Name: Xenopus의 효과적인 급속 관류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 학습하세요 Xenopus laevis와 Xenopus tropicalis를 이용한 신속 혈액 관류법으로 조직 샘플의 신선도를 극대화하여 전사체학 및 단백체학 연구에 활용하는 방법을 배우세요.

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이 작업은 NIH의 OD R24 보조금 OD031956 및 NICHD R01 보조금 HD073104의 지원을 받았습니다. 이 프로토콜에 대한 유용한 토론과 초기 의견을 주신 Darcy Kelly에게 감사드립니다. 또한 도움과 지원을 해주신 Samantha Jalbert, Jill Ralston, Wil Ratzan과 피드백을 주신 익명의 피어 리뷰어 3명에게도 감사드립니다.

모든 실험은 하버드 의과대학 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)의 규칙 및 규정에 따라 수행하였다.
참고: 미국 수의학 협회(American Veterinary Medical Association)는 안락사의 일차적인 방법이 안락사에 대해 받아들일 수 있는 것으로 간주되지만12, 심장 박동을 멈추게 하는 것으로 밝혀지지는 않았다13. 자주 사용되는 이중 pithing의 2 차 방법조차도 이것을 막지 못하며 동물에게서 심장을 제거하지도 않습니다. 마취된 동물의 방혈은 성공적인 안락사를 위한 인도적이고 효과적인 방법으로 간주된다12. 안락사를 통해 신선한 조직을 유지하는 것이 이 프로토콜의 목표이기 때문에 MS-222를 사용한 1차 안락사를 통해 심장이 계속 뛰는 것이 유익하며, 관류 자체가 방혈을 통한 2차 안락사 방법입니다.
1. 준비
<ol><li>연구 기관이 이 프로토콜에 설명된 안락사 및 관류 기술을 승인했는지 확인합니다.</li>
	<li>5g/L MS-222(트리카인 메탄설포네이트) 및 5g/L 중탄산나트륨 용액을 준비합니다. 부피는 안락사되는 동물을 완전히 덮는 데 필요한 부피보다 커야 합니다. pH가 ≥7인지 확인하십시오.</li>
	<li>X. laevis당 인산염 완충 식염수(PBS)에 180U/mL 헤파린 500μL 또는 X. tropicalis당 200μL를 준비합니다.</li>
	<li>이 용액에 Xenopus 를 넣어 1차 안락사를 수행합니다(1.2단계부터). 동물은 총 1시간 동안 물에 잠긴 상태를 유지합니다.</li>
	<li>Xenopus가 안락사에 15분 동안 발을 집어 통증 반응을 잃었는지 확인합니다. 동물이 반응하는 경우 이 반응이 사라질 때까지 안락사 용액으로 되돌립니다.</li>
	<li>Xenopus의 무게를 측정하고 샘플링 전에 필요한 추가 측정을 수행합니다.</li>
	<li>31G 바늘을 사용하여 PBS(1.3단계부터)에 X. laevis 에 250μL, X. tropicalis 에 180U/mL 헤파린 100μL를 각 앞다리의 근육에 주입합니다.</li>
	<li>PBS 관류액에 54U/mL 헤파린의 동물 무게 1mL/g 용액을 준비합니다. 이 프로토콜에 대해 더 많은 경험을 가진 개인은 관류를 완료하는 데 더 적은 매체가 필요하다는 것을 알 수 있습니다.</li>
	<li>X. laevis를 관류하려면 22G 피하 주사 바늘을 사용하고 X. tropicalis에는 25G 피하 주사 바늘을 사용하십시오. 와이어 커터로 팁을 잘라내어 관류 바늘을 무디게 합니다(그림 1)14. 알림: 이렇게 하면 바늘이 이동할 경우 심실을 통해 구멍이 뚫릴 가능성이 줄어듭니다. 무뎌지는 것 외에도 바늘은 날카로운 돌이나 줄로 약간 갈아질 수 있지만 여전히 심실을 뚫을 수 있을 만큼 날카롭습니다.</li>
	<li>손질된 바늘을 부착하고 54U/mL 헤파린화된 PBS 관류액을 순환시켜 펌프를 준비합니다(1.8단계부터). 관류 효율 감소 또는 실패로 이어지는 공기 색전증의 가능성을 제거하기 위해 튜브에서 모든 기포를 제거해야 합니다( 표 1 참조). 시술 기간 동안 관류 매체를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>펌프를 프로그래밍할 수 없는 경우 바늘을 제자리에 놓고 다른 설정에서 펌핑된 배지 부피를 측정하여 5mL/분 및 10mL/분에 가장 가까운 설정을 결정합니다. 이러한 유속은 종에 관계없이 사용됩니다. 관류 펌프를 프로그래밍할 수 있는 경우 제조업체의 지침에 따라 바늘을 제자리에 놓고 보정하십시오.</li>
	<li>해부면(트레이 또는 폼 시트)을 2차 용기 내의 경사면에 놓거나 혈액 배출을 용이하게 하도록 배열합니다.</li>
	<li>개구리가 1시간 동안 용액에 들어가면 1차 안락사가 완료됩니다. 개구리를 제거하고 발을 꼬집어 통증 반응의 상실을 다시 확인하십시오.</li>
	<li>개구리를 등에 대고 각 팔다리를 고정합니다(그림 2). 팔다리의 조직을 보존해야 하는 경우 팔다리 주위의 숫자 또는 U자형 스테이플을 통해 가는 핀을 배치할 수 있습니다.</li>
	<li>해부 가위를 사용하여 피부를 자르고 정중선을 위로 올린 다음 옆으로 두 개의 플랩을 만듭니다. (그림 2)</li>
	<li>집게를 사용하여 linea alba를 잡고 체강에서 당겨 빼냅니다(그림 3). 조심스럽게 가위를 사용하여 근육 조직을 자릅니다. 캐비티 벽에서 두 개의 플랩을 만들고 모든 플랩을 자르거나 고정합니다.</li>
	<li>해부 가위를 사용하여 코라코이드 뼈를 절단하고 과도한 조직을 잘라내어 심장에 더 잘 접근할 수 있도록 합니다(그림 3).</li>
	<li>심장은 여전히 뛰고 있어야합니다. 관류 전에 심장 박동이 멈춘 경우 샘플의 신선도가 손상되었음을 확인하십시오.</li>
</ol>2. 관류
<ol><li>위를 확인하고 간장의 왼쪽 엽 (시청자의 오른쪽) 위에 오도록 부드럽게 이동시켜 수술 기간 동안 혈관 구조를 볼 수 있도록합니다. 폐를 식별하고 조직 집게를 사용하여 끝으로 잡습니다. 폐를 체강 밖으로 당기고 팁을 통해 고정합니다(그림 4). 부러진 혈관이 잘 관류되지 않으므로 부드럽게하십시오. 엽 내에서 혈액이 보이면 절차 완료를 결정하는 능력에 영향을 미칩니다.</li>
	<li>체강 공동의 이미지를 촬영하여 관류 효율을 더 잘 평가하고 나중에 비정상 조직을 식별할 수 있습니다.</li>
	<li>얇은 심낭을 확인하고 조직 집게로 당깁니다 (그림 5). 홍채 절제술 가위의 끝을 사용하여 심낭을 부드럽게 천공하고 밑에있는 조직을 자르지 않도록주의하십시오. 심장의 세 방에서 심낭을 떼어냅니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 심실의 정점을 부드럽게 잡습니다. 관류 바늘이 통과할 수 있도록 집게의 견인면 사이에 충분한 공간이 있도록 제한된 압력을 가합니다(그림 6).</li>
	<li>집게의 폐쇄를 통해 바늘을 심실의 챔버에 삽입하고 심실을 통해 천공되지 않도록주의하십시오 (그림 7). 지혈제를 사용하여 바늘 홀더를 사용하여 조직 집게를 제자리에 고정합니다. 알림: 이 기술은 여전히 날카로운 바늘의 위치를 안정화합니다. 바늘을 심실에 직접 클램핑하면 불필요한 손상이 발생하여 필요한 경우 재클램핑이 더 어려워집니다( 표 1 참조).</li>
	<li>약 5mL/min의 속도로 펌프의 흐름을 시작합니다. 심장과 동맥 줄기의 세 방이 충혈됩니다(그림 8, 표 1 참조).</li>
	<li>가위로 오른쪽 귓바퀴 (시청자의 왼쪽)를 조심스럽게 랜스합니다. 피가 쏟아질 것입니다. 유속을 5mL/분으로 설정하거나 10mL/분으로 늘립니다.</li>
	<li>위의 혈관 구조가 희미 해질 때까지 계속 ( 표 1 참조) 심장의 왼쪽 귓바퀴 (시청자의 오른쪽)를 랜스합니다. 유속이 여전히 5mL/분이면 약 10mL/분으로 늘립니다.</li>
	<li>이송 피펫을 사용하여 관류 매체에서 체강 공동을 헹구면 가시성을 유지하고 귀에서 흐르는 관류액의 색상을 더 잘 평가할 수 있습니다.</li>
	<li>귓바퀴에서 흐르는 관류액이 깨끗해지고(표 1 참조) 폐가 붉은 색조를 잃을 때까지 바늘을 제자리에 두십시오(표 1 참조; 그림 9).</li>
</ol>

Blood Perfusion in African Clawed Frogs for transcriptomics and proteomics(전사체학 및 단백질체학을 위한 아프리카 발톱 개구리의 혈액 관류)

<ol><li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog%2C+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li>
<li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis+Daudin%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li>
<li>Miodoński, A. J., Bär, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+%28Rana+temporaria%2C+Rana+esculenta%29.+Scanning+electron-microscopic+%28SEM%29+study+of+microcorrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li>
<li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%3A+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).</li>
<li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus%3A+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li>
<li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).</li>
<li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals%2C+2020+edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).</li>
<li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Clinics+of+North+America.+Exotic+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li>
<li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vertebrate+heart%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li>
<li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+protocol+for+lizards%2C+including+a+method+for+brain+removal%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 체강에 접근하기 위한 전통적인 해부 기술을 설명합니다. 조직에 최소한의 손상을 입히고 심장에 접근 할 수 있으며 폐와 위가 보이는 경우 다른 기술도 허용됩니다. 마찬가지로, 나열된 대부분의 해부 도구는 유사한 항목으로 쉽게 대체할 수 있습니다.
이 절차의 효능을 최적화하기 위한 시도가 있었지만 결과는 개인의 경험과 개별 개구리 간의 가변성에 따라 다를 수 있습니다. 이 논문의 범위를 벗어난 혈액 관류의 한 가지 흥미로운 측면은 이 절차가 수술을 받는 동물에 대한 대체 관류 방법과 어떻게 비교되는지입니다. 또 다른 미개척 변수는 아주 어린 동물이나 혈관 구조가 지나치게 취약할 수 있는 고령 동물에서 혈액 관류가 어떻게 작용하는지입니다. 이 프로토콜의 적용을 용이하게 하기 위해 추가 설명이 제공됩니다. 몇 가지 일반적인 문제, 가능한 원인 및 제안된 개선 조치가 표 1에 나와 있습니다.
이...

양서류의 전신 관류는 보존과 고정을 위해 일상적으로 이루어진다 1,2,3,4,5,6. 그러나 이러한 절차는 동물당 채취할 수 있는 신선한 샘플의 수를 제한하는 속도로 발생합니다. 이 연구의 목표는 Xenopus에서 효과적인 혈액 관류 프로토콜을 개발하여 기술의 속도를 우선시하는 것입니다. 이 프로토콜은 X. tropicalis의 경우 동물당 10분 미만, X. laevis 동물당 15분 미만이 소요됩니다. 두 번째 우선 순위는 복제의 용이성과 쉽게 획득할 수 있는 장비의 사용으로, 고품질 샘플을 Xenopus 실험실 간에 널리 공유할 수 있습니다.
Xenopus 개구리는 종에 걸쳐 보존된 기본적인 생물학적 및 병리학적 과정을 연구하기 위해 생물 의학 연구에서 널리 사용됩니다. 이 네발 동물은 다른 수생 모델보다 포유류와 더 밀접한 진화 관계를 가지고 있으며, 폐, 3 개의 방이있는 심장 및 손가락이있는 팔다리를 가지고 있습니다. 국제 사회는 Xenopus 를 효과적으로 사용하여 심층적인 질병 모델링 및 질병 관련 유전자 기능의 분자 분석을 통해 인간 질병에 대한 더 깊은 이해를 얻습니다. 동물 모델로서 Xenopus 의 수많은 장점은 인간 발달 및 질병의 분자 기초를 연구하는 데 매우 귀중한 도구입니다. 이러한 장점에는 큰 난모세포 및 배아 크기, 높은 생식력, 주거 용이성, 신속한 외부 발달 및 게놈 조작 용이성이 포함됩니다. 제노푸스는 확인된 인간 질병 유전자의 ~80%를 공유하는 것으로 추정된다7.
널리 사용되는 포유류 모델과 비교할 때, Xenopus는 모르폴리노 녹다운이 용이하고 CRISPR8을 사용하여 효율적인 형질전환 및 표적 유전자 돌연변이를 사용할 수 있는 빠르고 비용 효율적인 모델입니다. 정량적 질량분석법과 단일세포 전사체학(single-cell transcriptomics)이 제노푸스 배아(Xenopus embryos)9,10에 성공적으로 적용되었지만, 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 최근 세포 지도는 대부분의 조직의 구성이 혈구 유형에 의해 지배된다는 것을 보여준다 11. 빠른 속도로 조직을 피폐화하는 기술을 개발하고 냉각 매체를 사용함으로써 시료의 신선도는 관류에 의해 최소화됩니다. 이는 생리학적으로 교란되지 않은 mRNA 또는 단백질 발현을 프로파일링하는 것이 목표인 응용 분야에서 특히 중요합니다.

<table><tbody><tr><td>LED 조명이있는 5x 돋보기와 B08QJ6J8P1</td> 조명 <td>amazon.com</td><td></td> 스탠드는 <td>열을 발생시켜서는 안됩니다</td></tr>. <tr><td>일회용 전사 피펫</td><td>VWR</td><td>414004-036</td><td></td></tr> <tr><td>해부 세밀한 집게</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위 날카로운 piont, 직선 6.5"</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>해부 트레이</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>스티로폼 시트는 허용되는 대안입니다.</td></tr><tr><td>안락사 용기</td><td>US 플라스틱</td><td>아이템&nbsp; 2860</td><td>대체 불투명 용기 허용</td></tr><tr><td>안락사 용기 뚜껑</td><td>미국 플라스틱</td><td>품목&nbsp; 3047</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 핀</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PIN-#3</td><td></td></tr><tr><td>범용 피하 주사 바늘, 22G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5A</td><td>X. laevis</td></tr> <tr><td>범용 피하 주사 바늘, 25G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>X. tropicalis</td></tr><tr><td>Heparin, 돼지 장 점막</td><td>용MilliporeSigma</td><td>37-505-410MG</td><td></td></tr><tr><td>홍채 제거 가위 6"</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>홍채 가위는 허용 가능한 대안입니다.</td></tr><tr><td>Luer-to-barb 어댑터 남성 Luer는 잠금 링이</td><td>amazon.com</td><td></td><td>B09PTX6M2Z 크기는 사용된 펌프의 호스에 따라 달라질 것입니다.</td></tr><tr><td>Mayo-Hegar 바늘 홀더</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-966</td><td>모기 집게는 허용 가능한 대안입니다.</td></tr><tr><td>MS-222: Syncaine (이전에는 tricaine)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>연동 액체 펌프 도징 펌프 5&ndash; 100 mL / min</td><td>amazon.com</td><td></td><td>5-10mL / min을 펌핑 할 수있는 연동 펌프B07PWY4SM6 허용됩니다</td></tr><tr><td>. 숫돌</td><td>VWR</td><td>470150-112</td><td>선택 사항; 무딘 바늘 용</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨, 분말, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>표본 집게, 톱니 모양의</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr>Fisher<td>해부 용 T- 핀</td><td> Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr><tr><td>초미세 쇼트 인슐린 주사기, 31G</td><td>VWR</td><td>BD328438</td><td></td></tr><tr><td>와이어 플러시 커터, 6인치 초선명하고 강력한 사이드 커터 클리퍼</td><td>amazon.com</td><td>B087P191LP</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus의 효과적인 급속 관류

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

제노푸스는 100년 넘게 척추동물의 발달과 질병을 이해하는 강력한 모델 유기체였습니다. 여기에서는 모든 조직 내에서 일관되고 과감한 혈액 감소를 목표로 하는 Xenopus의 신속한 혈액 관류 프로토콜이 정의됩니다. 관류는 바늘을 심장의 심실에 직접 삽입하고 혈관계를 통해 헤파린 화 인산염 완충 식염수 (PBS)를 펌핑하여 수행됩니다. 절차는 동물 당 약 10 분 안에 완료 할 수 있습니다. 혈액은 몇 가지 매우 풍부한 단백질과 세포 유형에 의해 지배되며, 이러한 단백질이 대부분의 다른 분자와 관심 세포 유형을 가리기 때문에 수많은 문제를 야기합니다. 정량적 단백질체학 및 단일 세포 전사체학을 사용한 성인 Xenopus 조직의 재현 가능한 특성화는 장기 샘플링 전에 이 프로토콜을 적용함으로써 이점을 얻을 수 있습니다. 조직 샘플링을 위한 프로토콜은 동반 논문에 정의되어 있습니다. 이 절차는 성별, 연령 및 건강 상태가 다른 Xenopus, 특히 X. laevis 및 X. tropicalis의 관행을 표준화하는 것을 목표로합니다.

성공적인 관류 후, 모든 조직 (색소 Xenopus의 간 제외)은 뚜렷하게 가볍고 혈액으로 덜 포화 될 것입니다. 주요 혈관은 눈에 띄지 않게 되고(그림 10), 조직(간 제외)은 샘플링 후 완충액에서 깨끗하게 헹구어집니다. 프로토콜의 성공적인 실행은 궁극적으로 피혈된 조직 샘플의 데이터 품질에 의해서만 확인될 수 있지만 몇 가지 일반적인 문제, 가능한 원인 및 제안된 개선 조치가 문제 해결 표에 나와 있습니다(표 1 및 그림 11).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65287/65287fig01.jpg"> ...

여기에 제시된 것은 전사체학 및 단백질체학 연구를 위해 아프리카 발톱 개구리의 조직 샘플을 준비하기 위한 효과적인 신속 혈액 관류 프로토콜입니다.

Xenopus의 효과적인 급속 관류

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

이 절차는 효율성을 극대화하는 방식으로 양서류 모델을 인도적으로 활용하는 데 중점을 둡니다. 표준화 관행은 원래 식민지에서 채취 및 보존된 샘플에 적용되어 생물 보안 위험을 완화하고 동물 수송 스트레스를 제거할 수 있습니다. 풍부함은 빠르게 완료될 수 있어 조직이 아직 신선할 때 샘플을 채취하는 데 사용할 수 있는 시간을 최대화할 수 있습니다.이러한 신선도는 단백질체학 및 전사체 프로파일링에 특히 중요합니다. 이 프로토콜은 상세하고 명시적이어서 다양한 배경을 가진 개인이 사용할 수 있습니다. 이를 통해 Xenopus 실험실 간에 고품질 샘플을 쉽게 공유할 수 있습니다.이 풍부한 기술과 함께 모든 주요 장기의 표준화된 샘플링을 위해 유사하게 포괄적인 프로토콜이 연구되고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

친 유성 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) 염색 기술을 사용하여 Ambystoma mexicanum 은 혈관 관류를 쉽게 시각화 할 수 있도록 혈관 재관류를받을 수 있습니다.

혈관 시각화를위한 DiI 관류<em&gt; 암 브리 스 토마 멕 시카 눔</em

여기 우리는 마우스 뇌 혈관 침투성 분석 결과 형광 추적기 관류 뇌혈관 장애의 동물 모델에 적용 되는 다음의 복 주사를 사용 하 여 현재. 한 반의 두뇌 양적 침투성을 평가 하 고 추적 프로그램 시각화/immunostaining에 대 한 다른 사용 됩니다. 절차 10 쥐에 대 한 5-6 시간 걸립니다.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Normothermic 전 situ 심장 관류 (ESHP) 치는, 반 생리 적인 상태에서 마음을 유지 합니다. 작업 모드에서 수행 될 때 ESHP 심장 기능 및 장기 생존을 기증자의 정교한 평가 수행할 수 있는 기회를 제공 합니다. 여기, 우리는 ESHP 동안 심근 성능 평가 대 한 우리의 방법을 설명합니다.

작업 모드에 Situ 심장 관류 Ex normothermic: 심장 기능 및 대사 평가

여기에 전 생체 모성 태아 혈관 관류의 프로토콜이 제시 되어 모계의 혈관 조직으로 시험 물품의 투여를 가능 하 게 하 고, xenobiotic 입자 또는 약리학 적 제제의 변경 이외에의 태 반 전달을 평가할 수 있도록 태 반 생리학.

설치류 태 반의 전 생체 관류

프로토콜은 방광, 전립선, 성기관, 뼈, 근육 및 발 피부를 포함한 마우스 하반신의 시상 수혈에 대해 설명된다.

마우스에서 하복부 장기 및 뒷다리의 시투 폐쇄 회로 관류 에 설립

이 기사는 빠르고 쉽게 접근할 수 있는 성인 Xenopus 의 6가지 중요하고 다양한 장기(심실, 간엽, 췌장, 지방체, 쌍을 이루는 신장 및 피부)를 샘플링하기 위한 가이드를 제공합니다.

성인 Xenopus에서 6개의 중요한 장기를 빠르게 샘플링하는 기술

이 프로토콜은 광시트 형광 현미경을 사용하여 정량적 전체 마운트 3차원 혈관 이미징을 위한 신속한 방법을 소개합니다. 이 방법의 효능은 전산 유체 역학을 통해 정량화된 혈역학적 힘과 함께 병아리 배아 모델의 인두 궁 동맥 시스템을 사용하여 입증되었습니다.

정량적 연구를 위한 소동물 혈관 구조의 신속한 전체 마운트 고해상도 이미징

이것은 포괄적인 Xenopus 샘플링 프로토콜의 첫 번째 부분입니다. 표본 조직은 심실, 동맥 줄기, 왼쪽 간엽, 담낭, 폐, 췌장, 비장, 후두, 식도, 위, 장, 고환, 지방체, 난관, 쌍을 이루는 신장, 좌골신경총, 피부, 흉선 및 눈 전체입니다.

성체 제노푸스(Xenopus)에서 접근 가능한 조직의 포괄적인 샘플링을 위한 효율적인 기술

여기에서는 기존 플랫폼의 높은 비용과 제한된 유연성을 극복하도록 설계된 오픈 소스의 수정 가능한 규범 보온 외 관류 시스템에 대한 프로토콜을 제시하여 전임상 생물 의학 연구에서 보다 접근하기 쉽고 비용 효율적이며 반복적인 사용을 가능하게 합니다.

연구 과학자를 위해 설계된 오픈 소스 normothermic 관류 시스템

학습하세요 Xenopus laevis와 Xenopus tropicalis를 이용한 신속 혈액 관류법으로 조직 샘플의 신선도를 극대화하여 전사체학 및 단백체학 연구에 활용하는 방법을 배우세요.

Xenopus의 효과적인 급속 관류

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