Name: 기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 배우세요 기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하는 이미지 기반 방법을 Arabidopsis thaliana를 사용하여. 이 기법은 기공 발달과 식물의 비생물적 스트레스 적응 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

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이 연구는 National Science Foundation(IOS-2217757)(XQ)과 University of Arkansas for Medical Sciences(UAMS) Bronson Foundation Award(H.Z.)의 지원을 받았습니다.

1. 용액 준비
<ol><li>표백제 15mL와 증류수 35mL 및 Triton X-100 50μL를 혼합하여 종자 살균 용액을 준비합니다.</li>
	<li>BFA 분말을 에탄올에 용해시켜 브레펠딘 A(BFA) 용액을 최종 농도 10 mM(스톡)으로 제조한다. Wm 분말을 DMSO에 용해시켜 최종 농도 10 mM(stock)이 되도록 맥아즙만닌(Wm) 용액을 제조한다.</li>
</ol>2. 씨앗 파종
<ol><li>필요한 형질전환 식물 각각에서 10-50개의 종자를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 분취합니다. 각 튜브에 종자 멸균 용액 1mL를 넣고 셰이커에서 10분 동안 튜브를 부드럽게 뒤집어 완전히 혼합합니다.</li>
	<li>종자 살균 용액을 버리고 1mL의 오토클레이브 증류수로 종자를 5회 세척합니다.</li>
	<li>오토클레이브 증류수 300μL를 각 튜브에 넣고 1%(w/v) 자당과 0.75%(w/v) 한천을 포함하는 절반 강도 MS 배지에 종자를 뿌립니다. 필요에 따라 해당 항생제로 배지를 보충하십시오.</li>
	<li>플레이트를 4°C의 어두운 곳에서 2일 동안 거꾸로 보관하여 발아를 동기화합니다.</li>
	<li>2일 후, 플레이트를 22°C에서 16시간 라이트/8시간 다크 사이클(80μmol/m2/s1)로 성장실로 옮깁니다. 이것은 발아 후 첫날 (1 dpg)로 간주됩니다.</li>
	<li>추가 성장을 위해 묘목을 10dpg의 토양에 이식하십시오.</li>
</ol>3. 이중 착색 F1 형질전환 식물의 제조
<ol><li>ERL1-YFP(식물 A)를 포함하는 동형접합 형질전환 식물과 RFP 표지 마커 단백질 RFP-Ara7(식물 B)20을 포함하는 동형접합 형질전환 식물을 16시간 조명/8시간 암주기(80μmol/m2/s1)로 성장실에서 개화할 때까지 나란히 성장시킵니다.</li>
	<li>식물 A에서 어린 꽃차례를 선택하십시오. 유전 적 십자가를 위해 꽃차례에 막 열려는 꽃 한 송이를 유지하십시오. 오래된 꽃과 실리크를 모두 제거하십시오. 또한 미래의 혼란을 피하기 위해 어린 꽃과 꽃 분열 조직을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>한 쌍의 날카로운 핀셋을 사용하여 꽃받침, 꽃잎, 수술을 제거하여 개봉하지 않은 꽃을 부드럽게 해부합니다. 꽃차례에 암술을 남겨 두십시오.</li>
	<li>식물 B의 열린 꽃에서 성숙한 수술을 취하고 식물 A의 해부 된 암술의 암술머리에 꽃가루 알갱이를 놓습니다.</li>
	<li>이 수동으로 교차 된 꽃은 아버지, 어머니 및 유전 적 십자가의 날짜를 표시하여 레이블을 지정합니다. 꽃을 성숙시키고 실리크가 노란색 / 갈색으로 변할 때 F1 씨앗을 수확합니다 (십자가 후 ~ 20 일). YFP 및 RFP 신호가 모두 있는 성공적인 F1 플랜트를 확인합니다.</li>
</ol>4. 약리학 적 치료
<ol><li>BFA 처리를 위해 7 일 된 묘목의 자엽을 제거하고 나머지 묘목을 모의 용액 (0.3 % 에탄올) 또는 30 μM BFA 용액에 담그고 1 분 동안 진공을 적용하고 샘플을 30 분 동안 담근 상태로 유지합니다.</li>
	<li>맥아즙 처리를 위해 7 일 된 묘목의 자엽을 제거하고 나머지 묘목을 0.25 % DMSO 용액 또는 25 mM 맥아 즙 만닌에 담그고 1 분 동안 진공을 적용하고 이미징하기 전에 샘플을 30 분 동안 담근 상태로 유지합니다.</li>
	<li>샘플의 진공 처리를 위해 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 해당 약물 용액 500μL를 넣고 해부된 묘목을 용액에 담그십시오. 10mL 주사기를 미세 원심분리기 튜브에 단단히 부착하고 1분 동안 진공을 적용합니다(그림 1). 주사기를 제거하고 필요한 시간 동안 용액에 샘플을 보관하십시오. 이미징 준비를 위해 묘목을 부드럽게 꺼냅니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig01.jpg"> 그림 1: 간단한 진공 장치. 진공 처리를 위해 10mL 주사기를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 부착합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
5. 이미징을 위한 샘플 준비
<ol><li>날카로운 면도날을 사용하여 처리 된 샘플에서 실제 잎을 해부하십시오. 유리 슬라이드의 물 한 방울에 진정한 잎을 부드럽게 넣고 축 방향면을 위로 유지하십시오. 거품이 끼지 않도록 덮개 슬립으로 실제 잎을 천천히 덮으십시오.</li>
</ol>6. 컨포칼 이미징
참고: 라이카 SP8 도립 주사 컨포칼 현미경을 사용하여 이 작업에서 샘플의 형광 신호를 이미지화했습니다.
<ol><li>빔 경로 설정<ol><li>YFP 여기를 위한 514nm 레이저를 선택합니다. 높은 레이저 출력을 사용하여 신호 강도를 높여 높은 이미지 품질을 얻을 수 있습니다. 그러나 5% 이상의 레이저 출력은 광표백의 위험이 있으며 샘플의 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 샘플 신호가 너무 어둡지 않으면 낮은 레이저 강도에서 시작합니다.</li>
		<li>검출을 위해 PMT/HyD를 켜고 YFP 형광단의 스펙트럼을 기반으로 방출 대역 상한 및 하한 임계값을 정의합니다. YFP 신호를 수집하기 위해 530-570nm의 감지 창을 설정합니다.</li>
		<li>두 번째 색상에 대한 순차 이미징: Seq 버튼을 클릭하고 새 채널을 추가합니다. 기본적으로 이전에 설계된 YFP 빔 경로는 Seq 1입니다. Seq 2에서 RFP 여기용 561nm 레이저를 선택하고 RFP 신호를 수집하기 위해 570-630nm의 검출 창을 설정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스캔 조건 설정(그림 2)<ol><li>기공 전구체 세포 내의 세포내 막 트래픽 활동을 이미지화하려면 이미징을 위해 시스템에서 63x/1.2W Corr 렌즈를 선택하십시오.</li>
		<li>형식은 픽셀 단위의 이미지 크기를 나타냅니다. 1,024 픽셀 x 1,024 픽셀로 시작한 다음 확대/축소 비율과 목표 설정을 기반으로 최적화하여 게시 품질의 좋은 해상도를 제공합니다.</li>
		<li>속도는 레이저가 각 픽셀을 통과할 때 스캔헤드의 속도를 나타냅니다. 스캔 속도가 느리면 신호 대 잡음비가 향상되는 경우가 많지만 빠르게 변화하는 멤브레인 트래피킹 이벤트를 효율적으로 캡처하지 못할 수 있습니다. 400Hz의 속도로 시작하여 샘플의 특정 상황에 따라 이를 최적화합니다.</li>
		<li>확대/축소 비율은 대물 렌즈를 변경하지 않고 관심 영역을 확대하는 데 사용됩니다. 확대/축소 계수 1로 시작하고 실험의 특정 요구 사항에 따라 최적화합니다.</li>
		<li> 라인 평균은 평균 결과를 얻기 위해 각 X-라인을 스캔하는 횟수를 나타냅니다. 라인 평균이 클수록 결과 이미지의 노이즈가 줄어들지만 스캔 시간과 레이저 광에 대한 노출 시간도 늘어납니다. 멤브레인 트래피킹 이벤트를 이미지화하려면 높은 라인 평균을 사용하지 마십시오. 2x 라인 평균으로 시작하여 필요에 따라 최적화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시계열 수집 참고: 막 트래피킹 사건을 연구할 때 세포내 엔도솜의 빠른 움직임을 기록하기 위해 시계열이 필요한 경우가 많습니다.<ol><li>획득 모드에서 xyt 스캔 모드를 선택하여 시계열 유틸리티를 활성화합니다.</li>
		<li>시간 간격에서 시점 사이의 대기 기간을 결정합니다. 또는 최소화를 클릭하여 이미지를 차례로 즉시 촬영합니다. 7초의 시간 간격이 다음 시계열 실험에 사용되었습니다.</li>
		<li>기간을 선택하고 실험을 실행할 총 시간을 입력합니다. 또는 Frames(프레임)를 선택하여 수집할 프레임 수를 정의합니다(그림 3).</li>
	</ol></li>
	<li>전체 세포 내의 멤브레인 트래피킹 이벤트에 대한 3차원 정보를 수집하려면 Z-스택 스캔 모드를 사용합니다. Z 스택 이미지의 최대 강도 투영은 종종 분석에 사용됩니다.<ol><li>획득 모드에서 xyz 스캔 모드를 선택하면 Z-Stack 유틸리티에 액세스할 수 있습니다.</li>
		<li>Z 와이드 옵션을 선택합니다. Scan Mode(스캔 모드)에서 Begin(시작) 및 End(종료) 버튼을 사용하여 Z 스택의 상단 이미지와 하단 이미지를 정의합니다.</li>
		<li>z-스텝 크기를 클릭하여 z-스텝의 두께를 정의합니다. 또는 Z 스택의 전체 범위를 커버하기 위해 촬영할 이미지 수를 정의합니다. 샘플 간의 일관성을 보장하려면 z-스텝 크기를 정의합니다(그림 4).</li>
	</ol></li>
	<li>이미지 처리<ol><li>z-스택 이미지의 최대 강도 투영은 컨포칼 소프트웨어(http://www.leica-microsystems.com)에 의해 생성됩니다. 기본 프로세스(Primary Process) 탭에서 맨 왼쪽의 프로젝트 열기(Open Projects) 탭 아래에서 관심 있는 z-stack 파일을 먼저 선택합니다. 그런 다음 Process Tools라는 중간 탭으로 전환하고 투영 기능을 선택한 다음 방법 드롭다운 패널에서 최대를 선택하고 적용 버튼을 클릭합니다. z-stack 프로젝션 이미지는 Open Projects 탭 아래에 생성됩니다.</li>
		<li>시계열 영상의 영상은 피지(https://imagej.net/Fiji)에 의해 생성된다. 파일 탭에서 열기 함수를 사용하여 모든 시계열 이미지를 올바른 순서로 엽니다. [Image ] 탭에서 [ Stack ] 함수를 찾고 [Images to stack ]을 선택하여 비디오를 생성합니다. 원하는 프레임 속도( 비디오 1의 경우 5프레임/초)로 .avi 형식으로 파일을 저장합니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig02.jpg"> 그림 2: XY 치수의 스캔 모드 패널 스캔 모드 패널은 이미지 스캔 조건을 설정하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig03.jpg"> 그림 3: xyt 스캔 모드의 시계열 유틸리티. 시계열 유틸리티는 일련의 이미지를 연속적으로 수집하기 위한 이미징 조건을 설정하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig04.jpg"> 그림 4: xyz 스캔 모드의 z-stack 유틸리티 z-stack 유틸리티는 z축에서 일련의 이미지를 수집하기 위한 이미징 조건을 설정하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

컨포칼 이미징을 통한 ERL1 동역학의 시공간 조사

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<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+regulation+of+stomatal+differentiation+potential+by+EPF1+and+ERECTA-LIKE1+ligand-receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling.</a> Elife. 6, 24102(2017).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
<li>Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+super-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free super-resolution imaging techniques.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy%3A+Present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), (2019).</li>
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<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634(2023).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

내막 시스템은 진핵 세포의 세포질을 서로 다른 구획으로 분리하여 이러한 세포 기관의 특수한 생물학적 기능을 가능하게 합니다. 화물 단백질과 거대분자를 적시에 최종 목적지로 전달하기 위해 수많은 소포가 이러한 세포 기관 사이를 왕복하도록 안내됩니다. 고도로 조절된 막 밀매 사건은 세포의 생존력, 발달 및 성장에 근본적인 역할을 합니다. 이 중요하고 복잡한 과정을 조절하는 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다.
여기에서는 막 단백질의 세포 내 국소화를 관찰하고, 서로 다른 형광 단백질로 태그된 두 막 단백질 간의 공동 국소화를 분석하고, 시계열 이미지를 사용하여 막 단백질의 동적 이동을 모니터링하고, 전체 세포를 덮는 z-스택 이미징을 수행하여 막 단백질에 대한 3D 정보를 수집하기 위한 몇 가지 접근 방식을 설명했습니다. 여기에 설명된 막 밀매 사건 외에도 이러한 접근 방식은 다른 생물학적 과정에 쉽게 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 시계열 이미징은 발달 과정(<sup c...

막 이동(Membrane traffic)은 단백질, 지질 및 기타 생물학적 산물을 포함한 막 구성 요소(화물이라고도 함)를 진핵 세포 내의 서로 다른 세포 기관 사이 또는 원형질막을 가로질러 세포외 공간으로 또는 세포외 공간으로 분배하는 보존된 세포 과정입니다1. 이 과정은 핵막, 소포체, 골지체, 액포/리소좀, 원형질막 및 다중 엔도솜으로 구성된 내막 시스템(endomembrane system)이라는 막과 세포 기관의 집합체에 의해 촉진된다1. 내막 시스템은 이러한 세포 기관 사이를 왕복하는 동적 소포를 사용하여 막 구성 요소의 수정, 포장 및 운송을 가능하게 합니다. 세포막 밀매 현상은 세포 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격하고 복잡한 규제를 받고 있습니다2. 현재, 분자 생물학, 화학 생물학, 현미경 및 질량 분석법의 여러 접근법이 개발되어 막 이동 분야에 적용되었으며 내막 시스템 3,4의 시공간 조절에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다. 분자 생물학은 관심 단백질의 유전자 발현을 변경하거나 관심 단백질에 특정 태그를 표시하는 것과 같이 막 이동에 관여하는 것으로 추정되는 플레이어의 고전적인 유전자 조작에 사용됩니다. 화학 생물학의 도구에는 특정 경로의 교통을 구체적으로 방해하는 분자의 사용이 포함됩니다 4,5. 질량 분석법은 생화학적 접근법 3,4에 의해 기계적으로 분리된 세포 기관의 구성 요소를 식별하는 데 강력합니다. 그러나 막 교통은 역동적이고 다양하며 복잡한 생물학적 과정이다1. 다양한 조건에서 살아있는 세포의 막 이동 과정을 시각화하기 위해서는 광학 현미경이 필수적인 도구입니다. 사건의 효율성, 동역학 및 다양성을 측정하는 문제를 극복하기 위해 첨단 현미경 기술이 지속적으로 발전해 왔습니다4. 여기에서 이 연구는 화학/약리학 생물학, 분자 생물학 및 현미경 검사에서 널리 채택된 방법론에 중점을 두어 자연적으로 단순화되고 실험적으로 접근 가능한 시스템인 기공 발달 과정에서 막 이동 사건을 연구합니다.
기공은 내부 세포와 환경사이의 가스 교환을 촉진하기 위해 열리고 닫히는 식물 공중 표면의 미세 기공입니다 6,7,8. 따라서 기공은 식물의 생존과 성장에 중요한 두 가지 사건인 광합성과 증산에 필수적입니다. 기공 발달은 주변 환경에 대한 식물의 적응을 최적화하기 위해 환경 신호에 의해 동적으로 조정된다9. 2002년 연구로 거슬러 올라가면, 수용체 단백질인 TMM(Too Many Mouths)의 식별은 모델 식물인 Arabidopsis thaliana10에서 기공 발달의 분자 메커니즘을 조사하는 새로운 시대의 문을 열었습니다. 불과 수십 년 후, 고전적인 신호 전달 경로가 확인되었습니다. 상류에서 하류로, 이 경로는 표피 패턴 인자 (EFP) 패밀리의 분비 펩티드 리간드 그룹, EREECTA (ER) 패밀리의 여러 세포 표면 류신 풍부 반복 (LRR) 수용체 키나아제, LRR 수용체 단백질 TMM, MAPK 캐스케이드 및 SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA 및 SCREAM (SCRM)을 포함한 여러 bHLH 전사 인자를 포함합니다11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. 이전 연구는 수용체 키나아제 중 하나인 ER-LIKE 1(ERL1)이 EPF 인식 시 활성 세포내 행동을 나타낸다는 것을 나타냅니다 20. ERL2는 또한 원형질막과 일부 세포내 소기관 사이를 동적으로 이동한다27. 막 트래피킹 단계를 차단하는 것은 비정상적인 기공 패터닝을 일으켜 잎 표면에 기공 클러스터를 생성한다(28). 이러한 결과는 막 교통량이 기공 발달에 필수적인 역할을 한다는 것을 시사합니다. 이 연구는 일부 막 이동 억제제를 사용한 약리학적 치료와 결합된 단백질-단백질 세포 내 공동 국소화 분석을 사용하여 ERL1 역학을 시공간적으로 조사하는 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>10 mL 주사기</td><td>VWR</td><td>BD309695</td><td>진공 샘플</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td>막 밀매 약물</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>Lecia SP8 TCS with LAS-X 소프트웨어 패키지</td><td>이미징</td></tr><tr><td>해부 겸자</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>유전자 교차</td></tr><tr><td>피지</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>이미지 처리</td></tr><tr><td>Leica LAS AF 소프트웨어</td><td>Leica</td><td>http://www.leica-microsystems.com</td><td></td></tr><tr><td>ERL1-YFP</td><td></td><td></td><td>Qi, X. et al의 이미지 처리 형질전환 씨앗. 수용체의 세포 내 역학에 대한 신호 펩타이드의 다양한 작용은 기공 세포의 운명을 지정합니다. 일라이프. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).</td></tr><tr><td>RFP-Ara7</td><td></td><td></td> Ebine의 형질전환 종자<td>, K. 외. 식물 특이적 RAB GTPase ARA6에 의해 조절되는 멤브레인 이동 경로. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).</td></tr><tr><td>Wortmannin (Wm)</td><td>Sigma</td><td>W1628</td><td>멤브레인 밀매약물</td></tr></tbody></table>

기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

진핵 세포에서 단백질과 지질을 포함한 막 구성 요소는 내막 시스템 내에서 시공간적으로 목적지로 운반됩니다. 여기에는 새로 합성된 단백질을 세포 표면 또는 세포 외부로 분비 수송하는 것, 세포외 화물 또는 원형질막 성분을 세포로 세포내로 운반하는 것, 세포내 소기관 사이에서 화물을 재활용하거나 이동하는 것 등이 포함됩니다. 막 밀매 사건은 모든 진핵 세포의 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격한 규제를 받고 있습니다. 세포외 공간에서 리간드 신호를 감지하는 세포 표면 수용체 키나아제는 분비 및 세포내 수송을 모두 거칩니다. 원형질막-국소화된 류신-풍부한-반복 수용체 키나아제, ERL1을 사용하여 막 트래피킹 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 접근법이 여기에 기재되어 있다. 접근 방식에는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정이 포함됩니다. ERL1의 시공간 조절을 모니터링하기 위해 이 연구에서는 ERL1과 다소포체 마커 단백질인 RFP-Ara7 사이의 공동 국소화 분석, 이 두 단백질의 시계열 분석, 막 밀매 억제제 brefeldin A 및 wortmannin으로 처리된 ERL1-YFP의 z-스택 분석에 대해 설명합니다.

이전 연구에서는 ERL1이 동적 막 트래피킹 사건을 겪는 활성 수용체 키나아제임을 나타냈다20. ERL1은 원형질막의 막횡단 LRR-수용체 키나아제입니다. 소포체에서 새로 합성된 ERL1은 골지체에서 처리되어 원형질막으로 추가로 운반됩니다. 원형질막 상의 ERL1 분자는 그의 세포외 LRR 도메인18을 사용하여 EPF 리간드를 인지할 수 있다. EPF1을 포함한 억제성 EPF에 의해 활성화되면 ERL1은 엔도솜으로 내재화되고 다소포체(MVB)로 운반된 다음 분해를 위해 액포로 운반되어 신호를 종료합니다(20). 대조적으로, 기공 형성을 촉진하는 길항적 EPFL9 리간드(14)는 소포체에 ERL1을 보유한다. 대안적으로, 원형질막-국소화된 ERL1은 엔도솜과 원형질막(20) 사이에서 재순환할 수 있다.
<p cl...

원형질막 수용체 키나아제의 막 이동 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법이 여기에 소개됩니다. 이 원고는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정을 포함한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

이 기술은 광합성과 증산을 촉진하기 위해 기공 발달, 식물 공중 표면의 미세 기공에서 막 이동 사건을 연구합니다. 식물 기공 발달을 연구하기 위해 다양한 기술이 사용됩니다. 여기에는 분자 생물학, 세포 생물학 또는 현미경, 화학 생물학, 질량 분석법, 생화학 및 구조 생물학이 포함됩니다.개별 기공은 비동기식으로 형성됩니다. 각 장(요)루는 세 번의 초월 세포 운명 전이에 의해 형성됩니다. 따라서 특정 세포 운명에서 충분한 기공 계통 세포를 수집하는 것이 큰 과제 중 하나입니다.막 트래피킹은 세포 생존과 성장에 필수적입니다. 기공 혈통 세포도 예외는 아닙니다. 이 프로토콜은 기공 계통 세포에서 막 밀매 사건을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 접근 방식을 다룹니다.식물은 기후 변화에 직면하여 도전적인 환경에 직면해 있습니다. 기공은 식물 가스 교환을 위한 통로이며 적응을 위한 환경 스트레스에 매우 유연합니다. 우리는 비생물적 스트레스가 기공 계통 세포에서 특정 단백질의 막 이동에 초점을 맞춰 기공 발달에 어떤 영향을 미치는지 연구하는 데 관심이 있습니다.

image-based-methods-to-study-membrane-trafficking-events-stomatal

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 사는 박테리아에 stomatal 응답을 액세스하는 간단하고 재현성 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 표피 껍질의 사용에 비해 잎사귀의 입힐 수있는 총알과 조작​​은 이전에 보고된 최소화합니다.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

우리는 stomatal 차별화를 문서화, 개발 며칠 동안 표피의 공 촛점 이미징을위한 식물 cotyledons를 고정하기 위해 챔버 슬라이드 및 미디어를 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 형광 태그 단백질은 세포 분열과 세포 형 차별화 중에 가능한 역할의 이해를 증가 표현과 subcellular 지방화에 의해 동적으로 추적 할 수 있습니다.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022). 이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

Drosophila Photoreceptor Cells의 막 단백질 이동에 대한 연구

편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

이 프로토콜의 목적은 기공 복합체의 세포 피질에, GFP - 태그 PATROL1, 막 인신 매매 단백질의 점을 점멸 표시 가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면에 형광 표지 된 단백질의 역학을 모니터링하는 방법을 설명하는 것입니다 애기 장대.

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

세포 이하 수준에서 신호 이벤트는 발달 및 환경 단서에 의해 동적으로 조절됩니다. 여기에서는 담배 일시적 발현 시스템을 사용하여 동적 단백질-단백질 상호 작용을 모니터링하고 식물 세포에서 신호 전달의 공간적 조직을 공개하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

담배 과도 식 시스템을 사용하여 MAPK 신호 전달 통로의 공간 개편 이미징

이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

Macropinocytosis는 막 프릴이라고도 알려진 F-actin이 풍부한 시트 형 막 돌기의 형성에 의해 시작된 고도로 보존 된 내시세포 과정입니다. 거대 피노사이토틱 용질 내재화의 증가된 속도는 다양한 병리학적 조건에 연루되어 왔다. 이 프로토콜은 주사 전자 현미경을 사용하여 시험관 내에서 막 프릴 형성을 정량화하는 방법을 제시한다.

주사 전자 현미경을 이용한 멤브레인 러플 형성 시각화

이 논문은 기공 발달을 제어하는 유전자를 특성화하기 위해 표피 껍질을 사용하지 않는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 톨루이딘 블루 O-염색 식물 표피를 사용하여 기공 표현형을 분석하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 기공 리간드를 식별하고 생물학적 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

표피 표현형 점수를 통한 기공 발달에 관여하는 유전자 식별

이 프로토콜은 표피 필링, 투명화 기법, AI 보조 영상 분석을 활용하여 두 가지 서로 다른 종의 기공과 표피 특성을 비교 평가하는 방법을 제시합니다. 목표는 농업 응용과 광범위한 식물 연구를 위해 기공 기능의 기저 세포 구조를 고처리량, 재현 가능하게 정량화하는 것입니다.

필링, 클리어링, AI 기반 이미지 분석을 이용한 기공 및 표피 특성 특성

배우세요 기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하는 이미지 기반 방법을 Arabidopsis thaliana를 사용하여. 이 기법은 기공 발달과 식물의 비생물적 스트레스 적응 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법

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