 (2) 유비쿼터스 미토콘드리아 외막 단백질인 외부 미토콘드리아 막 22(Tomm22)11의 트랜스로카제에 대한 항체에 공유 결합된 초상자성 비드를 사용한 미토콘드리아의 태그 없는 면역 포획이라는 두 가지 기존 방법의 조합을 기반으로 하는 미토콘드리아 분리를 위한 새로운 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 우리가 설명하는 절차는 정량적 단백질 질량 분석법과 호환되며 태그가 없고 유전자 조작이 필요하지 않기 때문에 세포주에서 체액, 전체 동물 조직에 이르기까지 광범위한 연구 모델에 적용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜에서 두 단계를 사용하면 새로운 미토콘드리아 단백질의 발견 및 발현 연구를 위해 감산 단백질체학 6,12을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD Plastipal</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>25 G 바늘</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TOM22 Microbeads, 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-693</td><td></td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>FisherScientific</td><td>11577692</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX</td><td>ThermoFisher</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>FisherScientific</td><td>BP-120-1</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioConcept</td><td>5-31F00-H</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼 및 플런저</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>대식세포 콜로니 자극 인자</td><td>면역도구</td><td>12343115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>만니톨</td><td>시그마</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>시그마</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Corning</td><td>BH93B-102</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 10X</td><td>Eurobio Scientific</td><td>CS3PBS01-01</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL BLU 세포 생존도 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>C19196</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

Two-Step Tag-Free Isolation of Mitochondria for Improved Protein Discovery and Quantification

중추 대사에서 신경 퇴행에 대한 면역 반응에 이르기까지 대부분의 생리 및 질병 과정에는 미토콘드리아가 포함됩니다. 미토콘드리아 프로테옴은 1,000개 이상의 단백질로 구성되어 있으며, 각각의 풍부함은 외부 자극에 반응하거나 질병 진행 중에 동적으로 변할 수 있습니다. 여기에서는 일차 세포와 조직에서 고품질 미토콘드리아를 분리하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 2단계 절차는 (1) 미토콘드리아를 분리하기 위한 기계적 균질화 및 차등 원심분리, (2) 순수한 세포 소기관을 분리하고 오염 물질을 제거하기 위한 태그 없는 미토콘드리아의 면역 포획으로 구성됩니다. 각 정제 단계의 미토콘드리아 단백질은 정량적 질량 분석법으로 분석되고 농축 수율이 계산되어 감산 단백질체학에 의한 새로운 미토콘드리아 단백질의 발견이 가능합니다. 당사의 프로토콜은 세포주, 일차 세포 및 조직의 미토콘드리아 함량을 연구하기 위한 민감하고 포괄적인 접근 방식을 제공합니다.

미토콘드리아 순도가 증가하는 세 가지 샘플이 본 프로토콜에서 생성됩니다: 전체 세포, 미토콘드리아("미토-조") 및 순수 미토콘드리아("미토-순수") (그림 1). 우리는 겔에 각 분획의 동일한 양의 단백질을 로딩하고 면역블로팅하여 RAW264.7 대식세포 세포주에서 미토콘드리아의 정제를 검증했으며, 각 정제 단계에서 미토콘드리아 구연산염 합성효소(Cs)가 풍부하다는 것을 발견했습니다. 한편, 세포질(GAPDH), 원형질막(Na/K ATPase), 핵(Lamin B), 리소좀(Lamp1) 및 소포체(ER)(Pdi)의 단백질은 점진적으로 사라졌습니다(그림 2A). BMDM을 사용하여 유사한 결과를 얻었습니다. 단리된 미토콘드리아의 순도 및 완전성의 추가 검증을 위해, 순수한 미토콘드리아 분획에 대한 전자 현미경을 수행하였다. 우리는 항체로 코팅된 비드에 해당하는 전자 밀도가 높은 입자로 둘러싸인 고전적인 타원형 모양과 온전한 크리스타를 가진 미토콘드리아를 관찰했습니다(그림 2B). 따라서 우리의 프로토콜은 미토콘드리아를 풍부하게 하고 다른 세포 구성 요소를 고갈시키며 미토콘드리아 구조적 무결성을 유지한다고 결론지을 수 있습니다.
다음으로, 질량분석법(LC/MS)에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 각 분획의 프로테옴 분석을 수행했습니다. 총 세포에서 추출한 총 6,248개의 단백질이 확인되었으며, 그 중 907개는 이전에 MitoCarta3.0인벤토리5에서 미토콘드리아로 주석이 달린 것으로 확인되었습니다. 적어도 두 개의 고유한 펩타이드의 임계값을 가진 단백질을 필터링한 후, 전체 세포와 비교한 강도를 기반으로 각 샘플의 각 단백질에 대한 농축 점수를 계산했습니다. 그런 다음 유전자 온톨로지(Gene Ontology, GO)16,17 및 MitoCarta3.05를 참조로 사용하여 단백질을 미토콘드리아, ER, 리소좀, 골지체, 세포골격, 핵, 세포질의 7개 주요 세포내 구획에 할당했습니다. 중요하게도, 미토콘드리아 단백질에 대한 평균 농축은 미토콘드리아 분획에서 각각 10배 이상 및 20배 이상의 미토콘드리아 분획에서 관찰되었다(도 2C). 대조적으로, 분석된 다른 6개의 세포 구획의 성분은 정제 절차 동안 고갈되었다. 특히 미토콘드리아 분획에서 우리는 차등 원심분리 프로토콜18에 따라 자주 존재하는 두 종류의 오염 물질 단백질인 ER 및 리소좀 단백질에 대한 일시적인 농축을 관찰했습니다. 이것은 아마도 세포 소기관-세포 상호작용 및 유사한 침강 계수, 특히 대식세포에 매우 풍부한 리소좀의 경우 때문일 수 있습니다19. 둘 다 면역 포획 후 대부분 고갈되었지만, 우리는 미토-순수 분획의 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 단백질에 대한 작은 신호를 감지했습니다.
그런 다음 전체 세포와 미토 순수 샘플의 단백질 풍부도를 직접 비교하고 미토콘드리아 및 비미토콘드리아 단백질에 해당하는 두 개의 별개의 집단을 관찰했습니다(그림 2D). 대다수의 MitoCarta 단백질이 함께 클러스터링되어 있는 동안, 우리는 non-MitoCarta 단백질로 클러스터링된 몇 가지(&lt;5%)를 발견했습니다. 이들 단백질은 (1) 세포질 미토콘드리아 상호작용 단백질(MitoCarta 버전 3.0에 주석이 달린 새로운 범주), (2) 이중 국소화 단백질 또는 (3) 잘못 주석이 달린 단백질을 나타낼 수 있습니다. 반대로, 우리는 미토콘드리아 단백질과 클러스터링되는 비 MitoCarta 단백질의 몇 가지 사례를 발견했습니다. 이러한 단백질은 분리 절차의 오염 물질을 나타낼 수 있지만, 이전에 미토콘드리아에 존재하는 것으로 분류되지 않은 단백질을 나타낼 수도 있습니다.
이 새로운 종류의 잠재적인 미토콘드리아 단백질을 조사하기 위해 미토콘드리아 6,12를 포함한 소기관 프로테옴의 발견에 유용한 것으로 입증된 접근 방식인 감산 단백질체학이 사용되었습니다. 감산 단백질체학은 미토콘드리아가 정화 단계에서 농축되고 오염 물질이 고갈되어야 한다고 가정합니다6. 예를 들어, 오염 물질은 차등 원심분리 동안(예: 유사한 침강 특성으로 인해) 또는 면역 포획 동안(예: 비특이적 항체 결합으로 인해) 축적될 수 있는 반면, 선의의 미토콘드리아 단백질만 둘 다에 유의하게 축적되어야 합니다. 따라서 순수한 미토콘드리아 분획에서 발견되었지만 일관되지 않은 농축 패턴을 보인 단백질을 걸러내는 것이 가능합니다. RAW264.7 세포를 사용한 본 예에서, 미토-조-미토-순수 샘플에 대한 ≥1의 고유한 펩티드에 대한 임계값을 설정하고, 농축의 엄격한 임계값을 사용함으로써, 우리는 미토콘드리아 프로테옴의 목록을 차등 원심분리 후 미토콘드리아 분획에서 처음 발견된 1,127개의 단백질로부터 Tomm22 면역선택을 사용한 2차 정제 후 481개의 단백질로 정제할 수 있었습니다. mito-pure 분획에서 MitoCarta 주석이 달린 단백질의 감소된 수는 선택에 적용된 높은 엄격성을 반영합니다. 흥미롭게도, mito-pure 분획에 존재하는 단백질 중 70개는 MitoCarta3.0 인벤토리에 존재하지 않았습니다(그림 3A, B). 이러한 후자의 단백질은 잠재적인 새로운 미토콘드리아 후보 단백질을 나타낼 수 있으며, 이는 RAW264.7 대식세포 세포주 및 관련 세포에서만 발현될 수 있으며 추가 조사가 필요합니다.
<img alt="미토콘드리아 분리 다이어그램: 세포 균질화, 핵 분리, 자기 분리, 순도." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65252/65252fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 태그가 없는 2단계 미토콘드리아 분리 프로토콜의 그림. (A) 세포 현탁액은 25G 바늘을 통해 파괴됩니다. (B) 2,000 x g에서 원심분리에 의해 핵과 전체 세포를 분리하고 상청액을 저장합니다. (c) 미토콘드리아는 13,000 x g에서 상청액의 차등 원심분리에 의해 분리된다(미토-조). (D) 조잡한 미토콘드리아는 초상자성 비드에 공유 결합된 Tomm22 항체(Ab)와 함께 배양됩니다. (E) 미토콘드리아-Tomm22 항체-비드 복합체는 자기 컬럼을 사용하여 오염 물질로부터 분리되고 용출됩니다. (F) 순수한 미토콘드리아는 원심분리(mito-pure)에 의해 수집 및 농축된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65252/65252fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="정적 평형; 단백질 풍부도 비교; 웨스턴 블롯, 전자 현미경, 선 그래프, 산점도." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65252/65252fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2. 두 개의 대식세포 공급원으로부터 미토콘드리아를 분리한 대표적인 결과. (A) 미토콘드리아 구연산염 합성효소(Cs - 미토콘드리아), 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(Gapdh - 세포질), 나트륨-칼륨 펌프(Na/K ATPase - 원형질막), Lamin B(Lamin B - 핵), 리소좀 관련 막 단백질 1(Lamp1 - 리소좀) 및 단백질 이황화물-이성화효소(Pdi - ER). (B) RAW264.7 세포에서 정제된 미토콘드리아의 전자 현미경. 미토콘드리아를 둘러싼 고밀도 입자는 컬럼에서 용출된 후 미토 순수 샘플과 함께 운반되는 Tomm22 비드에 해당합니다. 스케일 바: 80 nm. (C) RAW264.7 세포의 7개 세포 구획에서 전체 세포, 미토-조 및 미토-순수에 걸친 농축 점수. 단백질 주석을 위해 MitoCarta3.0 및 GO를 사용하였고 평균 점수를 나타내었다. 약어: ER = 소포체. (D) 전체 세포 및 RAW264.7 세포의 미토 순수 샘플의 단백질에 대한 단백질 풍부도 값(riBAQ). MitoCarta3.0 단백질은 주황색으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65252/65252fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="미토콘드리아 단백질 농축 과정; 원형 차트, 상대 풍부도 그래프; MitoCarta 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65252/65252fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3. 감산 단백질체학을 이용한 새로운 미토콘드리아 단백질 발견. (A) 새로운 미토콘드리아 단백질의 발견을 위한 감산 단백질체학 전략. 높은 선택 임계값(4x 및 2x)이 적용되어 거짓 양성 선택을 최소화합니다. (B) 이전에 MitoCarta3.0 목록에 주석이 달리지 않은 새로운 미토콘드리아 후보 단백질의 농축 수율(전체 세포의 접힘). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65252/65252fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 프로테옴 규모에서 단백질 발견 및 정량화와 호환되는 고품질 미토콘드리아 분리를 위한 2단계 프로토콜을 제시합니다. 우리의 프로토콜은 유전 공학을 필요로하지 않으므로 모든 일차 세포와 조직에서 미토콘드리아를 연구하는 데 적합합니다.

Most physiological and disease processes, from central metabolism to immune response to neurodegeneration, involve mitochondria. The mitochondrial ...

우리 연구실은 미토콘드리아와 에너지 대사의 변화와 이것이 면역 활성화, 암 또는 대사 장애와 같은 건강하고 병리학적인 과정에 어떻게 영향을 미치는지 연구합니다. 우리의 목표는 미토콘드리아 기능과 에너지 대사에 대한 더 나은 이해를 제공함으로써 다양한 장애에 대한 새로운 치료법을 개발하는 데 도움을 주는 것입니다. 질량분석법 기반 단백질체학, 대사체학 및 CRISPR-Cas9 유전자 스크리닝과 같은 도구는 특정 세포 유형 및 환경에서 미토콘드리아 기능과 에너지 대사 모두에서 분자 메커니즘을 식별하는 데 점점 더 대중화되고 있습니다.다른 방법과 달리, 당사의 프로토콜은 미토콘드리아 분리를 위한 차등 원심분리와 면역 포획의 두 가지 정제 단계를 사용합니다. 이것은 오염 물질 제거 개선과 같은 몇 가지 이점을 제공하며 새로운 미토콘드리아 단백질을 식별하는 강력한 도구이기도 합니다. 우리의 프로토콜은 구성에 대한 통찰력을 제공하므로 다양한 세포 유형 및 환경에서 미토콘드리아 기능을 수행합니다.이것은 면역 활성화와 같은 정상적인 과정뿐만 아니라 암과 같은 병리학적 과정을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 미토콘드리아 대식세포에 초점을 맞출 것입니다. 우리는 미토콘드리아의 기능을 더 잘 이해하기 위해 면역 반응 동안 미토콘드리아의 구성이 어떻게 변하는지 테스트할 것입니다.우리의 연구 결과는 예를 들어 항 염증 효과가있는 약물 개발로 이어질 수 있습니다.

two-step-tag-free-isolation-mitochondria-for-improved-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

포유 동물 조직 생검에서 미토콘드리아의 신속한 분리를위한 방법을 설명한다. 쥐 간 또는 골격근 제제 상용 조직 dissociator 균질화하고, 미토콘드리아는 나일론 메쉬 필터를 통한 여과에 의해 미분을 분리 하였다. 대안적인 방법을 사용하여 100 분간 - 미토콘드리아 분리 시간은 60 비교 &lt;30 분이다.

조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

여기에서는 소량의 마우스 골격근에서 고품질의 정제된 미토콘드리아를 분리할 수 있도록 이전에 보고된 방법의 변형을 제시합니다. 이 절차는 마이크로플레이트 기반 호흡기 분석 중에 높은 기능으로 호흡하는 고도로 결합된 미토콘드리아를 생성합니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

미토 콘 드리 아 식물 세포의 단지 작은 백분율은, 그들은 연구의 범위에 대 한 정화 될 필요가 있다. 미토 콘 드리 아 균질, 매우 순화 된 미토 콘 드리 아 분수를 차동 및 밀도 그라데이션 원심 분리 뒤 다양 한 식물 기관에서에서 격리할 수 있습니다.

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

미토 콘 드리 아 리보솜 그들의 세균 및 세포질에서 갈라 전문 있다. 여기 우리가 어떻게 mitoribosomes HEK 세포에서 그들의 기본 구획에서 얻어질 수 있다 보여줍니다. 방법은 정지 세포에서 미토 콘 드리 아의 절연 및 mitoribosomes의 결과 정화를 포함 한다.

HEK 세포에서 Mitoribosome의 신속한 격리

여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

호흡 측정을 위한 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

이 프로토콜은 소량의 샘플만 사용할 수 있는 경우 호흡기 초복합체를 분석하는 기술을 설명합니다.

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples(소조직 및 세포 배양 샘플에서 미토콘드리아 초복합체 분석을 위한 미토콘드리아 분리) 

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

미토콘드리아에 대한 생체 에너지 및 대사체 연구는 많은 질병에서 미토콘드리아의 다면적인 역할을 밝혀냈지만, 이러한 세포 소기관에 대한 분리 방법은 다양합니다. 여기에 자세히 설명된 방법은 여러 조직 소스에서 고품질 미토콘드리아를 정제할 수 있습니다. 품질은 호흡 조절 비율 및 고해상도 호흡 측정법으로 평가된 기타 지표에 의해 결정됩니다.

설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리 

배우세요 미토콘드리아 2단계 태그 없는 분리법으로 단백질 발견 및 정량 분석을 개선하는 방법입니다. 차등 원심분리와 면역 포획을 활용하여 1차 세포와 조직에서 고품질 미토콘드리아를 분리하고 면역 활성화 및 암 연구에 적용할 수 있습니다.

단백질 발견 및 정량 분석을 개선하기 위한 미토콘드리아의 2단계 태그 없는 분리

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