Name: 새로운 냉각 셀 프로세서 시스템이 Islet Cell Isolation Facility에 미치는 영향 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 학습하세요 냉각 셀 프로세서 시스템을 이용한 인간 단핵 세포 분리 및 정제 방법. 이 기술은 GMP 클린룸 환경에서 세포 생존율을 유지하며 효율적인 세포 회수를 가능하게 합니다.

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저자는 당뇨병에 대한 유럽 게놈 연구소(ANR-10- LABEX-0046 to FP)와 카타르 대사 연구소(카타르의 하마드 의료 기업)에 감사를 표합니다. 저자들은 논문 처리 비용 지원에 대해 Hamad Medical Corporation의 의료 연구 센터에도 감사를 표합니다.

본 프로토콜에서는 기관의 폐기 가이드라인에 따라 사용이도 불가능하여 폐기된 전혈을 사용하였습니다. IRB 승인 및 고지된 동의는 해당 사항이 없습니다.
1. 냉각 세포 처리기 설정
참고: 모든 절차는 클린룸 환경에서 수행되어야 하며, 직원은 클린룸 복장 규정을 준수해야 합니다.
<ol>
	<li>장비 구매
	<ol>
		<li>여분 plexiglass 덮개를 구매하십시오. 냉각 장비 시스템, 기계식 냉각 가스 스트림 온도 제어기가 포함된 쿨러, 공기 건조기, 압력 및 유량 조절기, 그리고 보증 서비스(선택 사항)를 구매하십시오. 다음을 참조하십시오. 재료 목록 참고 문헌용. 
		참고: 총 비용은 배송비 및 통관 비용을 제외하고 $16,13입니다.</li>
		<li>지역 의료용 가스 공급업체로부터 표준 등급(유럽 약전 참조 1238)을 준수하는 압축 의료용 가스인 의료용 건조 공기를 주문하십시오. 6.8 m³ 실린더 2개를 구매하십시오.3 (47 L: 23 cm x 153 cm; 직경 x 길이).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>장비 설정 (그림 1 및 그림 2)
	<ol>
		<li>GMP 클린룸 내로 장비를 반입하십시오(GMP 절차에 따라 클린룸 진입 전 소독을 수행하십시오).</li>
		<li>의료용 압축 공기의 경우, 가스 실린더를 클린룸 내에 직접 배치하는 대신 가스 라인을 설치하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>냉각을 위한 세포 처리기 개조
	<ol>
		<li>먼저 플렉시글라스 커버를 제거하십시오. 보증 관련 문제가 발생할 수 있으므로 기존의 플렉시글라스 커버는 보관해 두십시오. 원심분리기 커버의 균열을 방지하기 위해 냉각 장치 노즐 팁의 외경과 일치하여 적합한 직경(13.3mm 권장)으로 세포 처리기의 예비 뚜껑에 구멍을 뚫으십시오.</li>
		<li>원형 폼 조각을 사용하여 브래킷을 함께 고정합니다. 이는 덮개의 파손 및/또는 긁힘을 방지하고, 세포 처리기 상단에 쿨러 노즐을 고정하며, 주입된 공기의 높은 압력으로 인해 덮개가 과도하게 휘어지는 것을 방지하고, 노즐의 무게를 지탱하며, 마지막으로 실험 절차 동안 운영자가 필요한 모든 세포 처리기 기능에 자유롭고 안전하게 접근할 수 있도록 하여 운영자의 안전을 최대화하기 위한 것입니다.</li>
		<li>냉각 노즐을 플렉시글라스의 구멍에 연결하여 냉각 시스템을 세포 프로세서에 연결하십시오. 브래킷과 폼 쿠션을 사용하여 이를 고정하십시오.</li>
		<li>냉각 하우징을 노즐에서 최대 8피트(2.4m) 거리 내에 배치하십시오. 온도 조절기는 별도의 캐비닛에 수납하고, 냉각 하우징으로부터 6피트(1.83m) 이내에 배치하십시오.</li>
		<li>냉각기의 설정 온도를 -로 설정하십시오.40 &#176;C 냉각기의 공기 흐름을 냉각하기 위한 것입니다. 출구 공기 온도는 디지털 표시기에 다음의 분해능으로 계속 표시됩니다. 0.1 &#176;C배출 온도를 디지털 방식으로 설정하십시오. 0.1 &#176;C 온도 조절기를 사용하여.</li>
		<li>압력 및 유량 조절 모듈에서 공기 공급의 압력과 유량을 조절하십시오.그림 2) 냉각기로 공급하기 전에, -로 냉각되는 공기 흐름에서 최적 조건에 도달할 수 있도록 각각 5 psi와 4 SCFM의 유량으로 설정하십시오.30 &#176;C &#177; 2 &#176;C.</li>
		<li>의료용 가스 공급 장치가 5 bar의 출력 압력으로 조절되는지, 그리고 최소 90분 동안 지속 가능한지 확인하십시오. 이는 압축 공기가 -에 도달하는 데 필요합니다.30 &#176;C. 
		&#8203;참고: 의료용 건조 공기는 압축된 의료용 가스이며, 완전히 가압된 건조 공기는 표준 등급을 준수합니다.</li>
		<li>원심분리기 커버에 뚫린 구멍을 통해 세포 처리기 덮개에 연결된 냉각 노즐로부터 5 bar의 압력을 가하십시오. 세포 처리기의 원심분리 보울 내부에 냉각된 의료용 공기를 주입하십시오.그림 2냉각된 공기가 원심분리기 로터의 알루미늄 림에 수직으로 향하도록 공기 주입 위치를 선택하십시오.</li>
		<li>세포 처리기를 준비할 때, 로터가 상온 상태인지 확인하십시오 (18 &#176;C). 냉각 시스템의 자동 온도 조절기를 -로 설정하십시오.30 &#176;C 그리고 로터로 냉각 공기를 직접 분사합니다. 
		참고: 최적의 온도 구배 +를 달성하기 위해 다양한 시험 조건을 테스트하였습니다.4 &#176;C이는 세포 처리기 세포 분리 시스템의 내열성을 극복하고 원심 분리 중 로터의 가열을 방지하기 위해 필요합니다. 프로그래밍된 온도 조절기는 절차 중, 특히 원심 분리 과정 동안 세포 처리기 내부의 최적 목표 온도를 클린룸 온도인 + 로 유지합니다.18 &#176;C.
		<ol>
			<li>셀 프로세서를 첫 번째 예냉 단계로 설정하여 (셀 프로세서 키트 없이) 프로세서를 +로 냉각하십시오.3 &#176;C 30분에서 45분 동안 수행하며, 세포 처리기(cell processor)의 두 번째 사전 냉각 단계에서는 키트를 + 온도에서 사전 냉각해야 합니다.4 &#176;C 134배율에서 g, 5분 동안.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 공기 중 입자 수 측정
<ol>
	<li>운영 단계 중 가열 장치의 영향을 평가하기 위해 ISO 1464-1 표준에 따라 냉각 장치의 GMP 클린룸 환경 준수 여부를 평가하십시오.</li>
	<li>입자 수 모니터링을 통해 정지 상태 및 운전 상태의 중요 관리 지점에서 요구되는 청정도 수준이 달성되었음을 입증하십시오.
	<ol>
		<li>최소 샘플링 지점 수는 측정 면적에 따라 달라집니다. 다음 식을 사용하여 이를 계산하십시오. 
		<img alt="식 1" src="/files/ftp_upload/65321/65321eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		&#8203;여기서 A는 m² 단위의 클린룸 또는 청정 공기 제어 공간의 면적입니다.2그리고 NL은 정수로 올림한 샘플 위치의 수입니다.</li>
		<li>공기 중 샘플링 부피는 각 지점에서의 최소 부피입니다. 공기 부피가 지정된 최대 입자 크기의 입자를 20개 측정할 수 있을 만큼 충분한지 확인하십시오. 다음 식을 통해 공기 중 샘플링 부피를 계산하십시오. 
		V= 20/C x 10 
		여기서 V는 지점당 최소 단일 시료 부피(L 단위)이며, C는 등급 한계(입자 수/m³)이다.3).</li>
		<li>각 지점별로 구역에 따라 하나 이상의 시료를 채취하십시오. 각 지점에서의 최소 채취 부피는 2 L 이상이어야 하며, 최소 채취 시간은 1분 이상이어야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>샘플링 전, 퍼징 필터를 사용하여 입자 계수기를 퍼지하십시오. 필터를 제거한 후, 샘플링을 위해 등속 흡입 프로브와 함께 배치하십시오.</li>
	<li>입자 계수기를 지정된 샘플링 위치에 배치하십시오. 입자 계수기 장치의 메인 화면에서 샘플 수집을 시작하십시오.</li>
	<li>샘플링이 완료되면 파티클 카운터 장치를 다음 위치로 이동시키십시오. 모든 샘플링 지점에 대한 측정이 끝나면 데이터를 검토하고 보고서를 출력하십시오.</li>
	<li>해당 구역 내 모든 샘플링 지점의 평균 입자 농도가 다음의 등급 제한치 미만으로 떨어질 때 표 1해당 실내의 입자 농도가 허용 기준치 이내인 것으로 간주하십시오.</li>
</ol>
3. 밀도 기울기 제작 및 세포 분리 처리
<ol>
	<li>실험 전, 저밀도 및 고밀도 구배 용액과 세포 처리기 키트를 냉장고에서 +4 °C로 하룻밤 동안 사전 냉각한다.</li>
	<li>세포 처리기를 정지 상태로 45분 동안 사전 냉각한다(즉, 사용 전에 세포 처리기의 전원을 켠다). 온도를 +2 °C에서 +5 °C 사이로 유지한다. +4 °C로 사전 냉각된 세포 처리기 키트를 삽입한다.</li>
	<li>표준 에탄올 냉각 이중 자켓 구배 제조기(선택 사항; 그림 3)의 경우, 2개의 유리 챔버를 연결하고 마그네틱 교반기 위에 놓는다. 2개 챔버 사이의 튜브를 클램프로 고정한다. 0 °C의 에탄올 순환 냉각 칠러로 구배 제조기를 냉각한다.</li>
	<li>먼저, 챔버에 130 mL의 고밀도 구배 용액(HD; 1.087 g/mL)을 채워 백의 바닥에 고밀도 층을 로딩할 준비를 한다. 펌프 속도 150 mL/min으로 로딩한다.</li>
	<li>고밀도 구배 용액이 백에 들어가면, 전면 비커에 130 mL의 고밀도(HD) 용액을 넣고 후면 비커(클램프 닫힘)에 140 mL의 저밀도(LD; 1.063 g/mL) 구배 용액을 넣는다.</li>
	<li>2개 챔버 사이의 지혈鉗/클램프를 풀고 50 mL/min의 펌프 속도로 연속 구배를 생성한다.</li>
	<li>혈액 은행의 가용성에 따라, 전혈 폐기물에서 수집된 여러 익명 버피코트(buffy coat) 풀에서 정제할 인간 단핵구 버피코트 세포를 미리 준비한다(10개의 버피코트 백에 40 mL에서 60 mL의 전혈이 추가됨).
	<ol>
		<li>MNC 분리
		<ol>
			<li>저밀도 인간 단핵 세포 분리를 위해 밀도 구배 원심분리를 사용한다. 이를 위해 아래에 설명된 단계를 따른다.</li>
			<li>세포 준비를 위해 혈액(항응고 처리된 전혈 또는 현탁된 버피코트)의 부피를 계산한다. 혼합 전도를 통해 혈액을 2x-4x 완충액으로 희석한다. 혈액이 더 많이 희석될수록 단핵 세포의 순도가 높아진다.</li>
			<li>인산 완충액과 항응고제를 혼합하여 완충액을 준비한다. 혈액 부피를 35 mL로 나누어 필요한 튜브 수를 계산하고, 각 튜브에 1.073 밀도 구배 용액 15 mL를 붓는다.</li>
			<li>바늘이 연결된 60 mL 시린지를 사용하여 밀도 구배 용액 표면에 조심스럽게 흘려보내 희석된 혈액 현탁액 35 mL를 밀도 구배 위에 서서히 층을 이룬다. 소량의 경우 피펫을 사용한다. 계면을 방해하지 않도록 주의한다. 계면이 파괴되면 단핵 세포 층의 상태가 불량해진다.</li>
			<li>20 °C에서 20분 동안 40 x g로 브레이크 없이 원심분리한다(가속&#160;0, 감속&#160;0). 원심분리 후, 멸균 전송 피펫을 사용하여 단핵 세포의 계면 층을 조심스럽게 수집한다. 세포를 다른 새 50 mL 원추형 튜브로 옮긴다.</li>
			<li>완충액(항응고제가 첨가된 PBS)으로 세포를 2회 세척한다. 1차 세척 시, 세포가 담긴 튜브에 완충액을 50 mL까지 채운다. 20 °C에서 10분 동안 30 x g로 원심분리하여 세포 펠렛을 형성한다(가속&#160;9, 감속&#160;0). 모든 상층액을 조심스럽게 제거한다.</li>
			<li>혈소판 제거를 위해 2차 세척을 수행한다. 펠렛을 완충액으로 50 mL 부피가 되도록 재현탁한다. 20 °C에서 10분 동안 200-30 x g로 원심분리한다(가속&#160;9, 감속&#160;0).</li>
			<li>세포를 최종 부피 5 mL로 재구성하며, 이 세포들의 비중은 저밀도 MNC &#60;1.073과 유사해야 한다. 밀도계로 구배의 비밀도를 측정한다.</li>
			<li>전송 백에서 95 mL의 고밀도 구배 배지(1.083 g/mL)를 사용하여 펠렛을 최종 부피 10 mL로 재현탁한다. 이 생성물을 세포 분리기를 이용한 정제에 사용한다. 최종 부피 10 mL에는 세포와 1.083 고밀도 구배 배지가 포함되어 있다. 
			참고: 버피코트는 0.5% BSA 또는 자가 혈장(autologous plasma)이 포함된 PBS 내에서 냉장고에 하룻밤 동안 보관할 수 있다. 버피코트를 세척할 수도 있다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10 mL의 농축 보존 배지에 현탁되어 버피코트에서 분리된 최대 30 mL의 MNC를 연동 펌프를 사용하여 25 mL/min 속도로 미리 형성된 구배 위에 상단 로딩한다. 구배를 +4 °C로 유지한다.</li>
	<li>사전 교정된 온도 프로브로 세포 처리기 내부의 온도를 지속적으로 측정한다. 멸균 온도 프로브와 연결된 디지털 열전대를 사용하여 공정 중 구배와 세포의 온도를 모니터링한다.</li>
</ol>
4. 구배 로딩의 다양한 단계 최적화
<ol>
	<li>+4 °C에서 예냉한 세포 처리기 키트를 장착합니다. +4.5 °C에서 고밀도 구배액(130 mL)을 로딩합니다. 구배액 로딩이 끝나면, 로터에서 발생하는 열을 최소화하기 위해 원심분리기를 상대적으로 낮은 속도(537 x g)로 설정합니다.</li>
	<li>세포 처리기의 전원을 꺼서 유압 시스템이 실행 전 수준으로 돌아가게 하고 공기를 배출합니다.</li>
	<li>세포 처리기를 537 x g로 재가동하고, 고밀도(130 mL) 및 저밀도(140 mL) 구배액을 추가하여 +4.3 °C, 유량 50 mL/min에서 연속 밀도 구배를 생성합니다.</li>
	<li>+6 °C에서 10 mL의 차가운 보관 배지와 함께 버피 코트(30 mL)를 25 mL/min의 유량으로 로딩합니다. 세척액 50 mL(25 mL x 2)를 추가합니다.</li>
	<li>+5 °C에서 5분 후, 10 mL/min의 유량으로 원심분리된 구배액을 12개의 병에 수집합니다.</li>
	<li>튜브에 세척 배지(M19 + 20% human albumin + 10% Penicillin streptomycin)를 채웁니다. 튜브 1에는 세척 배지 100 mL와 세포 150 mL를 채우고, 튜브 2-12에는 세척 배지 225 mL와 세포 25 mL를 채웁니다.</li>
</ol>

Advancements in Cooling Cell Processors for Enhanced Viability in Cell Therapy

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+centrifugal+blood+cell+processor+for+washing+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates.</a> Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).</li>
<li>Lake, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+human+islets+utilizing+discontinuous+albumin+gradient+on+IBM+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator.</a> Diabetes. 38, 143-145 (1989).</li>
<li>Ricordi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+and+allotransplantation+in+22+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases.</a> Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).</li>
<li>Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+separation+utilizing+a+closed+automated+purification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet separation utilizing a closed automated purification system.</a> Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).</li>
<li>Bampton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Australian+experience+with+total+pancreatectomy+with+islet+autotransplantation+to+treat+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis.</a> ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).</li>
<li>Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%3A+A+Novel+Human+Islet+Isolation+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique.</a> Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).</li>
<li>Shimoda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+purification+method+using+large+bottles+effectively+achieves+high+islet+yield+from+pig+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas.</a> Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).</li>
<li>Noguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Purification+from+Large+Mammals+and+Humans+Using+a+COBE+2991+Cell+Processor+versus+Large+Plastic+Bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health-Sponsored+Clinical+Islet+Transplantation+Consortium+Phase+3+Trial%3A+Manufacture+of+a+Complex+Cellular+Product+at+Eight+Processing+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities.</a> Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).</li>
<li>Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cooling+systems+during+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of cooling systems during islet purification.</a> Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).</li>
<li>Rilo, H. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+islet+number+and+viability+obtained+during+purification+on+Euro-Collins-Ficoll+gradients+processed+on+a+refrigerated+or+nonrefrigerated+COBE+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator.</a> Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+purification+using+bovine+serum+albumin%3A+The+importance+of+density+gradient+temperature+and+osmolality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality.</a> Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).</li>
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<li>Amrani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+temperature+on+the+efficacy+of+the+University+of+Wisconsin+solution+when+used+for+cardioplegia+at+moderate+hypothermia.+Comparison+with+the+St.+Thomas+Hospital+solution+at+4+degrees+C+and+20+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C.</a> Circulation. 86, 280-288 (1992).</li>
<li>Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+hypothermic+cardiac+storage+with+University+of+Wisconsin+solution.+An+assessment+with+human+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).</li>
<li>Adewola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cooling+systems+for+the+COBE+2991+cell+separator+used+in+the+purification+of+human+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans.</a> Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).</li>
<li>Keymeulen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+standardized+beta-cell+grafts+in+a+liver+segment+of+IDDM+patients%3A+graft+and+recipients+characteristics+in+two+cases+of+insulin-independence+under+maintenance+immunosuppression+for+prior+kidney+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft.</a> Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).</li>
<li>de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in type 1 diabetes.</a> BMJ. 342, (2011).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lemarie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+single-platform+method+for+the+enumeration+of+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells.</a> Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

전 세계의 섬 격리 시설에서는 수십 년 동안 용도가 변경된 세포 프로세서에서 인간 섬 정제를 채택해 왔습니다. 일부 섬 생산 시설은 냉장되지 않은 셀 프로세서에서 섬을 계속 처리하지만, 대부분의 센터는 셀 프로세서10,11,15의 냉장 버전을 사용한다. 센터는 습기와 결로에 노출되는 주요 단점이 있는 냉장실에 셀 프로세서를 배치하거나 샤프트를 포함하여 셀 프로세서 자체를 기술적으로 크게 수정하여 기계 보증 및 예방 유지 관리에 즉각적인 영향을 미칩니다. 제시된 새로운 GMP 세포 치료 호환 세포 프로세서 냉각 시스템은 정의된 저온(+ <10°C)에서 세포 처리를 수행하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 실온에서 원래의 세포 프로세서 세포 분리기로 원심분리하는 동안 달성할 수 없습니다.
공랭식 기술은 브뤼셀<sup ...

중증 제1형 당뇨병에 대한 섬 이식은 내인성 인슐린 분비를 회복시킬 수 있으며 많은 국가에서 치료의 표준이 되었습니다1. Islet isolation은 췌장의 온열 효소 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차이며, 그 후 소화된 조직의 회수를 위한 냉각 단계 및 세포 프로세서에서 연속 또는 불연속 밀도 구배를 통한 islet 정제를 포함합니다. 급속 냉각은 효소 분해 단계를 늦추고 오염된 acinar 세포에 의해 방출된 소화 효소로부터 섬을 보호합니다. 셀 프로세서는 원래 주변 온도에서 세포 혈액 성분을 분리하도록 설계되었습니다2. 1989 년 랑거 한스의 인간 췌장 섬을 정화하기 위해 용도가 변경되었습니다 3. 30년 동안 인간 섬은 임상 시험을 위해 정제되었으며, 최근에는 불연속 그래디언트가 있는 세포 프로세서에서 정제되었습니다4 또는 연속 밀도 그래디언트1 또는 이와 동등한 컴퓨터 작동 믹서로 만든 연속 밀도 그래디언트1 5,6,7. 다른 그룹에서는 대형 원통형 플라스틱 병<을 사용하여 대형 포유류와 인간으로부터 섬을 정화했다고 보고했습니다>sup class="xref"8,7,9, 이는 정화 및 섬의 품질을 실질적으로 향상시켰습니다.
실제로, 임상 이식을 위해 인간 섬을 정제하기 위한 황금 표준을 고려할 때10,11, 제조된 세포 프로세서는 냉장 장치가 없었습니다. 냉장 시설의 부족으로 인한 직접적인 결과로, 섬들은 정화 단계에서 온도 상승에 노출되었습니다. 원심분리 중에는 로터의 기계적 마찰로 인해 제어되지 않은 온도 상승이 발생합니다12,13. 세포 프로세서는 포도당 유도 인슐린 분비 및 세포 생존율을 통계적으로 증가시키는 섬 격리 센터의 냉각 시스템으로 조정되었으며, 정제 절차 중에 췌장섬을 저온으로 유지하는 이점을 확인했습니다14,15.
1980년대 후반에 밀도 구배 정제 중 섬 손상을 줄이기 위해 10개의 냉장 프로토타입이 제작되었지만 더 이상의 주목을 받지 못했다는 점에 유의해야 합니다. 셀 프로세서 프로토타입은 냉각된 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 스핀들 및 보울 냉각을 기반으로 했습니다. 특히, 장기 보존 용액 및 다당류 밀도 구배를 포함한 섬 정제 용액은 실온 이상에서 사용할 때 섬 생존력에 해로울 수 있습니다16,17,18. 섬 세포 정제를 위한 셀 프로세서와 원래의 비냉장 셀 프로세서의 다양한 냉각 전략을 비교하여 로터의 마찰로 인해 발생하는 제어되지 않은 온도 상승을 방지하기 위해 평가되었습니다. 인간 섬 정제 동안 세포 프로세서를 냉각시키기 위한 몇 가지 시도가 있었습니다. 셀 프로세서는 현재 University of Illinois Chicago의 섬 격리 센터에서 사용되는 그래디언트 원심분리 중에 0-8 °C19의 온도를 유지하기 위해 특별히 설계된 냉장실에 임시 또는 영구적으로 보관할 수 있습니다19, University of Miami14, University of Oxford facilities15, 샌프란시스코 대학교(맞춤형 냉각 장치가 셀 프로세서를 둘러싸고 있음). 또 다른 수정에는 스웨덴 제네바 및 체코 공화국에서 전자 제어 액체 질소 냉각을 사용하는 냉각 시스템으로 셀 프로세서 스핀들의 코어 냉각이 포함됩니다15,19. 2000 년 중반의 또 다른 대안은 에어컨 장치 12 또는 릴 대학 (University of Lille)의 샤프트를 액체 냉각하는 셀 프로세서의 코어 냉각이었습니다.
셀 프로세서의 냉각 수정은 쉽게 구할 수 없으며 GMP 클린룸 환경 내에서 보증 손실 및 기계 서비스 생성자의 거부를 포함한 위험(습도, 응결 축적)이 있습니다. 따라서 이탈리아 밀라노, 노르웨이 오슬로, 스코틀랜드 에든버러를 포함한 일부 섬 센터에서는 섬 정제 공정 중에 셀 프로세서에 냉각 시스템을 사용하지 않습니다15.
현재 연구는 최소한으로 수정된 셀 프로세서 시스템과 함께 새로 개발된 즉시 사용 가능한 냉각기의 효과를 테스트하기 위해 설계되었습니다. 간단히 말해서, 여기에 설명된 공기 기반 냉각기는 -40°C에서 -100°C 사이의 건조 가스 1SCFM(Standard Cubic foot Per Minute)의 온도를 제어하는 기계적으로 냉각된 열교환기입니다. 이 냉각 시스템에는 건조한 의료용 공기 공급이 필요합니다. 공기는 라인과 열교환기를 통해 (7.9mm) 노즐을 통해 흐릅니다. 노즐 내에 위치한 히터는 열을 공급하여 기류의 온도를 제어합니다. 여분의 단단한 플라스틱 원심분리기 덮개를 구입하여 최소한의 수정이 이루어졌습니다. 덮개에 직경 13.3mm의 구멍을 뚫고 냉각된 공기를 원심분리기 덮개의 구멍을 통해 냉각기 노즐에서 셀 프로세서로 전달했습니다. 냉각된 의료 공기는 셀 프로세서의 원심분리 보울 내부에 주입되어 액체의 온도 또는 밀도 구배를 지속적으로 제어했습니다.
냉각 셀 프로세서의 기술적 성능과 냉각 요소가 GMP 클린룸 환경에 미치는 영향을 평가했습니다. 주요 초점은 생존력을 보존하기 위해 인간 섬 정화 과정에서 매우 낮은(<10 °C) 온도를 달성하는 것이었습니다. 섬 분리를 위한 대용물로 버피 코트 밀도 분리를 사용하여 세포 생존력에 대한 이 냉각 프로토콜의 효능을 확인했습니다.

<table><tbody><tr><td><강한>장비</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>공기 입자 카운터</td><td>Lasair III&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에어젯 XR40&nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>FTS 시스템 XR40</td><td></td></tr><tr><td>생물안전 캐비닛</td><td>Thermo Scientific</td><td>EQ-1301</td><td></td></tr><tr><td>순환 냉각 냉각기</td><td>Julabo</td><td>CF30</td><td></td></tr><tr><td>COBE 2991&nbsp;</td><td>Terumo BCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 냉각 트레이</td><td>Biorep</td><td>CCT-01</td><td></td></tr><tr><td>더블 재킷 그라디언트 메이커&nbsp;</td><td>집에서</td><td></td><td></td>맞춤 제작된</tr><tr><td>KJT-열전대 온도계</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI93551N</td><td>액체 온도 측정용</td></tr><tr><td>자석 교반기&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880014</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프&nbsp;</td><td>MasterFlex</td><td>MK-77921-79</td><td></td></tr><tr><td>온도계&nbsp;</td><td>Extech Instruments</td><td>RMS 430</td><td>COBE 온도</td></tr><tr><td>무용 비드 목욕</td><td>Cole-Parmer</td><td>10122-00</td><td></td></tr><tr><td>재료 및 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 줄기세포 열거 키트</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>344563</tr><tr><td>COBE 2911 튜빙 키트</td><td>Terumo BCT</td><td>90819</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 250ml</td><td>코닝</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>그라디언트 밀도 1.1</td><td>Biochrom&nbsp;</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>졸업된 일회용 병</td><td>Thermo fisher</td><td>382019-1000</td><td></td></tr><tr><td>인간 알부민 20%&nbsp;</td><td>Kedrion Biopharma&nbsp;</td><td>8091600</td><td></td></tr><tr><td>M199 세척 용액&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>99-784-CM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 튜브</td><td>Masterflex</td><td>96400-6</td><td></td></tr><tr><td>의료용 드라이 에어</td><td>린데 헬스케어</td><td>메디온 22</td><td></td></tr><tr><td>펜슬린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Thermoprobe</td><td>Biorep</td><td>TC-02</td><td>온도센서</td></tr><tr><td>Trypan blue&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>위스콘신 대학교 벨저(UW)&nbsp;</td><td>생명의 다리&nbsp;</td><td>RM/N 4055</td><td>보존 매체</td></tr></tbody></table>

새로운 냉각 셀 프로세서 시스템이 islet cell isolation facility에 미치는 영향 평가

Evaluation of the Impact of a New Cooling Cell Processor System on Islet Cell Isolation Facility

임상 이식을 위해 인간 섬을 정제하는 골드 스탠다드 세포 프로세서를 포함한 표준 세포 치료 장비는 거의 냉장 보관되지 않으므로 원심분리 단계에서 세포가 고온에 노출될 수 있습니다. 맞춤형 냉각 시스템은 인간의 섬 생존 능력과 기능에 직접적인 이점이 있습니다. 현재 연구는 최소한의 수정이 필요한 새로 개발되고 쉽게 구할 수 있는 냉각 셀 프로세서 시스템의 효과를 테스트하고 인간 세포 생존력 및 GMP 클린룸 환경에 미치는 영향을 평가하기 위해 고안되었습니다.-30°C로 설정된 기계식 냉장 열교환기인 냉각기 시스템을 사용하여 원심분리기 덮개에 뚫린 구멍을 통해 냉각된 의료 등급의 건조 공기를 셀 프로세서 보울로 전달했습니다. 카타르에서 췌장 기증자의 가용성이 제한됨에 따라 시스템 검증은 풀링된 인간 골수 버피 코트의 연속 밀도 구배 정제로 수행되었습니다. 멸균 상태, 난류 및 입자 수는 클래스 C 및 클래스 B 클린룸 환경에서 측정되었습니다. 냉각된 셀 프로세서 주변에서 난류가 발생하지 않았으며 클린룸 GMP 표준에 따라 과도한 0.5μm 및 5μm 공기 중 미립자가 생성되지 않았습니다. 채취 단계의 시작과 끝에서 온도는 비냉각 셀 프로세서에서 각각 21.50°C± 0.34°C 및 21.93°C± 0.20°C로 상승했으며, 냉각 셀 프로세서에서는 0.17°C± 10.9°C, 0.35°C± 11.16°C로 상승했습니다(p <0.05). 냉각된 cell processor는 단핵 cell fraction의 회수율(98%)과 후처리에서 생존율(100% ± 2%)을 모두 개선했습니다. 새로운 냉각 시스템은 셀 프로세서에서 발생하는 열을 효과적으로 줄이면서 GMP 클린룸 환경에 미립자 영향을 미치지 않습니다. 여기에 설명된 냉각 셀 프로세서는 저렴하고(세금, 통관 및 운송을 포함하지 않은 $16,000) 강력한 냉각을 제공하는 최소 침습 방법입니다. 현재 GMP 세포 치료 시설에서 이 기술을 임상 프로그램을 위해 인간 섬 세포 분리 및 이식에 적용하고 있습니다.

냉각 셀 프로세서가 GMP 클린룸에 미치는 영향을 먼저 정량화했습니다. 표준화된 방법은 입자 계수기를 사용하여 셀 프로세서 및 가압 공기 냉각기 시스템에 근접한 중요한 지점에서 GMP 등급 클래스 C 및 클래스 B 클린룸 환경에서 공기 중 입자 오염을 측정했습니다. 결과는 장비 주변에서 난기류가 발생하지 않았음을 보여주었습니다. 기록된 데이터에 따르면 클린룸 GMP 등급 C, 등급 B 및 BSL III 표준(그림 4)에 따라 0.5μm 및 5μm의 공기 중 미립자가 초과되지 않았습니다.
모든 실험은 연속적인 다당류 밀도 구배로 수행되었습니다. 먼저, 그래디언트 용액의 온도 측정은 냉각 및 비냉각 셀 프로세서에서 6번의 실행으로 서로 다른 시점의 셀 없이 테스트되었습니다. 후속 연구에서 인간 세포는 냉각된 세포 프로세서를 사용하여 밀도 구배에서 정제되었습니다.
<p class="jove_co...

여기의 프로토콜은 후처리 시 셀 생존력을 개선하기 위해 GMP(Good Manufacturing Practices) 클린룸과 호환되는 맞춤형 냉각 셀 프로세서 시스템을 설명합니다.

새로운 냉각 셀 프로세서 시스템이 Islet Cell Isolation Facility에 미치는 영향 평가

Standard cell therapy equipment, including the gold standard cell processor to purify human islets for clinical transplantation, is rarely refrigerated, ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연을위한 절차 : 수정된 자동화된 방법을 사용하여 (부분 I 소화 및 췌장 조직의 수집).

인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 I : 소화 및 췌장 조직의 수집

높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연 (부분 II : 인간 아일 레츠의 정화 및 문화)에 대한 절차를 수정 자동화된 방법을 사용하여.

인간 췌장 아일릿 절연 : 2 부 : 인간 아일 레츠의 정화와 문화

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새로운 냉각 셀 프로세서 시스템이 Islet Cell Isolation Facility에 미치는 영향 평가

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