Name: 조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 학습하세요 조직 해리기를 활용한 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리 방법을 통해 전지방세포 분화를 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 비만 및 당뇨병 연구에 활용됩니다.

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저자는 실험 지원에 대해 Takahito Wada와 Saiko Yoshida (일본 도쿄 도쿄 대학)에게 감사의 말을 전합니다. 이 연구는 Y.H.에 대한 다음과 같은 보조금으로 자금을 지원받았습니다: 도쿄 대학 우수 젊은 연구원 프로그램의 연구 보조금; 일본 과학 진흥회 (JSPS) KAKENHI 초기 경력 과학자 보조금, 보조금 번호 19K17976; 일본 응용 효소학 재단의 미래 당뇨병 연구(FFDR)의 선두주자에 대한 보조금, 보조금 번호 17F005; 약리학 연구 재단의 보조금; 의학 및 제약 연구를 위한 모치다 기념 재단의 보조금; MSD 생명 과학 재단의 보조금; 다이와 증권 건강 재단의 보조금; 도쿄 생화학 연구 재단의 보조금; 다케다 과학 재단 (Takeda Science Foundation)의 생명 과학 연구 보조금; SENSHIN Medical Research Foundation의 보조금.

이 프로토콜에 설명된 모든 동물 실험은 도쿄 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 도쿄 대학의 기관 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 효소액 및 배지의 제조
<ol><li>7-8주령 마우스의 사타구니 백색 지방 조직 양쪽(좌우, 약 150mg)과 효소 용액 2.5mL를 해리기의 튜브 C에 넣습니다.</li>
	<li>소 태아 혈청(FBS) 또는 항생제가 없는 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)/F12 3mL, FBS 또는 항생제가 없는 DMEM/F12 2.7mL의 효소 R, 완충액 A 1mL로 효소 A를 재구성합니다.</li>
	<li>효소 D 100μL, 효소 R 50μL, 효소 A 12.5μL, FBS 또는 항생제가 없는 DMEM/F12 2.35mL를 튜브 C에 넣어 효소액 2.5mL를 준비합니다.</li>
</ol>2. 지방 조직의 분리
<ol><li>7-8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(약 20g)를 자궁경부 탈구로 안락사시킵니다.</li>
	<li>깨끗한 벤치에서 사타구니 백색 지방 조직을 분리하기 위해 복부와 하지를 향해 뭉툭하고 날카로운 가위로 피부를 자릅니다. 날카롭고 날카로운 가위를 사용하여 허벅지 안쪽에서 지방 조직을 분리합니다. 사타구니 지방 조직의 한쪽은 ~75mg을 사용합니다.</li>
	<li>분리된 지방 조직을 얼음 위의 효소 용액과 함께 튜브 C에 넣고 튜브를 깨끗한 벤치 내에 보관하여 무균 상태를 유지합니다.</li>
</ol>3. 지방 조직의 다듬기 및 소화
<ol><li>클린 벤치에서 효소 용액 2.5mL를 튜브 C에 추가합니다.</li>
	<li>날카롭고 날카로운 가위로 50회 절단하여 지방 조직을 작은 조각으로 다집니다. 지방 조직을 ~2mm2 개로 자릅니다.</li>
	<li>튜브 C의 캡을 단단히 닫고 튜브를 거꾸로 뒤집어 캡을 씌운 상태에서 조직 해리기의 슬리브에 부착합니다. 그런 다음 37°C에서 ~40분 동안 샘플을 분해합니다. 참고: 이 연구에서는 히터가 있는 gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec 130-096-427)를 사용했으며 사전 설치된 프로그램 "37C_mr_ATDK_1"를 따랐습니다.</li>
</ol>4. 세포 현탁액의 여과
<ol><li>10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12를 37°C로 예열합니다.</li>
	<li>조직 해리기에서 튜브 C를 분리하고 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12 5mL를 추가하고 부드럽게 4회 피펫팅하여 분해를 중지합니다.</li>
	<li>20°C에서 10분 동안 700 x g 로 원심분리합니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.</li>
	<li>10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 10mL를 넣고 부드럽게 5회 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>새로운 50mL 튜브에 놓인 직경 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과합니다.</li>
	<li>250 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁합니다.</li>
</ol>5. 셀 도금
<ol><li>500 x g 에서 5분 동안 원심분리기.</li>
	<li>상층액을 제거하고 10% FBS와 12% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F10mL를 첨가하고 10회 피펫팅하여 펠렛을 다시 현탁합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 10 cm 콜라겐 코팅된 접시에 접시에 담고 접시를 세포 배양 배양기(37°C, 5%CO2)에 1-2시간 동안 넣습니다. 참고: 콜라겐 코팅 접시가 반드시 필요한 것은 아닙니다. 그러나 경험에 비추어 볼 때 콜라겐 코팅 접시는 지방전구세포의 부착을 도와 세포의 생존을 증가시킵니다.</li>
	<li>배지를 흡인하고 세척 당 3mL의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 10mL를 넣고 접시를 세포 배양 배양기(37°C, 5%CO2)로 되돌립니다.</li>
</ol>6. 지방전구세포의 패시징
<ol><li>다음날, 배지를 흡인하고(세포가 부착되어 배지를 흡인할 수 있음), 세척당 3mL의 PBS로 세포를 두 번 세척하고, 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 10mL의 DMEM/F12를 추가합니다.</li>
	<li>세포가 80% 합류에 도달하면(보통 SVF 분리 후 4일) 세포를 4개의 10cm 콜라겐 코팅 접시로 나눕니다.<ol><li>구체적으로, 배지를 흡인하고, 세포를 PBS(실온[RT])로 세척하고, 예열된 0.05% 트립신 1mL를 첨가하고, 세포배양 배양기에서 5분 동안 배양한다.</li>
		<li>10% FBS와 10% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 10mL를 추가하여 트립신 활성을 소멸시킵니다. 피펫팅 후 440 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상층액을 흡인하고 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 40mL를 추가하여 세포를 재현탁하고 10cm 콜라겐 코팅 접시 4개에 세포를 플레이트합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포가 80% 합류에 도달하면 다시 계대합니다.</li>
</ol>7. 지방전구세포의 불멸화를 위한 SV40 거대 T 항원을 발현하는 레트로바이러스의 제조(선택사항)
<ol><li>불멸화 최소 3일 전에 플레이트 백금-E(Plat-E) 패키징 셀 29를 항생제 없이 10% FBS가 포함된 DMEM2mL 에 3.0 x 105 cells/mL의 밀도로 패키징합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세십시오.</li>
	<li>다음날, 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000을 사용하여 pBABE-neo largeTcDNA(유전자 플라스미드 #1780 추가) 4μg을 형질감염시킨다.</li>
	<li>24시간 후, 배지를 흡인하고 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 2mL를 추가합니다.</li>
	<li>다음날, 레트로 바이러스 상청액을 수확하십시오. 레트로바이러스는 즉시 불멸화에 사용하거나 -80°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>8. SV40 큰 T 항원을 이용한 지방전구세포의 불멸화(선택 사항)
<ol><li>SVF 분리 후 지방전구세포를 2회 계대 및 확장시킨다.</li>
	<li>10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 함께 2mL의 DMEM/F12에 0.5-1.0 x 104 cells/mL의 밀도로 6웰 플레이트에 세포를 플레이트합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 세십시오.</li>
	<li>다음날, 6-웰 플레이트의 웰 당 SV40 거대 T 항원을 발현하는 신선하거나 해동된 레트로바이러스 250μL를 준비한다. 440 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 새 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>레트로바이러스 상층액 250μL당 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 750μL의 DMEM/F12와 1μL의 폴리브렌을 추가하여 작동하는 바이러스를 만듭니다.</li>
	<li>배지를 흡인하고 1,000 μL의 작업 레트로 바이러스를 지방 전구 세포가 들어있는 각 웰에 첨가하십시오.</li>
	<li>4시간 후에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12 1mL를 추가합니다.</li>
	<li>다음날 감염된 지방전구세포를 10cm 접시에 담아 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 500μg/mL 네오마이신이 함유된 DMEM/F12로 감염된 세포를 선별한다. 항생제 선택을 모니터링하려면 네오 마이신으로 감염되지 않은 세포 접시를 준비하십시오.</li>
	<li>모니터 접시에 있는 모든 감염되지 않은 세포가 죽을 때까지 감염된 세포를 네오마이신으로 계속 계대배양합니다.</li>
</ol>9. 지방세포 분화
<ol><li>세포를 플레이트하십시오. 12웰 플레이트의 경우, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 1mL에 4.0 x 104 cells/mL의 밀도로 세포를 플레이트합니다.</li>
	<li>지방전구세포가 합류하게 되면(도금 후 48-72시간), 배지를 흡인하고 분화 배지로 교체합니다(조성은 표 1 참조).</li>
	<li>분화 2일째(즉, 분화 유도 후 48시간)에 배지를 유지 배지로 교체합니다(조성에 대해서는 표 1 참조). 그 후 2일마다 유지 보수 매체를 교체하십시오. 말단 분화는 분화 7일째에 달성됩니다.</li>
	<li>오일 레드 오 염색<ol><li>오일 레드 오 염색의 경우, 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 PBS로 세포를 헹굽니다. 웰 당 4% 포름알데히드 1mL를 첨가하여 세포를 고정하고, RT에서 15분 동안 세포를 배양한다.</li>
		<li>인큐베이션 동안,ddH2O를 사용하여 0.5% 오일 레드 O 원액(이소프로필 알코올 중)을 0.3%로 희석하고, 여과지를 사용하여 작업 용액을 여과한다.</li>
		<li>15 분의 배양 후, 포름 알데히드를 제거하고, 60 % 이소 프로필 알코올로 세포를 헹구고, 여과 된 오일 레드 오 작업 용액 1 mL를 첨가하고, RT에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>배양 후 흐르는 물로 세포를 씻으십시오. 그런 다음 도립 현미경(배율: 20x 대물렌즈 및 10x 접안렌즈)으로 지질이 함유된 지방 세포를 관찰합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA 발현 분석 참고: 이 연구에 사용된 프라이머 목록은 표 2 를 참조하십시오.<ol><li>배지를 흡인하고 1mL/웰의 트리졸을 웰에 추가합니다.</li>
		<li>RT에서 15분 동안 배양하고, 피펫팅으로 세포를 분리하고, 1.5mL 튜브에 샘플을 수집합니다. 샘플은 RNA 추출까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>냉동 샘플을 RT로 해동하고 200 μL의 클로로포름을 샘플에 첨가하고 15 초 동안 격렬하게 흔든다.</li>
		<li>샘플을 RT에서 3분 동안 인큐베이션한 다음, 4°C에서 15분 동안 20,000 x g 로 회전시킨다.</li>
		<li>수성 상 (상단, 무색)을 조심스럽게 제거하고 새 튜브로 옮깁니다. 단백질 상(중간, 흰색) 또는 페놀/클로로포름 상(하단, 분홍색)을 옮기지 마십시오.</li>
		<li>같은 양의 70% EtOH를 천천히 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 소용돌이치지 마십시오.</li>
		<li>샘플(최대 700 μL)을 수집 튜브에 장착된 RNA 스핀 컬럼에 로드합니다. 형성되었을 수 있는 침전물을 포함해야 합니다.</li>
		<li>4°C에서 30초 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.</li>
		<li>700μL의 버퍼 RW1을 추가하고 4°C에서 30초 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.</li>
		<li>컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 500μL의 버퍼 RPE를 추가합니다.</li>
		<li>4°C에서 30초 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.</li>
		<li>500μL의 버퍼 RPE를 추가하고 4°C에서 2분 동안 9,000 x g 로 회전한 다음 플로우 스루를 버립니다.</li>
		<li>컬럼을 새로운 수집 튜브로 옮기고, 4°C에서 1-2분 동안 9,000 x g 로 스핀(완충액이 없는 컬럼)한다.</li>
		<li>컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브로 옮기고 30μL의 RNase가 없는 물을 컬럼 멤브레인에 직접 추가합니다.</li>
		<li>샘플을 RT에서 1-2분 동안 배양합니다. 그런 다음 4°C에서 1분 동안 9,000 x g 로 회전시켜 RNA를 용출시킵니다.</li>
		<li>형광 분광계를 사용하여 RNA 농도를 확인합니다. 알림: 여기에 농도를 맞추는 것이 좋습니다.</li>
		<li>~200ng의 RNA 템플릿을 사용하여 역전사를 수행합니다. 상용 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR-RT) 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜을 따르십시오. 반응 후 cDNA를 200 μL로 20배 희석한다.</li>
		<li>384웰 플레이트의 각 웰에 cDNA 2.0μL, Power Sybr Green Master Mix 3.0μL, 100μM qPCR 정방향 프라이머 0.018μL, 100μM qPCR 역방향 프라이머 0.018μL, ddH2O 0.96μL를 추가합니다.</li>
		<li>qPCR 실행(유지 단계: 50°C에서 2분, 95°C에서 2분; PCR 단계: 95°C에서 15초 동안 및 60°C에서 1분 동안 40주기; 용융 곡선 단계: 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 95°C에서 15초). 정량화를 위해 표준 곡선 방법을 사용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

murine white 지방 조직의 반자동 분리

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저자 중 누구도 이 작업과 관련하여 경쟁적인 재정적 이해관계를 가지고 있지 않습니다.

여기에서 우리는 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 수행하기 위해 쥐 지방 조직으로부터 SVF를 분리하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 콜라게나제 분해를 위한 조직 해리제의 사용은 실험 변형을 감소시키고 오염 위험을 줄이며 재현성을 증가시켰습니다. 이 절차는 제시된 프로토콜 내에서 중요한 단계이지만 프로세스는 고도로 자동화되어 있으며 최적화가 필요하지 않습니다. 그러나 마우스의 나이와 지방 조직 저장소에 따라 다짐의 최적화(예: 조각 크기 또는 절단 시간)가 필요할 수 있습니다.
SVF는 지방전구세포, 대식세포와 같은 면역 세포, 내피 세포 및 기타 세포로 구성된 이종 집단으로 알려져 있습니다. 지방전구세포는 배양 접시에 달라붙고 세척 및 배지 변화에 내성이 있기 때문에 계대 동안 세포 집단이 풍부해집니다. 그러나, 이 프로토콜에 의해 얻어진 "지방전구세포"가 여전히 이질적이라고 가정하는 것이 합리적이다. PDGFRα...

지방 조직 생물학은 전 세계적으로 비만과 제2형 당뇨병의 유병률이 증가함에 따라 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다1. 지방 세포는 기아 시 방출되는 지질 방울의 형태로 과도한 에너지를 저장합니다. 또한, 지방 조직은 내분비 기관으로 작용하고 다른 조직과 소통함으로써 전신 에너지 항상성을 유지한다 2,3. 흥미롭게도, 과도한 지방 조직(비만)과 지방 손실(지방이영양증)은 모두 인슐린 저항성 및 당뇨병과 관련이 있습니다1. 지방세포는 흰색, 갈색, 베이지색의 세 가지 유형으로 나뉩니다1. 백색 지방세포는 주로 과잉 에너지를 지질로 저장하는 반면, 갈색 및 베이지색 지방세포는 미토콘드리아 분리 단백질-1(Ucp1)을 통해 열의 형태로 에너지를 발산합니다.1,4. 특히, 베이지색 지방세포("유도성" 갈색 지방세포라고도 함)는 차가운 자극 또는 교감신경 자극에 반응하여 백색 지방세포에 나타나며, "고전적인" 갈색 지방세포와 겹치지만 구별되는 유전자 발현 패턴을 보인다5. 최근, 갈색 및 베이지색 지방세포는 "에너지 섭취 억제"보다는 "에너지 소산 향상"을 목표로 하는 항비만 및 항당뇨병 치료의 잠재적 표적으로 예상되었습니다4. 이를 뒷받침하는 바로는, 인간에서 FTO 비만 변이체 rs1421085의 위험 대립유전자는 일반적인 변이체 6,7 중에서 더 높은 체질량 지수(BMI)와 가장 강한 연관성을 나타내고 다양한 유전자-환경 상호작용8,9을 나타내며, 베이지색 지방세포 분화 및 기능을 음성적으로 조절하는 것으로 보고되었다10. 과산화소체 증식제 활성화 수용체 γ(PPARγ)은 지방생성의 마스터 전사 조절인자로 알려져 있으며, 지방세포 분화에 필요하고 충분하다11. 전사 조절인자, 예컨대 PRD1-BF1-RIZ1 상동 도메인 16 (PRDM16), 초기 b 세포 인자 2 (EBF2) 및 핵 인자 I-A (NFIA)는 갈색 및 베이지색 지방세포 분화 및 기능에 결정적이다 12,13,14,15,16,17,18. 반면에, 백색 지방 세포 유전자 프로그래밍은 트랜스듀신 유사 인핸서 단백질 3 (TLE3) 및 징크 핑거 단백질 423 (ZFP423) 19,20,21과 같은 전사 조절자를 필요로합니다.
체외 모델 시스템을 통해 지방 세포의 기능과 기능 장애의 기초가 되는 메커니즘에 대한 이해를 향상시키는 것을 목표로 하는 분자 연구를 수행할 수 있습니다. 3T3-L1 및 3T3-F442A와 같은 공개적으로 이용 가능하고 불멸화된 지방전구세포 세포주 가 존재하지만22,23,24, 1차 지방전구세포의 배양 및 지방세포로의 분화는 생체내 지방생성을 연구하는 데 더 적합한 모델이 될 것이다. 쥐 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획 (SVF)을 분리하는 것은 1 차 지방 전구 세포를 얻는 잘 알려진 방법이다25,26. 그러나 일반적으로 튜브 랙이 있는 박테리아 셰이커를 사용하여 수행되는 지방 조직의 콜라게나제 분해는 실험적 변형을 초래할 수 있으며 오염되기 쉽습니다27,28. 여기에서는 SVF를 더 쉽게 분리하기 위해 콜라게나제 소화를 위해 부드러운 MACS(Magnetic-Activated Cell Sorting) 조직 해리기를 사용하는 대체 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>100 mm 접시</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>12 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 접시</td><td>IWAKI</td><td>3010-060</td><td></td></tr><tr><td>지방 조직 해리 키트, 마우스 및 쥐</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-808</td><td>내용물 : 효소 D, 효소 R, 효소 A 및 버퍼 A</td></tr><tr><td>세포 여과기 70 &micro; m</td><td>BD falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 코팅 디쉬, 100mm</td><td>BD#</td><td>356450</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 코팅 디쉬, 60mm</td><td>BD#</td><td>354401</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I 코트 마이크로플레이트 6</td>웰 <td>IWAKI</td><td>4810-010</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Wako</td><td>041-18861</td><td></td></tr><tr><td>사용 전 겸</td>자 <td>N/A</td><td></td><td>오토클레이브</td></tr><tr><td>해부 가위, 무딘/날카로운</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>사용 전 오토클레이</td></tr>브 <tr><td>해부 가위, 날카롭고 날카로운</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>사용 전 오토클레이브</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Milteny Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS히터가 있는 옥토 해리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R Injection U-100</td><td>Eli Lilly</td><td>872492</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma</td><td>I7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Isobutylmethylxanthine (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>17018-1G</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin 황산염</td><td>후지필름</td><td>146-08871&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>pBABE-neo largeTcDNA (SV40)</td><td>유전자 추가</td><td>#1780</td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line</td><td>cell biolab</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12996-81</td><td></td></tr><tr><td>Power Sybr Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RT 마스터 믹스</td><td>TOYOBO</td><td>#FSQ-201</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Wako</td><td>180-02653</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T2877-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

흰색, 갈색 및 베이지색 지방세포 분화에 대한 시험관 내 연구를 통해 지방세포의 세포 자율 기능과 그 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 불멸화 된 백색 지방 전구 세포 세포주는 공개적으로 이용 가능하며 널리 사용됩니다. 그러나 외부 신호에 대한 반응으로 백색 지방 조직에서 베이지색 지방세포의 출현은 공개적으로 이용 가능한 백색 지방세포 세포주를 사용하여 완전히 재현하기 어렵습니다. 쥐 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리는 일반적으로 1 차 지방 전구 세포를 얻고 지방 세포 분화를 수행하기 위해 실행됩니다. 그러나 손으로 지방 조직을 다듬고 콜라게나제를 분해하면 실험적 변형이 발생할 수 있으며 오염되기 쉽습니다. 여기에서 우리는 실험 변형을 줄이고 오염을 줄이며 재현성을 높이기 위해 SVF를 더 쉽게 분리하기 위해 콜라게나제 소화를 위한 조직 해리기를 활용하는 수정된 반자동 프로토콜을 제시합니다. 얻어진 지방전구세포와 분화된 지방세포는 기능적 및 기계론적 분석에 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 지방 세포 분화를 유도한 후 7일 후에 완전히 분화된 지질이 함유된 지방 세포를 생성합니다. 지방세포 분화 정도는 트리글리세리드 및 지질의 오일 레드 오 염색(도 1A) 또는 지방세포 생성의 마스터 조절인자인 Pparg 및 이의 표적 Fabp4와 같은 지방세포 유전자의 qPCR-RT를 이용한 mRNA 발현 분석에 의해 평가될 수 있다(도 1B). 시험관 내에서 베이지색 지방세포 분화를 유도하기 위해, 로시글리타존과 같은 PPARγ 작용제의 티아졸리딘디온 부류가 사용될 수 있다. 실제로, 로시글리타존을 사용한 실험에서 우리는 Ucp1 및 Ppargc1a와 같은 갈색 지방 특이적 유전자의 발현 수준에 대해 최대 1μM 농도의 용량 의존적 효과를 관찰합니다. 한편, Fabp4에 대한 로시글리타존의 효과는 0.1 μM의 ...

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

우리는 열의 형태로 에너지를 발산하는 갈색 및 베이지색 지방세포의 아형에 관심이 있는 반면, 백색 지방세포는 일반적으로 에너지 섭취를 억제하는 것이 아니라 에너지 소비를 촉진하여 비만과 당뇨병에 대한 새로운 치료법을 개발하는 것이 목표입니다. 우리는 전사 인자인 NFI를 게놈 차원의 개방형 염색질 분석에 의해 갈색 지방세포 분화의 중요한 조절자로 확인했습니다. NFI와 지방 생성의 마스터 전사 조절자인 PPAR-감마는 갈색 지방 특이적 강화제로 공동 국소화됩니다.마우스 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획을 분리하는 과정에서, 지방 조직의 수동 다짐 및 콜라게나제 소화는 실험적 가변성 및 오염을 초래할 수 있다. 우리의 방법은 콜라게나제 소화를 위해 조직 해리제를 사용하여 SVF 분리를 용이하게 하고 실험 가변성과 오염을 줄이며 재현성을 향상시킵니다. 개별적으로 분화된 지방세포를 이용한 실험은 본 분야의 연구에 빠뜨릴 수 없습니다.우리의 프로토콜은 후속 지방 세포 분화를 위해 쉽고 재현 가능한 SVF 분리를 제공하고 우리 커뮤니티에서 연구를 가속화할 것입니다. 현재 우리는 기능 마우스 모델의 이득 및 손실을 사용하여 체중 및 포도당과 같은 전신 대사의 NFI의 역할을 조사하고 있습니다. 우리는 또한 가까운 장래에 각 다운스트림 경로에 대한 NFI의 다른 약리학적 활성화를 탐구할 것입니다.

semi-automated-isolation-stromal-vascular-fraction-from-murine-white

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

마우스의 흰색 지방 조직으로부터 격리 기본 흰색 preadipocytes는 베이지 색 / brite 세포로 구분 할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 백색 지방의 "브라우닝"의 분자 규정을 연구 할 수있는 신뢰할 수있는 셀룰러 모델 시스템입니다.

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

2001 년, UCLA의 연구자들은 성체 줄기 세포의 인구의 분리는 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 나부터 ASC라고 기술. 이 문서는 콜라게나 제를 사용 설명서, 소화 효소의 프로토콜을 사용 lipoaspirates에서부터 ASC의 분리를 설명.

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

지방 조직 (AT)는 강력한 면역 세포 활성화와 상호 작용의 사이트입니다. 면역 시스템의 거의 모든 세포는 AT의 존재와 그 비율은 비만에 의해 변경됩니다. 면역 세포 인구 AT의 적절한 분리, 정량 및 특성은 immunometabolic 질병에서 자신의 역할을 이해하는 데 중요하다.

지방 조직 면역 세포의 분리

우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다.

조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리

흰색 adipose 조직 (WAT) 약물 개발 및 대사 연구를 방해, 그것의 현재 기본 문화 모델에 중요 한 결함을 있다. 여기, 선물이 stromal 세포 시트 사이 붙여 와트에 의해 많은 microphysiological 시스템을 생산 하는 프로토콜. 이 구조는 기본 와트 문화에 대 한 안정적이 고 융통성 있는 플랫폼을 제공합니다.

인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

학습하세요 조직 해리기를 활용한 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리 방법을 통해 전지방세포 분화를 연구하는 기술입니다. 이 프로토콜은 비만 및 당뇨병 연구에 활용됩니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

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