Name: 감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T13:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 배우세요 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양을 확립하는 방법을. RT-qPCR, 현미경, ELISA, 유세포 분석을 활용하여 중추신경계의 선천성 면역 반응을 연구하고 바이러스 감염에 대한 보호 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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Edgar 및 Linington 연구소 구성원, 특히 Chris Linington 교수, Diana Arseni 박사 및 Katja Muecklisch 박사에게 이러한 문화를 설정하는 동안 문화에 대한 조언, 유용한 의견 및 지원에 감사드립니다. Cell Profiler 파이프라인의 시작점을 제공한 Dr Muecklisch에게 특별한 감사를 전합니다. 이 작업은 MS Society (보조금 122)와 Yuri and Lorna Chernajovsky 재단의 지원을 받았습니다. JC 및 MP에 대한 글래스고 대학교 자금 지원; 및 Wellcome Trust(217093/Z/19/Z) 및 Medical Research Council(MRV0109721)을 GJG에 제공합니다.

모든 동물 실험은 동물 사용에 대한 현지 법률 및 지침을 준수했으며 글래스고 대학의 지역 윤리 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 동물은 영국 내무부 프로젝트 라이센스의 후원하에 1986년 영국 동물 과학 절차법에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 사육되었습니다. 이 연구에서는 사내에서 사육된 성인 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 젊은 여성 (8-12 주)의 사용은 임신 성공률이 높기 때문에 권장됩니다. 수컷은 여러 차례의 번식에 재사용 할 수 있습니다. 그림 1 은 혼합된 뉴런 및 신경교 배양을 생성하는 설명된 방법의 개략도를 나타냅니다.
1. 조직 배양 소모품의 제조
<ol><li>Class 2 안전 캐비닛 내부에 현미경 커버슬립이 들어 있는 접시 및/또는 접시를 준비합니다. 배양 기간 동안 무균 상태를 보장하기 위해 모든 시약 또는 오토클레이브를 멸균하십시오.</li>
	<li>적절한 부피의 BA-PLL(붕산 완충액[BA][50mM 붕산, 12.5mM 사붕산나트륨, pH 8.5] 중 13.2μg/mL 폴리-L-라이신하이드로브로마이드[PLL])을 각 웰(6웰 플레이트에서 1,000μL/웰, 96웰 플레이트에서 100μL/웰, 부피는 표 1에 요약됨)에 추가합니다. 현미경 커버슬립의 경우 200개의 멸균 커버슬립이 들어 있는 직경 9cm의 조직 배양 접시에 20mL의 BA-PLL을 넣고 소용돌이쳐 고르게 분포시킵니다.</li>
	<li>37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>현미경 커버슬립이 들어 있는 각 웰 또는 접시에서 BA-PLL 용액을 제거하고 멸균수 20mL를 추가하고 커버슬립을 휘젓고 물을 제거하여 세척합니다. 이 세척 단계를 세 번 반복하십시오. 커버슬립이 포함된 접시의 경우 최종 세척 시 조직 배양 접시에 멸균수를 남겨두어 커버슬립을 쉽게 제거할 수 있습니다.</li>
	<li>멸균 피펫으로 가능한 한 많은 액체를 제거하고 최소 2시간에서 하룻밤 동안 건조시키십시오.</li>
	<li>코팅된 플레이트를 4°C에서 최대 2개월 동안 보관합니다. 참고: 폴리-l-라이신(BA-PLL) 용액으로 준비된 붕산은 매번 새로운 PLL을 추가하여 최대 3회까지 재사용할 수 있습니다. BA-PLL을 4°C에서 보관하십시오. PLL은 세포가 달라붙어 성장할 수 있도록 하기 때문에 접시는 BA-PLL로 처리됩니다. 이 처리가 없으면 약 1주일의 배양 후에 세포가 들어 올려져 더 이상 분화할 수 없습니다.</li>
</ol>2. E17 배아 뇌의 해부
<ol><li>한 마리 또는 여러 마리의 암컷 마우스와 수컷 마우스를 함께 수용합니다. 암컷에게 매일 점액 마개가 있는지 확인하여 짝짓기가 이루어 졌음을 나타냅니다. 참고: 모든 "연결된" 암컷 마우스는 정확한 임신 시작 날짜를 보장하기 위해 수컷과 분리되어야 합니다. 임신을 확인하기 위해 마우스의 무게를 측정하거나 육안으로 모니터링 할 수 있습니다.</li>
	<li>예를 들어 이산화탄소(CO2) 농도 상승, 치명적인 마취 과다 복용 또는 목 탈구와 같은 지역 동물 복지 지침 및 법률에 따라 적절한 방법을 사용하여 E17에서 임신한 마우스를 도태합니다. 참고: 선택한 방법은 배아를 방해해서는 안 됩니다. 이 연구에서는 이산화탄소 가스 농도 상승에 노출된 후 대퇴 동맥을 절단하여 사망을 확인하는 방법을 사용하여 임신한 댐을 도태했습니다.</li>
	<li>도태된 임신한 마우스를 해부 보드에 등에 올려 놓습니다. 고정할 필요는 없지만 경험이 없는 연구원이 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 집게를 사용하여 복부의 정중선을 꼬집습니다. 날카로운 가위를 사용하여 자궁에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하면서 생식기에서 흉곽까지 정중선을 통해 피부와 복막을 통해 복부를 잘라냅니다.<ol><li>쥐의 자궁에는 두 개의 뿔이 있으며, 각 뿔에는 일반적으로 1-5개의 배아가 들어 있습니다. 어머니에게서 배아가 들어있는 자궁을 제거하고 즉시 얼음 위에 올려 놓으십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>태반 측면의 난황 자루를 자르고 배아가 손상되지 않도록 주의하고 난황 자루에서 배아를 제거합니다.</li>
	<li>즉시 배아를 참수하십시오. 목이 잘린 머리를 얼음 위에 칼슘(Ca 2+)과 마그네슘(Mg2+)(HBSS-/-)이 없는 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)과 함께 접시에 넣습니다. 참고: 유전자형 분석이 필요한 경우 유전자 분석을 위해 이 단계에서 꼬리를 제거할 수 있습니다. 여러 유전자형이 예상되는 경우 각 배아의 머리를 별도로 보관하여 배양해야 합니다.</li>
	<li>각진 집게를 사용하여 머리를 왼쪽을 향하도록 옆으로 눕힙니다.</li>
	<li>집게의 한쪽 가장자리로 눈을 뚫고 다른 쪽 턱을 단단히 잡습니다.</li>
	<li>목덜미에서 시작하여 끝을 향해 정중선을 따라 두피의 피부를 부드럽게 찢습니다.</li>
	<li>흰색 타원형으로 눈에 띄는 척수를 통해 들어가면 각진 집게를 사용하여 정중선을 따라 두개골을 부수고 뇌를 노출시킵니다.</li>
	<li>두개골을 위쪽을 향한 쪽에서 부드럽게 떼어내어 뇌를 노출시킵니다.</li>
	<li>두개골에서 뇌를 들어 올려 뇌가 완전히 제거되면 두개골을 처리합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 조밀 한 혈관을 가진 얇은 막으로 눈에 띄는 수막을 제거하십시오.</li>
	<li>얼음 위에 2mL의 HBSS-/-가 들어 있는 비쥬( 재료 표 참조)에 뇌를 넣습니다.</li>
	<li>나머지 브레인에 대해 2.6-2.13단계를 반복하여 비쥬당 최대 4개의 브레인을 추가합니다.</li>
	<li>비쥬에 250 μL의 10x 트립신을 넣고 비쥬를 흔들어 뇌를 분쇄합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 알림: 이 시점부터 모든 단계는 멸균 조직 배양 후드에서 수행해야 합니다.</li>
	<li>2mL의 대두 트립신(SD) 억제제(Leibovitz L-15, 대두에서 0.52mg/mL 트립신 억제제, 40μg/mL DNase I, 3mg/mL 소 혈청 알부민[BSA] 분획 V, 표 참조)를 37°C에 두어 -20°C에서 해동합니다.</li>
	<li>뇌가 포함된 각 비쥬(최대 4개의 브레인을 포함하는 비쥬당)에 SD 억제제 2mL를 넣고 비쥬를 다시 흔들어 고르게 분산시킵니다. 참고: SD 억제제는 트립신 활성을 감소시켜 샘플의 불필요한 소화를 방지하고 세포 생존율을 보존합니다.</li>
	<li>원심분리하지 않고 각 비석에서 상층액 2mL를 제거하고 세포 덩어리가 옮겨지지 않도록 주의하면서 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>현탁액을 두 번 흡인하여 5mL 주사기에 부착된 19G 바늘로 비석에 남아 있는 세포를 분쇄합니다. 이것은 두꺼운 점액과 같은 혼합물을 생성합니다.<ol><li>21G 바늘을 사용하여 두 번 더 반복하십시오. 덩어리가 남아 있으면 21G 바늘로 한 번 더 분쇄합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>23G 바늘을 사용하여 비쥬에서 동일한 15mL 원심분리 튜브(단계 2.18부터)로 세포를 옮깁니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 200 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 모든 상층액을 제거하고 필요한 세포가 들어 있는 바닥의 느슨한 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 다른 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>상층액을 RT에서 200 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 참고: 이 단계는 필수는 아니지만 많은 세포가 필요하거나 배아가 적은 경우 이 단계를 수행하여 상청액에서 가능한 한 많은 세포를 복구할 수 있습니다.</li>
	<li>10mL의 도금 배지(PM)(49% Dulbecco's modified eagle medium[DMEM], 1% 페니실린/스트렙토마이신[Pen/Strep], 25% 말 혈청, 25% HBSS with Ca 2+ 및 Mg2 +[HBSS+ /+]; 재료 표 참조), 두 펠릿을 함께 결합하고 재현탁하여 전체 세포 현탁액을 만듭니다.</li>
	<li>트립판 블루와 혈구계 또는 디지털 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세고 PM으로 세포 현탁액을 1.8 x 106 cells/mL의 농도로 희석합니다.</li>
</ol>3. 셀 도금
<ol><li>표 1에 자세히 설명된 대로 필요한 부피의 세포 현탁액을 필요한 형식에 추가합니다: 6웰 형식의 경우 웰당 1,000μL, 96웰 형식의 경우 웰당 50μL 또는 커버슬립당 100μL.</li>
	<li>37°C에서 5%-7%CO2로 2-4시간 동안 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 세포가 부착되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>배지를 제거하고 새로운 분화 배지(DM+: 10μg/mL 인슐린을 포함한 DM-)로 보충합니다. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50nM 하이드로코르티손, 10ng/mL 비오틴, 2.5mL 100x N1 배지 보충제; 재료 표 참조). 볼륨은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 떠 있는 커버슬립을 누릅니다.</li>
</ol>4. 문화 유지
참고: 이러한 배양은 최적의 성장과 분화를 지원하기 위해 매주 세 번 먹이를 주어야 합니다. 배양은 DIV (days in vitro) 실험을 위한 최적의 건강 및 성숙도에 도달할 것이다 21. 세포는 최대 28 일 동안 배양 할 수 있으며, 그 후에 배양 물은 빠르게 퇴화됩니다.
<ol><li>DIV12까지 주 3회, 6웰 형식의 경우 웰당 500μL, 96웰 형식의 경우 웰당 50μL 또는 3개의 커버슬립이 포함된 접시당 500μL를 제거하고 6웰 형식의 경우 웰당 600μL, 96웰 형식의 경우 웰당 60μL를 추가하여 상층액의 일부를 신선한 DM+로 교체하고, 또는 커버슬립 접시당 600μL(표 1).</li>
	<li>DIV13부터 주당 3회, 6-웰 형식에서 웰당 500 μL, 96-웰 형식에서 웰당 50 μL, 또는 3개의 커버슬립을 포함하는 디쉬당 500 μL를 제거하고, 6-웰 형식에서 웰당 600 μL, 96-웰 형식에서 웰당 60 μL을 추가하여, 상청액의 일부를 신선한 DM-으로 교체하고, 또는 커버슬립 접시당 600μL(표 1).</li>
</ol>

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위한 배아 마우스 뇌 혼합 세포 배양

<ol><li>Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKovacs%2C+GG+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22">Handbook of Clinical Neurology</a>. 145, Elsevier. 13-23 (2018).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Techniques%22">The Principles of Humane Experimental Techniques</a>. 1, Methuen. (1959).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Thomson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((synapsing+cultures+of+murine+spinal+cord-validation+as+an+in+vitro+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system.</a> The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).</li>
<li>Bijland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+studying+CNS+white+matter%3A+Functional+properties+and+experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches.</a> F1000Research. 8, 117(2019).</li>
<li>Fragkoudis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+and+oligodendrocytes+in+the+mouse+brain+differ+in+their+ability+to+replicate+Semliki+Forest+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurovirology%22%5BJournal%5D)">Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus.</a> Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).</li>
<li>Hayden, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-specific+IgMs+induce+antiviral+responses+in+the+CNS%3A+Implications+for+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis.</a> Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135(2020).</li>
<li>Kantzer, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-ACSA-2+defines+a+novel+monoclonal+antibody+for+prospective+isolation+of+living+neonatal+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes.</a> Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).</li>
<li>Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+and+macrophages+in+CNS+homeostasis%2C+autoimmunity%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer.</a> Journal of Immunology Research. 2017, (2017).</li>
<li>Gee, J. R., Keller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+Regulation+of+brain+homeostasis+via+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).</li>
<li>Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+myelination%3A+possible+roles+of+the+immune+proteasome+in+oligodendroglial+homeostasis+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction.</a> Frontiers in Neuroscience. 16, 867357(2022).</li>
<li>Keller, D., Erö, C., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+densities+in+the+mouse+brain%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cell densities in the mouse brain: A systematic review.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83(2018).</li>
<li>Wang, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygenglucose+deprivation+enhancement+of+cell+death%2Fapoptosis+in+PC12+cells+and+hippocampal+neurons+correlates+with+changes+in+neuronal+excitatory+amino+acid+neurotransmitter+signaling+and+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents.</a> Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Chen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+atlas+of+the+developing+prenatal+and+postnatal+mouse+central+nervous+system%2C+with+emphasis+on+prenatal+days+E7.5+to+E18.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5.</a> Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).</li>
<li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+overview+of+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li>
<li>Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+decades+of+new+drug+development+for+central+nervous+system+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Two decades of new drug development for central nervous system disorders.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).</li>
<li>Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+new+approaches+in+CNS+drug+discovery%3A+Why+drugs+have+failed%2C+and+what+can+be+done+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes.</a> Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+%28polydendrocytes%29+in+brain+physiology+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 133(2014).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+Promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59(2017).</li>
<li>Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+and+actin-containing+filaments+of+normal%2C+preneoplastic%2C+and+neoplastic+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells.</a> Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).</li>
<li>Koch, K. S., Leffertt, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+of+differentiated+adult+rat+hepatocytes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).</li>
<li>Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+the+infiltrating+immune+cells+in+the+brain+of+healthy+individuals%3A+effect+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity+and+Ageing%22%5BJournal%5D)">Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging.</a> Immunity and Ageing. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
</ol>

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중추신경계는 뇌에서 척수까지 이어지는 복잡한 네트워크로, 주로 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포, 미세아교세포 등 다양한 세포 유형으로 구성되어 있다1. 각 세포는 항상성을 유지하고 CNS 9,10,11의 문제에 대한 적절한 반응을 생성하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 이러한 모든 세포 유형을 포함하는 배양 시스템은 뇌가 자극에 어떻게 반응하는지 조사하는 데 유용하고 다재다능한 도구입니다. 시험관 내 맥락에서 이러한 세포와 그 상호 작용을 연구할 수 있다는 것은 다양한 실험 문제를 쉽게 조사하기 위해 매우 다양한 기술을 사용할 수 있음을 의미합니다. 우리는 태아기 뇌에서 주요 CNS 세포 유형을 얻고 배양하는 빠르고 효율적인 방법을 설명했으며, 이는 성인 마우스 뇌에서 개별 세포 집단을 모방할 수 있습...

중추신경계(CNS)에 대한 이해를 높이는 것은 많은 신경염증 및 신경퇴행성 질환에 대한 치료 옵션을 개선하는 데 중요합니다. 뇌, 척수, 시신경 내에서 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크인 CNS는 뉴런, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 이들의 선천성 면역 세포인 미세아교세포로 구성됩니다1. 체외 접근법은 종종 의미있는 연구를 수행하는 데 필요한 마우스의 수를 크게 줄일 수 있습니다. 그러나 CNS의 복잡한 특성으로 인해 세포주를 사용하여 생체 내 상황을 요약하는 것은 불가능합니다. 혼합 신경 세포 배양은 3Rs(Replacement, Reduction and Refinement) 원칙 2,3에 따라 관련 모델에서 신경(면역학) 문제를 조사하는 데 매우 유용한 연구 도구를 제공합니다.
Thomson et al.은 앞서 언급한 모든 주요 CNS 세포 유형으로 분화하는 태아기 척수 세포를 이용한 세포 배양 방법을 설명했다4. 이 시스템은 또한 시냅스 형성, 수초 축삭 및 Ranvier의 노드를 가지고 있습니다. 이 배양 방법의 주요 한계는 척수이기 때문에 뇌를 유용하게 모델링하지 못하고 배아 13일(E13) 척수로부터의 세포 수율이 수축한다는 것입니다. 따라서 조사할 수 있는 실험 조건의 수가 제한됩니다. 따라서 본 연구는 동물에 대한 요구량을 줄이기 위해 세포 수율이 증가한 뇌의 특성을 재현하는 새로운 세포 배양 시스템을 개발하는 것을 목표로 했습니다.
Thomson et al. 출발점으로 우리는 순전히 태아기 쥐의 뇌에서 파생된 세포 배양 모델을 개발했습니다. 이러한 배양은 척수 배양과 동일한 세포 집단, 상호 연결성 및 치료 옵션을 가지고 있지만 비교에 의한 수초화가 적습니다. 그러나 세포 수율이 약 3배 더 높은 CNS in vitro 모델을 갖는 것이 더 효율적이며, 더 적은 수의 마우스와 더 적은 배아 처리 시간을 필요로 합니다. 당사는 현미경 분석을 위한 유리 커버슬립과 고처리량 연구를 위한 96웰 플레이트를 포함한 다양한 크기의 플라스틱 웰 플레이트를 사용하는 등 여러 다운스트림 응용 분야 및 스케일에 맞게 이 고유한 배양 시스템을 최적화했습니다.

<table><tbody><tr><td>10x Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4549-100ML</td><td>조직을 소화하려면</td></tr><tr><td>140mm TC 접시</td><td>Fisher</td><td>11339283</td><td>1 140mm 접시 당 8 개의 35mm 접시를 넣으십시오</td></tr><tr><td>15 mL Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td>도금 매체에서 재현탁액을 위해 세포를 펠렛으로 수집하려면</td></tr><tr><td>18 G 바늘</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710012040</td><td>샘플</td></tr><tr><td>21 G 바늘</td><td>BD의 분쇄 용</td><td>304432</td><td>시료 분쇄용</td></tr><tr><td>23G 바늘</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>시료 분쇄용</td></tr><tr><td>35mm TC 접시</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>플레이트 아웃 1 35mm 접시당 3개의 PLL 코팅 커버슬립</td></tr><tr><td>5mL 주사기 Fisher</td><td></td><td>15869152</td><td>시료 분쇄용</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>RT-qPCR용 세포 플레이트를 플레이트아웃하고 유동 cytometry</td></tr><tr><td>7 mL Bijoux</td><td>Fisher</td><td>DIS080010R</td><td>To put brains intp</td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>To plate-out cells for high-throughput testing</td></tr><tr><td>ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE</td><td>Miltenyi</td><td>130-123-284</td><td>성상세포의 유세포 분석 염색용</td></tr><tr><td>Angled ypedges</td><td>dumont</td><td>0108-5/45-PO</td><td>해부용</td></tr><tr><td>비오틴</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td>For DM+/-</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma</td><td>B6768-500G</td><td>붕산 완충액</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 항체, clone M1-69</td><td>Biolegend</td><td>101825</td><td>뉴런 및 성상세포의 유세포 염색용</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 항체, clone 30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103139</td><td>마이크로아교세포</td></tr><tr><td>의 유세포 분석용Brilliant Violet 785 안티 마우스 / 인간 CD11b 항체, 클론 M1 / 70</td><td>Biolegend</td><td>101243</td><td>microglia</td></tr><tr><td>BSA Fraction V</td><td>Sigma</td><td>A3059-10G</td><td>SD 억제제</td></tr><tr><td>CNP</td><td>Abcam</td><td>AB6319</td><td>성숙 희소 돌기아 교</td></tr>구 <tr><td>Coverslip</td><td>VWR</td><td>631-0149</td> 현미경 해부 가위 Sigma <td>용 세포 플레이트아웃</td></tr><tr><td></td><td></td><td>S3146-1EA</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당, 피루브산나트륨, L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td>DM+/- 및 도금 매체</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermofisher</td><td>18047019</td><td>SD 억제제의 경우 이 Dnase 또는 다른 Dnase를 사용할 수 있습니다</td></tr>. SD <tr>억제제의 경우 Sigma<td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D4263</td>의 이 <td>Dnase를 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td> eFluor 780</td><td>Thermofisher</td><td>65-0865-14</td><td>라이브 / 데드 스테</td></tr>인 <tr><td>파인 펜치</td><td>Dumont</td><td>0102-SS135-PO</td><td>해부용</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>Astrocytes</td></tr><tr><td>HBSS w Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9269-500ML</td><td>도금 매체용</td></tr><tr><td>HBSS w/o Ca Mg</td><td>Sigma</td><td>H9394-500ML</td><td></td></tr><tr><td>말 혈청</td><td>에 추가할 뇌용Gibco</td><td>26050-070</td><td>도금 매체</td></tr><tr><td>용 Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>DM +/-</td></tr><tr><td>Iba1</td><td>Alpha-Laboratories</td><td>019-1971</td><td>Microglia</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td>DM +</td></tr> <tr><td>Leibovitz L-15</td><td>GIbco</td><td>11415-049</td><td>SD 억제제</td></tr><tr><td>MBP</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA409S</td><td>Myelin</td></tr><tr><td>마우스 CCL5/RANTES DuoSet ELISA 키트</td><td>BioTechne</td><td>DY478-05</td><td>ELISA 키트, 96웰 플레이트의 상등액에서 CCL5의 농도를 정량화하기 위한</td></tr><tr><td>키트, N1 매체 보충제</td>, <td>Sigma</td><td>N6530-5ML</td><td>, DM+/-</td></tr><tr><td>Nestin,</td><td>Merck</td>, <td>MAB353</td><td></td>,</tr><tr><td>NeuN</td><td>Thermofisher</td>, <td>PA578499</td><td>신경 세포체</td></tr><tr><td>NG2</td>, <td>Sigma</td><td>AB5320</td><td>미성숙 희소돌기아교</td></tr>세포 <tr><td>O4 항체, 항인간/마우스/쥐, APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-119-155</td><td>희소돌기아교세포의 유세포 염색용</td></tr><tr><td>펜/연쇄상구</td>균 시<td>그마</td><td>P0781-100ML</td><td>DM+/- 및 도금 매체</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysinehydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>코팅용 붕산/폴리-L-라이신 용액</td></tr><tr><td>커버 슬립 SMI31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>축삭</td></tr><tr><td>사붕산 나트륨</td><td>시그마</td><td>221732-100G</td><td>붕산 완충액</td></tr><tr><td>용 Trizol</td><td>Thermofisher</td><td>15596026</td><td>RT-qPCR 용 용해 세포 용</td></tr> 콩 <tr>트립<td>신 억제제</td><td>Sigma T9003-100MG</td><td></td><td>SD 억제제 용</td></tr></tbody></table>

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

중추신경계(CNS)의 모델은 생체 내에서 발견되는 상호 연결된 세포의 복잡한 네트워크를 요약해야 합니다.중추신경계는 주로 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포 및 미세아교세포로 구성됩니다. 동물 사용을 대체하고 줄이기 위한 노력이 증가함에 따라 선천성 세포 특성을 탐색하기 위해 다양한 시험관 내 세포 배양 시스템이 개발되어 CNS 감염 및 병리에 대한 치료제를 개발할 수 있습니다. 특정 연구 질문은 (유도된) 만능 줄기 세포와 같은 인간 기반 세포 배양 시스템으로 해결할 수 있지만 인간 세포로 작업하는 것은 가용성, 비용 및 윤리와 관련하여 고유한 한계가 있습니다. 여기에서는 배아 마우스 뇌에서 세포를 분리하고 배양하기 위한 고유한 프로토콜을 설명합니다. 그 결과 혼합 신경 세포 배양은 생체 내 뇌에서 발견되는 여러 세포 집단과 상호 작용을 모방합니다. 현재의 동등한 방법과 비교할 때, 이 프로토콜은 뇌의 특성을 더 밀접하게 모방하고 더 많은 세포를 확보하므로 임신한 마우스 한 마리에서 더 많은 실험 조건을 조사할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 비교적 쉽고 재현성이 높습니다. 이러한 배양은 96웰 기반 고처리량 스크리닝, 24웰 현미경 분석, 유세포 분석 및 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석을 위한 6웰 배양을 포함하여 다양한 규모로 사용하도록 최적화되었습니다. 이 배양 방법은 시험관 내 방법의 편리함과 함께 CNS의 일부 복잡성의 맥락에서 감염 및 면역을 조사하는 강력한 도구입니다.

현미경 검사 법 유리 커버슬립에서 자란 배양액은 현미경으로 분석하는 데 이상적입니다. 배양의 발달을 시각화하기 위해 커버슬립을 DIV0(세포가 부착된 후)부터 DIV28까지 여러 시점에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정했습니다. 배양물은 앞서 설명한5 와 같이 신경교 마커로서 NG2(미성숙 희소돌기아교세포) 및 네스틴(신경줄기/전구 세포), 신경 표지자로서 SMI31(축삭), MBP(미엘린) 및 NeuN(뉴런 세포체) 또는 신경교 마커로서 CNP(희소돌기아교세포), GFAP(성상교세포) 및 Iba1(미세아교세포)의 세 가지 염색 조합을 사용하여 면역형광 이미징을 위해 염색되었습니다(그림 2).
다양한 세포 유형은 CellProfiler 파이프라인('6-diamidino-2-phenylindole-positive(https://github.com...

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

내 프로젝트의 궁극적 인 연구 질문은 바이러스 감염으로부터 보호하기 위해 중추 신경계의 선천성 면역 반응을 조작 할 수있는 방법을 알아내는 것입니다. 현재 우리는 심오한 항 바이러스 단백질 인터페론 베타에 대한 반응을 연구하고 있습니다. 실험적 과제는 자세한 조사가 가능하도록 충분한 세포를 생성하는 것입니다.각 결과는 여러 기술을 사용하여 검증해야 하며 불행히도 많은 동물이 도태될 수 있습니다. 이 새로운 배양 기술에 의해 생성된 많은 수의 세포로 인해 한 마리의 임신한 마우스에서 다양한 실험 조건을 조사할 수 있습니다. 또한 가능한 경우 시험관 내 대안을 사용하면 동물의 고통을 크게 줄일 수 있습니다.이 방법은 세 가지 Rs.This 배양 방법의 원칙에 따라 동물 사용을 줄이고 개선하여 ELISA, qPCR, 현미경 및 유세포 분석과 같은 다양한 판독 방법을 사용하여 다양한 연구 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 다른 연구자들이 동물 사용을 줄이고 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 타고난 항바이러스 반응에 대한 이해를 향상시키고, 인간 폴리오마바이러스 2 또는 일반적으로 알려진 바와 같이 PML의 주요 약제인 존 커닝햄 바이러스(일반적으로 알려진 바와 같이)로부터 보호하기 위해 이를 조절하여 MS 및 기타 질병을 치료하는 데 사용되는 면역 억제제의 심각한 부작용이 될 수 있기를 바랍니다.

establishing-mixed-neuronal-glial-cell-cultures-from-embryonic-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 고도로 피더 glial 세포 레이어를 사용하지 않고 태아 쥐 두뇌의 hippocampal 뉴런을 정화의 문화에 대한 프로토콜을 제공합니다.

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

두뇌의 세포 이질에서 기본 microglia를 분리하는 것은 생리적 및 병리 학적 조건에 모두 자신의 역할을 조사하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜은 기계적인 고립과 높은 수율과 높은 순도를 제공 혼합 세포 배양 기술에 대한 실용적 기본 microglial 세포에 대해...

신생아 쥐 뇌 조직의 혼합 Glial 세포 배양의 기본 Microglia 격리

이 비디오는 신생아 쥐의 뇌에서 세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여주었습니다. 그것은 뇌의 효소적, 기계적 해리를 포함했으며, 그 다음에는 혼합 신경교세포 집단을 얻기 위해 신경 세포 성장 인자가 결핍된 성장 매체에서 배양하는 것이 포함되었습니다.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain(신생아 마우스 뇌에서 혼합 신경교세포 배양 얻기)

이 비디오는 성체 쥐의 척수 조직에서 1차 혼합 신경교세포를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 이 프로토콜은 조직의 효소 분해를 포함하며, 그 후 단세포 집단을 얻기 위해 부서진 세포막과 미엘린 파편을 제거하는 것입니다. 그런 다음 세포는 혼합 신경교세포 성장에 최적화된 배지에서 배양됩니다.

Establishing Primary Mixed Glial Cell Cultures from a Mouse Spinal Cord

우리는 장용 신경계의 신경 세포 및 교세포 구성 요소의 직접적인 연구를위한 세포 배양 프로토콜을 보여줍니다. coverslips는에 신경 / glia의 혼합 문화, 면역 전기 생리학, 개별 신경 세포와 아교 세포 기능을 검사 할 수있는 기능을 제공하는 성인 마우스 myenteric 신경 얼기에서 준비가되어...

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다.

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

생체 외에서 가능한 한 적절 하 게 생체 외 조건에서 반영 하는 실험을 실시 하는 것은 쉬운 일이 아니다. 1 차적인 세포 배양물의 사용은 전체 유기체에 있는 세포 생물학을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 제공된 프로토콜은 배아 마우스 소뇌 뉴런을 성공적으로 성장시키고 배양하는 방법을 간략하게 설명한다.

배아 마우스 소뇌에서 분리 된 뉴런의 기본 문화

여기에서는 마우스 CNS로부터 다중 신경교 세포 집단의 시험관 내 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 국소 미세아교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 성상세포를 분리하여 다양한 배양 시스템에서 각각의 표현형을 연구할 수 있습니다.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

이 프로토콜은 배아 15-16일에 마우스 배아에서 분리한 일차 신경 세포와 출생 후 1-2일에 신생아 마우스의 뇌에서 생성된 일차 미세아교세포에서 확립된 미세아교세포-뉴런 공동 배양을 설명합니다.

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

배우세요 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양을 확립하는 방법을. RT-qPCR, 현미경, ELISA, 유세포 분석을 활용하여 중추신경계의 선천성 면역 반응을 연구하고 바이러스 감염에 대한 보호 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

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