Name: 마우스의 카테터 관련 칸디다 알비칸스 감염 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 3 min 24 s
Description: 학습하세요 마우스를 이용한 Candida albicans 카테터 관련 감염 모델 구축 방법을. 형광 단백질을 활용한 바이오필름 시각화 기술로 임상 상황과의 상관관계를 분석하고 신규 치료제 개발에 활용할 수 있습니다.

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산시성 자연과학재단(보조금 번호 2021SF-118)과 중국 국립자연과학재단(보조금 번호 81973409, 82204631)의 재정적 지원에 감사드립니다.

실험동물인 수컷 BALB/c 마우스(12-16g)는 Xi'an Jiaotong University Health Science Center의 Laboratory Animal Center에서 구입했습니다. 모든 절차는 허가 번호 SCXK(산시) 2021-103으로 Xi'an Jiaotong University의 기관 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 완충액 및 장비 준비
<ol><li> C. albicans를 고발현 플라스미드 pCaExp로 transfection합니다.<ol><li>ATCC에서 C. albicans(SC5314)를 구입하십시오. EGFP 유전자의 완전한 개방 판독 프레임(플라스미드 맵은 그림 1에 표시됨)을 포함하는 고발현 플라스미드 pCaExp로 C. albicans를 transfection하여 EGFP 고발현 형광 균주22를 얻고 이를 후속 실험에 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형질주입된 C. albicans 균주를 배양합니다.<ol><li>효모 추출물 펩톤 덱스트로오스 배지(YPD) 플레이트에서 C. albicans 형광 균주의 단클론 콜로니를 선택하고 YPD 액체 배지(YPD + 50μg/mL 카베니실린) 5mL에서 밤새 배양(30°C 및 220rpm)합니다.</li>
		<li>상온에서 400 x g에서 5분 동안 원심분리 후 C. 알비칸을 생리식염수에 재현탁시킵니다.</li>
		<li>탁도를 0.5 McFarland 표준과 비교하여 C. albicans 현탁액의 농도를 1 x 108 cells/mL로 조정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수술 기구를 준비합니다.<ol><li>모든 수술 기구(가위, 집게, 지혈 겸자, 바늘 홀더, 봉합 바늘)를 121°C에서 30분 동안 고압멸균해야 합니다. 멸균 폴리에틸렌 카테터(내경: 0.28mm, 외경: 0.63mm)가 사용됩니다. 참고: 이 연구에 사용된 카테터는 에틸렌옥사이드 가스로 멸균되었으며 포장은 UV에 30분 이상 노출된 매우 깨끗한 테이블에서 개봉되었습니다. 마우스에 이식하기 전에 카테터를 오염을 방지하기 위해 75% 에탄올에 담갔습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 마우스 CRI 모델 구축
참고: 수술 절차는 그림 2에 나와 있습니다.
<ol><li>BALB/c 마우스 30마리(12-16g, 수컷)를 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 특정 병원균 무함유(SPF) 조건에서 12시간-12시간 동안 빛과 어둠을 번갈아 가며 적응시킵니다.</li>
	<li>30개의 BALB/c 마우스를 무작위로 3개의 그룹으로 나눕니다(n = 10개의 마우스/그룹): (A) 정상 대조군; (B) 카테터 그룹( C. albicans 없이 이식된 카테터); (C) 모델 그룹( C. albicans가 이식된 카테터).</li>
	<li>1-4% 이소플루란으로 마우스를 마취하고 마우스를 엎드린 자세로 수술대에 놓습니다. 발가락 자극에 대한 반응이 없고 올바른 반사가 없어지면 성공적인 마취가 확인됩니다. 머리카락을 제거하고 요오드포 또는 클로르헥시딘과 알코올 스크럽을 번갈아 가며 3회 반복하여 수술 부위를 소독합니다.</li>
	<li>쥐를 아무런 치료 없이 정상 대조군에 남겨두고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>카테터 및 모델 그룹의 마우스의 경우 마취를 3% 이소플루란으로 유지합니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없어 적절한 마취 깊이를 확인하고 필요에 따라 이소플루란 농도를 조정합니다.</li>
	<li>카테터 그룹의 마우스의 경우 1mL 멸균 주사기를 역제모 부위에 피내로 삽입하여 구멍을 뚫습니다. 주사기 바늘을 제거한 후 구멍에 카테터(길이 약 1cm)를 삽입합니다.</li>
	<li>모델 그룹의 마우스의 경우, 20μL의 C. albicans를 역 제모 부위에 피펫팅하여 피부의 공생 C. albicans 를 시뮬레이션했습니다.</li>
	<li>용액이 피부에 흡수된 후 2.5단계에서 설명한 것과 동일한 절차로 역제모 부위에 카테터를 삽입합니다.</li>
	<li>카테터를 따라 조직에 현탁액 20μL를 더 피펫팅하여 외부 환경에서 C. 알비칸을 시뮬레이션합니다. </li>
	<li>테이프와 거즈로 카테터를 고정하고 쥐를 케이지로 돌려 먹이를 줍니다. 치료가 끝나면 생쥐에게 진통제로 멜록시캄(4mg/kg)을 3일 연속 피하 주사합니다. 참고: 수술 후 쥐에게 물과 음식을 조심스럽게 먹였습니다. 쥐들은 하루에 두 번 모니터링되었다. 마우스는 섭식 어려움, 상당한 체중 감소(10-20%) 및 저체온증을 경험한 경우 IACUC 승인 방법으로 안락사되었습니다.</li>
</ol>3. CRI 모델 평가
<ol><li>3일 후 쥐를 3% 이소플루란으로 마취하고 자궁경부 탈구로 희생시킵니다. 생쥐의 등에서 카테터와 피부 조직 샘플을 수집합니다.</li>
	<li>주사 전자 현미경으로 카테터의 C. albicans와 생물막을 관찰합니다.<ol><li>카테터를 4°C에서 48시간 동안 2.5% 글루타르알데히드 용액에 담급니다. 멸균 PBS로 카테터를 세 번 헹굽니다.</li>
		<li>카테터를 1% 오스믹산으로 3시간 동안 고정하고 멸균 PBS로 세 번 헹굽니다.</li>
		<li>경사 농도(50%, 70%, 80%, 90% 및 100%, 15분/그래디언트)로 그래디언트 에탄올 용액에서 카테터의 세포를 탈수합니다.</li>
		<li>카테터를 tert-부틸 알코올에 세 번 담급니다(매번 30분).</li>
		<li>액체 질소에서 카테터를 빠르게 동결하고 제조업체의 지침에 따라 동결 건조기에서 샘플을 동결 건조합니다.</li>
		<li>카테터 샘플에 이온 빔 증착을 통해 10nm 금으로 스퍼터 코팅합니다.</li>
		<li>주사 전자 현미경(고진공, 1.5kV 조건)으로 각 그룹의 카테터 표면에 C. albicans와 그 생물막의 존재를 관찰하고 각 그룹의 이미지를 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 현미경으로 카테터의 C. albicans를 관찰합니다.<ol><li>카테터를 4% 파라포름알데히드 용액에 담그고 4°C에서 48시간 동안 고정합니다.</li>
		<li>484nm 여기 하에서 형광 현미경으로 각 그룹의 카테터 표면에서 C. albicans와 그 생물막의 존재를 관찰하고 각 그룹의 이미지를 기록합니다. 참고: 배율은 400배입니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans )의 형광은 490nm에서 여기(excitation)와 510nm에서 방출(emission)로 관찰할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>쥐 피부에 서식하는 C. albicans를 관찰하십시오.<ol><li>생쥐의 등쪽 피부 조직을 4% 파라포름알데히드 용액에 담그고 4°C에서 48시간 동안 고정합니다.</li>
		<li>오름차순 농도(50%, 70%, 80%, 90% 및 100%, 15분/그래디언트)의 그래디언트 에탄올 용액에서 등쪽 피부 조직을 탈수합니다.</li>
		<li>탈수된 등쪽 피부 조직을 55-60°C의 파라핀에 담습니다. 부서지기 쉬운 조직을 피하기 위해 온도에 주의하십시오. 가능한 한 많은 불순물을 제거하려면 이 단계를 세 번(각각 30분) 반복합니다.</li>
		<li>등쪽 피부 조직(두께 = 5μm)을 마이크로톰으로 절편합니다.</li>
		<li>슬라이드를 크실렌에 20분 동안 두 번 담가 파라핀 섹션을 왁스를 제거합니다.</li>
		<li>매번 5분 동안 그라디언트 에탄올(절대 에탄올, 90% 에탄올, 75% 에탄올, 물)로 용리를 통해 섹션을 재수화합니다.</li>
		<li>흐르는 물로 한 번, 증류수로 두 번 세척하기 전에 주기산 용액에 섹션을 15분 동안 담가 주기산으로 섹션을 더럽힙니다.</li>
		<li>어두운 곳에서 쉐브론 염색 용액(제조업체의 지침에 따라)으로 섹션을 30분 동안 얼룩지게 하고 흐르는 물에 5분 동안 섹션을 헹굽니다.</li>
		<li>섹션을 헤마톡실린 용액에 3-5분 동안 담근 후 흐르는 물(2-3분), 차별화된 용액(5-10분) 및 흐르는 물로 각각 세척합니다.</li>
		<li>섹션을 중성 검으로 밀봉하기 전에 섹션을 에탄올에 세 번(각 5분) 담그고 크실렌을 두 번(각 5분) 담그십시오.</li>
		<li>현미경으로 표본의 이미지를 관찰하고 마우스 피부의 C. albicans 잔류물을 분석합니다. 알림: 배율은 접안렌즈의 경우 10배, 대물 렌즈의 경우 4배 또는 10배입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>등쪽 피부 조직의 조직병리학적 변화를 관찰합니다.<ol><li>등쪽 피부 조직을 4% 파라포름알데히드 용액에 담그고 4°C에서 48시간 동안 고정합니다. 오름차순 농도(50%, 70%, 80%, 90% 및 100%, 15분/그래디언트)의 그라디언트 에탄올 용액에서 등쪽 피부 조직을 탈수합니다.</li>
		<li>3.4.3단계에서 설명한 대로 탈수된 등쪽 피부 조직을 파라핀에 삽입합니다.</li>
		<li>등쪽 피부 조직(두께 = 5mm)을 마이크로톰으로 절편합니다.</li>
		<li>슬라이드를 크실렌에 20분 동안 두 번 담가 파라핀 섹션을 왁스를 제거합니다.</li>
		<li>매번 5분 동안 그라디언트 에탄올(절대 에탄올, 90% 에탄올, 75% 에탄올, 물)로 용리를 통해 섹션을 재수화합니다.</li>
		<li>수돗물로 헹구기 전에 4분 동안 헤마톡실린으로 섹션을 염색하여 플로트 색상을 제거합니다.</li>
		<li>슬라이드를 흐르는 물로 헹구기 전에 1% 염산-에탄올 용액으로 시편을 분화합니다.</li>
		<li>표본을 85% 및 95% 에탄올에 5분 동안 담그고 3분 동안 에오신 용액으로 염색합니다.</li>
		<li>시편을 그래디언트 에탄올(70%, 90%, 95% 및 100%)과 크실렌에 각각 2분 동안 담가 탈수합니다.</li>
		<li>중성 수지로 시편을 밀봉합니다.</li>
		<li>현미경으로 검체의 이미지를 관찰하고 병리학적 변화를 분석합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

칸디다 알비칸스 관련 카테터 관련 감염에 대한 마우스 모델 확립

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저자들은 이 논문에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계를 알지 못한다고 선언합니다.

CRI는 임상 실습에서 가장 흔한 병원 감염 중 하나이다23. 표피, 피지선 및 모낭과 같은 피부 부속지의 병원균은 모두 CRI23,24의 가능한 원인입니다. 칸디다균은 CRI를 유발하는 세 번째로 큰 병원체이며, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 생물막 감염의 가장 흔한 유형이었습니다25,26. 따라서 우리는 관련 CRI의 치료 및 예방을 지원하기 위해 Candida albicans 생물막 관련 CRI의 관련 동물 모델을 구축하는 것을 목표로 했습니다.
CRI 모델을 구성하기 위해 소량의 C. albicans를 마우스의 등쪽 피부에 첨가하여 일상적인 멸균으로 피부의 깊은 조직과 부속지에서 C. albicans의 일부를 완전히 박멸할 수 없는 임상 상황을 시뮬레이션했습니다. 카테터를 이식한 후, 수술 중 외부 환경에서 C. 알비칸의 존재를 모방하기 위해 C. 알비칸스를 재접종하였다.
이 연구에서는 생물막 형성의 어려움으로 인해 전통적인 C. albicans 생물막 관련 동물 모델18,27보다 낮은 모델 구성을 위해 3일 시점을 선택했습니다. 감염 후 C. albicans의 접착력과 생물막 형성은 이 모델의 카테터 표면에서 볼 수 있었으며, 이는 SEM 및 형광 현미경 검사 결과(그림 3 및 그림 4)로 입증되었습니다. 이는 본 연구에서 C. 알비칸의 농도가 1 × 108 CFU/mL로 다른 동물 모델보다 훨씬 높았기 때문일 수있다 18,27. 또한 카테터 주변의 피부는 외부 환경과 지속적으로 접촉합니다. CRI가 직면할 수 있는 극한 환경을 시뮬레이션하기 위해 수술 후 C. albicans를 다시 접종했습니다.
감염의 재발은 종종 주변 조직에 남아 있는 병원체에 의해 발생한다 23,28,29. 따라서 조직 내 병원체의 존재 여부는 CRI에 중요합니다. 이 논문에서는 피부 조직에서 C. albicans의 잔류물을 조사하기 위해 PAS 염색을 수행했습니다. 이 방법은 또한 CRI에 대한 새로운 치료 약물 또는 방법의 제거 효과를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.
결론적으로, eGFP가 있는 칸디다 알비칸스 균주를 사용하여 카테터에 대한 칸디다 알비칸스 집락화의 직관적인 관찰을 용이하게 하기 위해 마우스 CRI 모델을 구성했습니다. 이 균주는 또한 칸디다 알비칸스와 숙주 세포 사이의 상호 작용, 예를 들어 칸디다 알비칸스의 숙주에 대한 침입 및 부착, 치료제의 항 칸디다 알비칸스 효과 및 면역 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 외부 환경 및 신체에서 유래한 병원체를 시뮬레이션하기 위해 2단계 접종 방법을 사용했습니다. 감염 후 후속 미생물 배양이 수행되지 않았다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 생물막의 존재는 배양30,31,32의 낮은 감도에 중요한 요소입니다. 이전 보고에 의하면 감염 후 미생물 배양은 민감도, 특이성 및 정확도가 낮았다 30,31,32,33,34. 대신, 임플란트에 생물막이 있는 것이 더 신뢰할 수 있는 지표입니다. 따라서 SEM 및 형광 현미경은 이 연구에서 생물막을 형성하는 칸디다 알비칸스를 시각화하고 식별하는 데 사용되었습니다.
그러나 이 모델은 환자의 약화된 면역과 클리닉에서 관찰된 칸디다 알비칸스 감염 사이의 상호작용을 시뮬레이션하지 않았습니다. 모델이 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 접종 전에 면역 저하 치료(예: 글루코코르티코이드의 연속 주사)35를 고려할 수 있다면 임상 상황에서 발생하는 감염을 더 잘 시뮬레이션할 수 있습니다.

최근 몇 년 동안 생물 의학 재료의 개발 및 적용으로 임플란트 관련 감염이 어려운 임상 문제로 부상하고 있습니다 1,2. 클리닉에서 의료용 카테터가 광범위하게 적용됨에 따라 관련 감염 및 사망 건수는 매년 엄청납니다 3,4. 카테터 관련 감염(CRI)의 일반적인 감염 경로는 다음과 같습니다: (1) 피부 표면의 병원체가 체내로 침투하여 카테터의 외부 표면에 부착됩니다 5,6,7; (2) 부적절한 무균 수술 유래 병원균이 카테터에 침입, 부착 및 식민지화됩니다. (3) 혈액 순환의 병원체가 카테터에 부착되어 서식합니다. (4) 병원성 미생물에 오염된 약물.
칸디다균은 CRI 8,9의 세 번째로 흔한 원인입니다. 임플란트 표면에 생물막이 형성된 후 혈류 감염 및 기타 생명을 위협하는 침습성 칸디다증을 유발할 가능성이 매우 높습니다. 예후가 나쁘고 사망률이 높다2. 생물막은 중심 정맥 삽입 후 2 주 이내에 카테터 표면에 형성되고 몇 주 후에 카테터의 내강에 형성된다고보고되었습니다10,11.
의료용 카테터에 형성된 칸디다 알비칸스(C. albicans) 생물막은 효모, 기질 및 균사체12,13으로 구성된 이중층 네트워크를 나타냅니다. C. albicans biofilms의 대형은 약물 내성 및 면역 회피13의 열쇠일 뿐만 아니라 더 많은 혈액 감염 2,12로 이어지고 더 심각하고 심지어 생명을 위협하는 결과를 초래하는 확산된 포자를 생성하는 데 필수적입니다. C. albicans-associated CRI는 임상적 진균 혈류 감염의 주요 원인이며7,14, 중심 정맥 카테터에 C. albicans 감염 환자의 40% 이상이 균혈증으로 발전한다15.
미국 전염병 학회(Infectious Disease Society of America)에 따르면, 칸디다 CRI의 권장 치료법은 다음과 같습니다: (1) 감염된 카테터 제거; (2) 환자에게 14일간의 전신 항진균 요법실시 8; (3) 새로운 카테터 재이식4. 그러나 임상 적용에서는 카테터를 완전히 제거할 수 없는 경우가 있습니다. 일부 환자는 전신 항생제와 항균 잠금 요법으로만 치료할 수 있으며, 강한 부작용이 동반된다16,17.
구인두 칸디다증 모델, 질 칸디다증 모델 및 칸디다증에 의한 침습성 전신 감염 모델과 같은 C. albicans의 기존 동물 모델은 임상 CRI와 잘 상관될 수 없습니다18,19. 따라서 본 연구에서는 마우스에서 C. albicans 관련 CRI 모델을 확립했습니다. 임상적으로 일반적으로 사용되는 폴리에틸렌 카테터를 피하 임플란트로 사용하였고20,21 C. albicans를 피부 표면에 접종하여 C. albicans가 의료용 카테터에 부착되고 생물막이 형성되는 것을 시뮬레이션하였다.
이 모델은 다양한 치료제의 항생물막 효과를 스크리닝하기 위해 우리 실험실에서 성공적으로 사용되었습니다22. 또한, 카테터 감염 후 C. 알비칸의 지연 검출로 인해, 이식된 카테터에서 C. 알비칸의 콜로니 및 생물막의 직관적인 관찰을 용이하게 하기 위해 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 함유하는 C. 알비칸스 균주를 구축하고 마우스에 접종했습니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 Mactutrius turbidibris</td><td>Shanghai Lujing Technology Co., Ltd</td><td>5106063</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 글루타르알데히드 고정액</td><td>Xingzhi Biotechnology Co., Ltd</td><td>DF015</td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C 냉장고</td><td>Electrolux (China) Electric Co., Ltd</td><td>ESE6539TA</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd</td><td>01-023</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Shimadzu</td><td>ATX124</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 살균기</td><td>SANYO</td><td>MLS-3750</td><td></td></tr><tr><td>부탄올</td><td>Tianjin Chemio 시약 Co., Ltd</td><td>200-889-7</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Amresco</td><td>C0885</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ci Nikon 수직 광학 현미경&nbsp;</td><td>니콘</td><td>이클립스 Ts2-FL</td><td></td></tr><tr><td>글루코스</td><td>맥클린&nbsp;</td><td></td><td></td>D823520</tr><tr><td>접종 링</td><td>Thermo Scientific</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD</td><td>20210103</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td></td></tr><tr><td>PAS 염료 키트</td><td>Servicebio</td><td>G1285</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd</td><td>01-001</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 카테터</td><td>빛나는 플라스틱 쇼핑몰</td><td>PE100</td><td></td></tr><tr><td>RWD R550 멀티 채널 소동물 마취기&nbsp;</td><td>RWD</td><td>R550</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Hitachi</td><td>TM-1000</td><td></td></tr><tr><td>온도 인큐베이터</td><td>Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd</td><td>ZQTY-50N</td><td></td></tr><tr><td>초순수 발생기</td><td>Heal Force</td><td>NW20VF</td><td></td></tr><tr><td>초음파 기계</td><td>Do-Chrom</td><td>DS10260D</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sinopharm&nbsp; 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10023428</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Thermo Scientific&nbsp; 옥소이드</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 카테터 관련 칸디다 알비칸스 감염 모델

A Catheter-Related Candida albicans Infection Model in Mouse

카테터 관련 감염(CRI)은 카테터 이식 중 칸디다 알비칸스에 의해 발생하는 흔한 병원 내 감염입니다. 일반적으로 생물막은 카테터의 외부 표면에 형성되어 환자에게 치명적인 파종성 감염을 유발합니다. 클리닉에는 효과적인 예방 및 치료 관리가 없습니다. 따라서 CRI의 예방 및 치료를 위한 새로운 전략의 전임상 스크리닝을 위한 CRI의 동물 모델을 확립하는 것이 시급합니다. 본 연구에서는 널리 사용되는 의료용 카테터인 폴리에틸렌 카테터를 제모 후 BALB/c 마우스의 등에 삽입하였다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 이후 강화된 녹색 형광 단백질을 발현하는 ATCC MYA-2876(SC5314)을 카테터를 따라 피부 표면에 접종했습니다. 강렬한 형광은 3일 후 형광 현미경으로 카테터 표면에서 관찰되었습니다. 성숙하고 두꺼운 생물막은 주사 전자 현미경을 통해 카테터의 표면에서 발견되었습니다. 이러한 결과는 카테터 표면에 칸디다 알비칸스(candida albicans)의 접착력, 집락화 및 생물막 형성을 나타냈습니다. 표피의 증식과 피부 표본의 염증 세포 침투는 CRI 관련 피부의 조직 병리학적 변화를 나타냈다. 요약하자면, 마우스 CRI 모델이 성공적으로 설정되었습니다. 이 모델은 칸디다 알비칸스(candida albicans)와 관련된 CRI에 대한 치료 관리의 연구 및 개발에 도움이 될 것으로 기대된다.

카테터의 C. 알비칸과 생물막은 SEM에 의해 관찰될 수 있습니다. 도 322에 나타낸 바와 같이, 카테터 그룹 내의 폴리에틸렌 카테터의 표면은 매끄러웠고, 부착된 병원성 미생물은 관찰되지 않았다. 그러나, 성숙하고 조밀한 C. 알비칸스 생물막은 모델 그룹의 폴리에틸렌 카테터 표면에서 볼 수 있었으며, 이는 C. 알비칸스가 실험 조건 하에서 마우스의 카테터 표면에 생물막을 성공적으로 식민지화하고 형성할 수 있음을 나타냅니다. 또한, 형광 현미경 검사 결과는 위의 결론을 추가로 입증했습니다(그림 4)22. 카테터 그룹의 폴리에틸렌 카테터 표면에는 뚜렷한 형광이 없었습니다. 그러나 부착된 C. albicans 세포에서 방출되는 강한 형광은 모델 그룹의 카테터 표면에서 볼 수 있었습니다. 이는 많은 수의 C. 알비칸스 세포가 카테터의 표면에 부착되었음을 나타냈으며, 이는 마우스에서 C. 알비칸스 생물막 관련 CRI 모델의 성공적인 구축을 입증했습니다.
마우스 피부 조직의 감염을 보다 직관적으로 검증하기 위해 Sheff Periodate 염색 분석을 수행했습니다. 임상 연구에서 일반적으로 사용되는 곰팡이 세포의 탄수화물을 검출합니다(그림 5)22. 정상 대조군 및 카테터 그룹의 피부 조직은 주기적 산-쉬프(PAS)에 의해 음성으로 염색되었으며, 이는 조직에 C. 알비칸스 세포가 없음을 나타냅니다. 모델 그룹에서 소수의 양성 PAS 염색 C. albicans 세포가 관찰되어 C. albicans 관련 침입 및 접착의 성공적인 시뮬레이션을 추가로 검증했습니다.
다음으로, C. albicans 에 의해 유도된 마우스 피부 조직의 병리학적 변화를 조직병리학적 분석에 의해 평가하였다. 도 622에 나타난 바와 같이, 표피층은 상당히 두꺼워졌고 모델군에서 피부의 안쪽 부분까지 확장되었다. 염증 침투도 관찰되었는데, 이는 C. albicans의 감염이 쥐 피부 조직에 명백한 병리학적 변화를 일으켰음을 나타냅니다. 표피층, 진피층, 피지선, 모낭 및 기타 구조가 카테터 그룹에서 깨끗하고 완전했습니다. 부종과 염증 침윤은 관찰되지 않았으며, 이는 정상 대조군과 유사했다. 이러한 결과는 카테터를 삽입하는 것만으로는 피부 조직에 뚜렷한 변화가 일어나지 않는다는 것을 보여주었습니다. 모델 그룹의 조직의 병리학적 변화는 C. albicans에 의한 감염의 결과였습니다. 요약하면, 결과는 C. albicans 생물막과 관련된 CRI 마우스 모델의 성공적인 확립을 검증합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65307/65307fig01.jpg"> 그림 1: pCaExp plasmid atlas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65307/65307fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65307/65307fig02.jpg"> 그림 2: C.albicans 관련 CRI 마우스 모델의 절차를 보여주는 회로도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65307/65307fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65307/65307fig03.jpg"> 그림 3: 각 그룹의 카테터 표면의 SEM. (A) 카테터 그룹; (B) 모델 그룹(1000×, 축척 막대 = 50μm, 5000×, 축척 막대 = 10μm). 이 그림은 Mo et al.22의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65307/65307fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65307/65307fig04.jpg"> 그림 4: 각 그룹의 카테터 표면 형광 현미경. (A) 카테터 그룹; (B) 모델 그룹(스케일 바 = 100μm). 이 그림은 Mo et al.22의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65307/65307fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65307/65307fig05.jpg"> 그림 5: 각 그룹에서 쥐의 뒷 피부에 대한 H&amp;E 염색. (A) 카테터 그룹; (B) 모델 그룹; (C) 대조군, (40x, 스케일 바 = 400μm, 100x, 스케일 바 = 200μm). 이 그림은 Mo et al.22의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65307/65307fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65307/65307fig06.jpg"> 그림 6: 각 그룹에서 쥐의 등 피부의 PAS 염색. (A) 카테터 그룹; (B) 모델 그룹; (C) 대조군, (40x, 스케일 바 = 400μm, 100x, 스케일 바 = 200μm). 표피층이 피부 안쪽으로 크게 두꺼워지고 확장되는 것을 모델 그룹(빨간색 직사각형)에서 볼 수 있습니다. 이 그림은 Mo et al.22의 허가를 받아 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65307/65307fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 카테터에 생물막이 형성되고 C.albicans와 숙주 간의 상호 작용이 임상 CRI와 잘 상관되는 C.albicans 관련 카테터 관련 감염(CRI)의 마우스 모델을 확립합니다. 이 모델은 C.albicans 생물막 관련 CRI에 대한 치료법을 스크리닝하여 임상 혁신을 위한 토대를 마련하는 데 도움이 됩니다.

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed ...

우리의 연구는 카테터에 생물막이 형성되는 칸디다 알비칸스 관련 카테터 관련 감염의 마우스 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다. 이 모델은 임상 CRI 및 칸디다 알비칸스와 숙주 간의 상호 작용과 상관 관계를 파악하는 데 유용합니다. 구인두 칸디다증 모델, 질 칸디다증 모델, 칸디다증에 의한 침습성 전신 감염 모델과 같은 칸디다 알비칸스의 기존 동물 모델은 임상 CRI와 잘 상관되지 않습니다.카테터 감염에서 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 검출을 개선하기 위해, 당사의 프로토콜은 강화된 녹색 플루오레세인 단백질로 염색을 사용했습니다. 이를 통해 생쥐의 카테터에 있는 칸디다 알비칸스 콜로니와 생물막을 명확하게 시각화하고 적시에 검출할 수 있었습니다.

a-catheter-related-candida-albicans-infection-model-in-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

의 실험 마우스 모델에서 질 접종 및 샘플 수집을위한 프로토콜 칸디다 질염

출처: Conover, M. S. 외, J. 쥐 모델에서 요로감염 및 CAUTI의 확립 및 특성화. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 암컷 쥐에 경요도 카테터를 조립하고 이식한 후 박테리아 접종을 통해 카테터 관련 요로 감염을 확립하고 바이오필름 매개 숙주-병원체 상호작용을 조사하는 절차를 시연합니다.

마우스 모델에서의 카테터 관련 요로 감염

이 비디오는 피하 조직에서 칸디다 알비칸스의 생물막 형성을 연구하기 위한 생체 내 마우스 모델의 개발을 보여줍니다. 이 실험은 생물막 발달을 위해 동물의 등 부위에 칸디다균에 감염된 장치를 이식하는 것을 포함합니다.

칸디다 알비칸스 In Vivo 마우스 모델의 생물막 형성

마우스 피하 모델에서 칸디다 알비칸스 생물막 발달의 실험적 절차를 제시합니다. 진균 생물막은 군집 형성 단위의 수를 결정하고 생성되는 빛의 양이 생존 가능한 세포의 수와 일치하는 비침습적 생물 발광 이미징에 의해 정량화되었습니다.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

갤러리아 mellonella 전파 칸디 다에 대 한 무척 추 동물 모델 역할을 합니다. 여기, 우리는 감염 세부 프로토콜 및 모델의 효과 대 한 지원 데이터를 제공.

갤러리아 mellonella Waxworm 감염 모델 전파 칸디 다에 대 한

이 프로토콜의 목적은 포유류 위장관에서 칸디다 알비칸스 세포 모양 및 국소화를 시각화하는 것입니다.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

여기에서, 우리는 독특하게 디자인된 온난화/억제 장치를 사용하여 설치류 꼬리 정맥 주사를 위한 효과적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 혈관 확장 및 억제 과정의 개시를 간소화함으로써,이 프로토콜은 최소한의 고통을 가진 동물의 큰 그룹의 정확하고 적시에 정맥 주사를 허용합니다.

뮤린 곰팡이 패혈증 모델에서 효율적인 꼬리 정맥 주사를위한 현대 온난화 / 억제 장치

위험한 병원체에 의한 보철 관절 주위 감염(PJI)은 임상 정형외과에서 흔합니다. 기존의 동물 모델로는 PJI의 실제 상황을 정확하게 시뮬레이션할 수 없습니다. 여기에서 우리는 PJI에 대한 새로운 치료제를 연구하고 개발하기 위해 Candida albicans 생물막 관련 PJI 마우스 모델을 구축했습니다.

마우스의 보철 관절 Candida albicans 감염 모델

이 프로토콜은 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 항균 광역학 요법(aPDT)의 적용을 설명합니다. aPDT는 커큐미노이드와 청색 LED 조명의 수용성 혼합물을 사용하여 수행되었습니다.

구강 칸디다증의 쥐 모델에 대한 커큐미노이드 매개 항균 광역학 요법

우리는 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한 방법을...

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

학습하세요 마우스를 이용한 Candida albicans 카테터 관련 감염 모델 구축 방법을. 형광 단백질을 활용한 바이오필름 시각화 기술로 임상 상황과의 상관관계를 분석하고 신규 치료제 개발에 활용할 수 있습니다.

마우스의 카테터 관련 칸디다 알비칸스 감염 모델

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