Name: 희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 배우세요 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 활용한 희소 세포 집단의 3D 염색질 구조 분석 방법. 이 기술은 유전자 발현 조절 메커니즘과 질병 관련 비암호화 돌연변이 연구에 활용됩니다.

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원고에 대한 피드백을 주신 Javierre 연구실의 나머지 구성원들에게 감사드립니다. 제도적 지원을 해주신 CERCA 프로그램, Generalitat de Catalunya 및 Josep Carreras Foundation에 감사드립니다. 이 연구는 FEDER/스페인 과학혁신부(RTI2018-094788-A-I00), 유럽 혈액학 협회(4823998) 및 스페인 암 퇴치 협회(AECC) LABAE21981JAVI의 자금 지원을 받았습니다. BMJ는 La Caixa Banking Foundation Junior Leader 프로젝트(LCF/BQ/PI19/11690001)에서 자금을 지원하고, LR은 AGAUR FI 펠로우십(2019FI-B00017)에서 자금을 지원하며, LT-D는 FPI Fellowship(PRE2019-088005)에서 자금을 지원합니다. Universitat Autònoma de Barcelona의 생화학 및 분자 생물학 박사 과정의 지원에 감사드립니다. 자금 제공자 중 누구도 실험 설계나 원고 작성의 어느 시점에도 관여하지 않았습니다.

희소한 세포에서 프로모터 상호작용체를 연구하기 위한 포괄적인 접근법

저자는 공개 할 것이 없습니다.

liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 프레임워크를 사용하지만 세포 수가 크게 감소한 고분해능 프로모터 상호작용체 라이브러리를 생성할 수 있는 기능을 제공합니다. 이것은 페놀 정제 및 비오틴 제거와 같은 불필요한 단계를 제거함으로써 크게 달성됩니다. 고전적인 핵 내 결찰 Hi-C 프로토콜57 및 후속 파생 기술인 PCHi-C에서, 비오틴은 나중에 정보가 없는 DNA 단편을 끌어내리는 것을 피하기 위해 비결찰 제한 단편에서 제거됩니다. 이 부분과 후속 DNA 정제를 건너뛰어도 DNA 정제와 같은 잠재적인 DNA 소모 단계를 차단하면서 유효한 판독 비율이 크게 감소하지 않습니다(그림 3A). 초음파 처리 후 Hi-C 라이브러리 준비의 재구성은 정제 단계 자체로 양면 선택을 사용하여 또 다른 불필요한 정제를 건너 뛸 수 있습니다. 이 모든 것이 최소한의 튜브 변경을 사용하여 전체 프로토콜의 성능을 향상시키고, 반응 부피의 감소, 시약 ...

시간적 유전자 발현은 세포 분화와 궁극적으로 유기체 발달을 유도하며, 그 변화는 광범위한 질병 1,2,3,4,5와 밀접한 관련이 있습니다. 유전자 전사는 조절 요소의 작용에 의해 미세하게 조절되며, 이는 근위부(즉, 유전자 프로모터) 및 원위부(예: 인핸서 또는 소음기)로 분류될 수 있으며, 후자는 종종 표적 유전자로부터 멀리 떨어져 있고 유전자 발현을 조절하기 위해 염색질 루핑을 통해 물리적으로 상호작용합니다 6,7,8.
게놈에서 원위 조절 영역의 식별은 널리 합의된 문제인데, 이 영역은 특정 히스톤 변형 9,10,11을 포함하고 특정 전사 인자 인식 모티프를 포함하여 이들에 대한 모집 플랫폼 역할을 하기 때문입니다(12,13,14). 게다가, 인핸서(enhancers)와 수퍼-인핸서(super-enhancer)15,16의 경우, 이들은 또한 낮은 뉴클레오솜 점유(low-nucleosome occupancy)17,18를 가지며, 비-코딩 eRNAs(non-coding eRNA)로 전사된다(19,20).
그럼에도 불구하고 각 원위 조절 요소의 표적 유전자는 예측하기가 더 어렵습니다. 종종 원위 조절 요소와 표적 사이의 상호 작용은 세포 유형 및 자극 특이적이며21,22, 수백 킬로베이스에 걸쳐 있으며, 어떤 방향으로든 다른 유전자를 연결하고23,24,25 표적 유전자 또는 다른 비개입 유전자의 인트로닉 영역 내부에 위치할 수도 있습니다26,27. 또한, 원위 조절 요소는 동시에 하나 이상의 유전자를 제어 할 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다28,29. 이러한 위치 복잡성은 이들 사이의 조절 연관성을 정확히 찾아내는 것을 방해하므로 모든 세포 유형에서 각 조절 요소의 표적 대부분은 알려지지 않은 상태로 남아 있습니다.
최근 몇 년 동안 염색질 상호작용을 연구하기 위한 염색체 형태 포획(3C) 기술의 개발이 크게 붐을 일으켰습니다. 그 중 가장 널리 사용되는 Hi-C는 세포 게놈30의 모든 단편 사이의 모든 상호 작용에 대한 지도를 생성할 수 있습니다. 그러나 제한 단편 수준에서 중요한 상호 작용을 감지하기 위해 Hi-C는 초심층 시퀀싱에 의존하여 개별 유전자의 조절 환경을 일상적으로 연구하는 데 사용하는 것을 금지합니다. 이러한 경제적 한계를 극복하기 위해 ChIA-PET31, HiChIP 32 및 저투입 대응 HiCuT 33과 같은 여러 농축 기반3C 기술이 등장했습니다. 이러한 기술은 특정 단백질에 의해 매개되는 게놈 차원의 상호작용을 풍부하게 하기 위한 항체의 사용에 의존한다. 그럼에도 불구하고 이러한 3C 기술의 고유한 기능은 응용 프로그램의 골칫거리이기도 합니다. 사용자는 관심 단백질에 대한 고품질 항체의 가용성에 의존하며 단백질의 결합이 동적인 조건을 비교할 수 없습니다.
프로모터 캡쳐 Hi-C(PCHi-C)는 이러한 제한(34,35)을 우회하는 또 다른 농축 기반3C 기술이다. PCHi-C는 비오티닐화 RNA 프로브 농축 시스템을 사용하여 28,650개의 인간 또는 27,595개의 마우스 주석이 달린 유전자 프로모터(프로모터 상호작용이라고도 함)와 상호 작용하는 게놈 영역의 게놈 전체 고해상도 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 이 접근법을 사용하면 활성 및 비활성 프로모터 모두의 제한 단편 수준 분해능에서 중요한 장거리 상호작용을 검출할 수 있으며, 히스톤 변형 또는 단백질 결합의 역학과 독립적으로 모든 조건 간의 프로모터 상호작용을 강력하게 비교할 수 있습니다. PCHi-C는 세포 분화 동안 프로모터 상호작용체 재구성을 확인하고(36,37), 전사 인자(38,39)의 작용 메커니즘을 확인하고, 비암호화 변이체(40,41,42,43,44,45)에 의해 질병에서 조절되지 않는 새로운 잠재적 유전자 및 경로를 발견하기 위해 최근 몇 년 동안 널리 사용되어 왔다.46,47,48, 새로운 드라이버 비암호화 돌연변이49,50과 함께. 게다가, 단지 포획 시스템을 수정함으로써, 이 기술은 임의의 상호작용체(예를 들어, 인핸서 상호작용체(51) 또는 비-코딩 변경들의 집합체의 상호작용체(41, 52))를 조사하기 위해 생물학적 질문에 따라 맞춤화될 수 있다.
그러나 PCHi-C는 이 기술을 수행하기 위해 최소 2천만 개의 세포에 의존하므로 발달 생물학 및 임상 응용 분야에서 자주 사용되는 것과 같은 희소한 세포 집단에 대한 연구를 방해합니다. 이러한 이유로 우리는 낮은 셀 입력으로 고분해능 프로모터 상호 작용을 생성하기 위해 PCHi-C의 실험적 프레임워크를 기반으로 하는 새로운 비용 효율적이고 사용자 정의 가능한 방법인 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 개발했습니다. 최소한의 튜브 변경으로 실험을 수행하고, 원래의 PCHi-C 프로토콜에서 단계를 바꾸거나 제거하고, 반응 부피를 대폭 줄이고, 시약 농도를 수정함으로써 라이브러리 복잡성이 극대화되고 50,000개 이상의 세포로 고품질 라이브러리를 생성할 수 있습니다53.
낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)는 PCHi-C에 대해 벤치마킹되었으며 인간 조혈 세포 분화 동안 프로모터 상호작용 재배선을 밝히고, 비코딩 변경에 의해 조절되지 않는 잠재적인 새로운 질병 관련 유전자 및 경로를 발견하고, 염색체 이상을 감지하는 데 사용됩니다53. 단계별 프로토콜과 기술을 통한 다양한 품질 관리는 라이브러리의 최종 생성 및 계산 분석까지 여기에 자세히 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>원고에서 제한 버퍼 2로 참조</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA 리가제 반응 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>16% 포름알데히드 용액(w/v), 메탄올 프리</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>20 mg/mL 소 혈청 알부민</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock Gel Light tubes</td><td>Qiuantabio</td><td>2302820</td><td> 섹션 4(DNA 정제)의 페놀-클로로포름 정제용. Phase Lock Gel 튜브는 페놀-클로로포름 정제 후 DNA 회수를 극대화하는 동시에 유기상과 수성 상 사이에 침전되어 분리되는 중간 밀도의 수지를 포함함으로써 유기상에서 오염 물질의 이월을 방지하도록 특별히 설계된 상용 유형의 튜브입니다. PLG 튜브는 레진이 튜브 바닥에 잘 배치되도록 사용하기 전에 12,000 x g에서 30초 동안 회전해야 합니다</td></tr>. <tr><td>라이브러리 증폭을 위한 어댑터 및 PCR 프라이머</td><td>통합 DNA 기술</td><td>-</td>NGS 세포 스크래퍼<td>용 PAGE 정제와 함께 개별 프라이머로 구입</td></tr><tr><td></td><td>Nunc</td><td>179693</td><td>또는 기타 브랜드</td></tr>의 <tr><td>원심분리기(1.5mL 튜브용 고정각 로터)</td><td>모든 브랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHiCAGO R 패키지</td><td>1.14.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CleanNGS beads</td><td>CleanNA</td><td>CNGS-0050</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Promega</td><td>U120A, U121A, U122A, U123A</td><td>또는 기타 브랜드</td></tr>의 <tr><td>DNA LoBind tube, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tube, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>for biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads</td><td>Invitrogen</td><td>65602</td><td>섹션 11의 포획 후 라이브러리의 비오틴 풀다운(비오틴 풀다운 및 PCR 증폭)</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>또는 1.5ml tubeL</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr> FBS에 적합한 기타 자석<tr><td>, 적격</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>또는 기타 브랜드</td></tr>의 <tr><td>Glycine</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant</td><td>Invitrogen</td><td>AM9515</td><td>섹션 4 (DNA 정제)에서 DNA 공침전에 사용됨</td></tr><tr><td>HiCUP</td><td>0.8.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 U/&micro; L</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104T</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Klenow EXO- 5000 units/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>저보유 필터 팁&nbsp;( 10 & 마이크로; L, 20 &마이크로; L, 200 &마이크로; L 및 1000 & 마이크로; L)</td> <td>ZeroTip</td><td>PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000</td><td></td></tr><tr><td>M220 초점 초음파기</td><td>Covaris</td><td>500295</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA 섬유 프리 슬릿 스냅 캡 6 x 16 mm 바이알</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td> 섹션 6의 초음파 처리 (초음파 처리)</td></tr> <tr><td>NheI-HF, 100 U/&micro; L</td><td>New England Biolabs</td><td>R3131M</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제-프리 분자 생물학 등급 물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>PCR 프라이머 품질 관리</td><td>통합 DNA 기술</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PCR 스트립&nbsp; 그리고 캡</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022, 401425</td><td></td></tr><tr><td>Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; HF 완충액이 있는 High-Fidelity PCR 마스터 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531L</td><td>섹션 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11(비오틴 풀다운 및 PCR 증폭)</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일(EDTA 무함유)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, 재조합, PCR grade</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA 고감도 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q33230</td><td>섹션 4 (DNA 정제)에서 침전 후 DNA 정량화용</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>rCutsmart buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>또는 다른 브랜드</td></tr><tr><td>의 SDS - 분자 생물학을 위한 솔루션 10%</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0676</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 pH 5.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect 맞춤형 3-5.9 Mb 라이브러리</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td> 캡처 SureSelect Target Enrichment Box 1<td>에 사용되는 맞춤형 설계 마우스 또는 인간 캡처 시스템</td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-8645</td><td>capture</td></tr><tr><td>SureSelect Target Enrichment Kit에 사용됨 ILM PE 전체 어댑터</td><td>Agilent Technologies</td><td>931107</td><td> 캡처</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase 1 U/&micro; L</td><td>Invitrogen</td><td>15224025</td><td>섹션 3의 결찰(결찰 및 decrosslink)</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 2000000/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>섹션 9의 결찰(dATP-tailing, 어댑터 결찰 및 PCR 증폭)</td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소 3000 units/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 units/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4200 기기</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td> 섹션 9(dATP-tailing, adapter ligation 및 PCR 증폭)의 자동 전기영동및 섹션 11(비오틴 풀다운 및 PCR 증폭). 다른 모든 자동 전기영동 시스템은 유효합니다</td></tr><tr><td>Tapestation 시약</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,</td><td> for automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). 분자 생물학에 대한 다른 모든 자동 전기 영동 시스템은 유효합니다</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우an integrated workflow to study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in scarce cell populations

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

시공간 유전자 전사는 전사를 제어하기 위해 표적 유전자 프로모터와의 물리적 근접성에 의존하는 인핸서 및 소음기와 같은 원위 조절 요소에 의해 엄격하게 조절됩니다. 이러한 조절 요소는 식별하기 쉽지만 대부분이 세포 유형에 특이적이며 선형 게놈 서열에서 수백 킬로베이스로 분리되어 다른 비표적 유전자를 건너뛰기 때문에 표적 유전자를 예측하기 어렵습니다. 수년 동안 Promoter Capture Hi-C(PCHi-C)는 원위 조절 요소를 표적 유전자에 결합시키는 데 있어 황금 표준이었습니다. 그러나 PCHi-C는 수백만 개의 세포 가용성에 의존하여 일차 조직에서 일반적으로 얻은 것과 같은 희귀 세포 집단에 대한 연구를 금지합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 게놈의 각 유전자를 제어하는 원위 조절 요소의 레퍼토리를 식별하는 비용 효율적이고 맞춤형 방법인 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)가 개발되었습니다. liCHi-C는 PCHi-C와 유사한 실험 및 계산 프레임워크에 의존하지만 최소한의 튜브 변경을 사용하고 시약 농도 및 부피를 수정하고 단계를 바꾸거나 제거함으로써 라이브러리 구성 중 재료 손실을 최소화합니다. 총체적으로, liCHi-C는 발달 생물학 및 세포 기능의 맥락에서 유전자 조절 및 시공간 게놈 조직의 연구를 가능하게 합니다.

liCHi-C는 50,000 개의 세포로 고품질의 게놈 전체 프로모터 상호 작용체 라이브러리를 생성 할 수있는 가능성을 제공합니다53. 이는 반응 부피의 급격한 감소와 프로토콜 전반에 걸쳐 DNA 저결합 플라스틱 용기의 사용 외에도 상당한 재료 손실이 발생하는 원래 프로토콜에서 불필요한 단계를 제거함으로써 달성됩니다. 여기에는 탈가교 후 페놀 정제, 비오틴 제거, 후속 페놀-클로로포름 정제 및 에탄올 침전이 포함됩니다. 그 외에도 Hi-C 라이브러리 준비 단계(비오틴 풀다운, A-테일링, 어댑터 결찰, PCR 증폭 및 양면 상자성 비드 선택 - PCR 산물 정제이기도 함)를 재구성하면 또 다른 불필요한 DNA 정제 단계를 제거할 수 있습니다. 실험 워크플로의 개요는 그림 1A에서 찾을 수 있습니다.
라이브러리 품질을 평가하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 여러 제어가 수행되며, 그 중 첫...

유전자 발현은 유전자 프로모터와 원위 조절 요소의 상호작용에 의해 조절된다. 여기서는 낮은 입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 통해 이전에는 측정할 수 없었던 희귀 세포 유형에서 이러한 상호 작용을 식별할 수 있는 방법을 설명합니다.

희소한 세포 집단에서 프로모터 중심의 시공간 게놈 구조를 연구하기 위한 통합 워크플로우An Integrated Workflow to Study the promoter-centic spatio-temporal genome architecture in Scarce Cell Populations

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

liCHi-C를 사용하여 우리가 대답하려는 주요 질문은 염색질이 핵에서 어떻게 상호 작용하는지, 따라서 유전자 조절의 새로운 층을 이해하는 것입니다. 우리는 liCHi-C를 사용하여 주어진 샘플의 게놈 조직을 탐색하고, 질병과 관련된 비암호화 돌연변이를 영향을 받는 잠재적 유전자와 연결하고, 예를 들어 종양 샘플에서 전위와 같은 염색체 재배열을 감지할 수 있음을 입증했습니다. 이제 우리는 일차 줄기 세포 또는 관련 임상 샘플과 같은 반흔 세포 유형의 3D 염색질 조직을 탐색할 수 있습니다.우리의 프로토콜은 제한 단편 분해능에서 게놈 조직을 탐색하기 위해 양질의 데이터를 얻는 데 필요한 입력 자료와 시간 및 비용을 줄입니다. liCHi-C는 3D 염색질 조직 분야의 범위를 확장하여 이전에는 분석이 불가능했던 새로운 세포 유형을 탐색할 수 있게 되었습니다. liCHi-C 덕분에 과학계는 유전자 발현의 특별한 조절을 탐구 할 수 있습니다.예를 들어, 악성 형질전환에서는 종양 내부의 특정 클론 하위 집단에서만 발생합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

강화, 같은 DNA 규제 요소, 물리적으로 대상 유전자 발기인, 큰 게놈 거리에 걸친 장거리 염색체 상호 작용을 통해 자주 연락 하 여 유전자 발현을 제어 합니다. 발기인 캡처 안녕-C (PCHi-C) 그들의 표적 유전자를 잠재적인 규제 시퀀스의 지정을 활성화 발기인 및 원심 지역 사이 중요 한 상호 작용을 식별 합니다.

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

우리는 배아 줄기 세포에서 생성된 배아 체에서 높은 처리량 시퀀싱에 이어 정량적 염색체 형성 캡처의 적용을 보고합니다. 이 기술은 배아 줄기 세포 분화 동안 주어진 유전자의 putative 강화제와 프로모터 영역 사이의 접촉을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

본 프로토콜은 재사용 가능한 단일 세포를 사용하여 반복적인 후성유전체 분석을 위한 단일 세포 방법을 설명합니다. 재사용 가능한 단일 세포를 통해 동일한 단일 세포에서 여러 후성유전학적 마크를 분석하고 결과를 통계적으로 검증할 수 있습니다.

반복적인 후성유전체학 분석을 위한 재사용 가능한 단일 세포

생물학자가 브라우저 기반 도구만을 사용하여 조직 특이적 유전자 증강제를 식별할 수 있도록 코딩 없는 워크플로우를 제시합니다. 당사의 프로토콜은 공개 H3K4me1/H3K27ac 히스톤 마크 및 Hi-C 데이터를 활용하여 프로그래밍 전문 지식이 없는 연구자가 관심 유전자와 관련된 잠재적 조절 요소에 액세스, 분석 및 식별할 수 있도록 합니다.

유전자 및 조직 특이적 인핸서를 선택하기 위한 웹 기반 워크플로우

이 프로토콜은 초기 인핸서 전사체를 정량화하기 위한 간소화된 계산 파이프라인을 제공합니다. 염색질 접근성, 염색질 특징 및 전사 데이터를 통합함으로써 복잡한 유전자 내 영역에서 인핸서 활성에 대한 정확한 검출 및 가닥 특이적 분석을 가능하게 하는 동시에 광범위한 생물정보학 교육 없이도 연구자가 접근할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

멀티 플렉스 RT-qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현은 희귀 림프 인구의 이질성의 특성을

배우세요 저입력 Capture Hi-C(liCHi-C)를 활용한 희소 세포 집단의 3D 염색질 구조 분석 방법. 이 기술은 유전자 발현 조절 메커니즘과 질병 관련 비암호화 돌연변이 연구에 활용됩니다.

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