Name: 세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans와 Hep3B 간암 세포에서 형광 염료 키트를 활용한 미토파지 정량화 방법을. 이 기술은 노화 및 연령 관련 질병 연구에 필수적인 도구입니다.

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원고를 비판적으로 읽고 의견과 조언을 해주신 Gross 연구소 구성원들에게 감사드립니다. 일부 균주를 제공한 국립 보건원 연구 인프라 프로그램 사무국(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center(CGC)에 감사드립니다. 이 연구는 Vitalunga Ltd와 Israel Science Foundation(보조금 번호 989/19)의 보조금으로 지원되었습니다. 그래픽 추상 그림(그림 1)은 BioRender.com 로 생성되었습니다.

예쁜꼬마선충(C. elegans)과 간암 세포주(Liver Cancer Cell line)의 유사분열(Mitophagy) 정량화

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</ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

다중 미토파지 경로는 다양한 단백질과 생체 분자(예: 카디오리핀29)를 포함합니다. 그러나 이러한 경로의 종점은 유사하며 리소좀 효소12,13에 의한 미토콘드리아의 분해입니다. 실제로 여러 방법에서 이 종점을 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 그러나 전자 현미경과 같은 일부 방법은 값비싼 장비, 훈련된 전문가, 표본 및 분석을 위한 연장된 준비 시간에 대한 접근을 요구합니다. 또한, 특정 조직/세포/세포하 구획에서 미토파지를 측정하는 것을 포함하는 미토파지 바이오센서를 사용하는 이점에도 불구하고, 이러한 센서의 발현은 세포(21)의 생리학을 변화시킬 수 있다. 따라서, 정상 세포 생리학에 대한 장기적인 간섭을 필요로 하지 않으면서 미토파지를 정량화할 수 있는 신뢰할 수 있고, 비용 효율적이며, 빠른 방법에 대한 요구가 존재한다.
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미토콘드리아는 인간을 포함한 모든 호기성 동물에게 필수적입니다. 산화적 인산화를 통해 생체분자의 화학적 에너지를 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)으로 변환하고, 헴(hem)2을 합성하고, 산화β 산화3를 통해 지방산을 분해하고, 칼슘(calcium4)과 철(iron)5 항상성을 조절하고, 세포사멸(apoptosis)6에 의한 세포 사멸을 조절하며, 산화환원 항상성(redox homeostasis)7에 중요한 역할을 하는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성한다. 두 가지 보완적이고 반대되는 과정은 미토콘드리아의 완전성과 적절한 기능을 유지합니다: 새로운 미토콘드리아 성분의 합성(생물 발생)과 미토콘드리아 자가포식(즉, 미토파지)을 통한 손상된 성분의 선택적 제거8.
여러 미토파지 경로는 PINK1/Parkin과 같은 효소와 FUNDC1, FKBP8 및 BNIP/NIX 9,10을 포함한 수용체에 의해 매개됩니다. 특히, 미토콘드리아 성분의 선택적 분해는 자가포식소 기계와 독립적으로 발생할 수 있습니다(즉, 미토콘드리아 유래 소포를 통해)11. 그러나 다른 선택적 미토파지 경로의 종점은 유사합니다(즉, 리소좀 효소에 의한 미토콘드리아 분해)12,13. 이러한 이유로, 미토파지를 확인하고 측정하는 다양한 방법은 미토콘드리아 및 리소좀 마커14,15,16,17의 공동 국소화와 미토콘드리아 단백질/미토콘드리아 DNA18의 감소된 수준에 의존한다.
아래는 형광 현미경을 사용하여 동물 세포에서 미토파지를 측정하기 위한 기존 실험 방법론에 대한 간결한 설명으로, 미토파지 종말점 단계를 강조합니다.
Mitophagy 바이오센서 미토콘드리아 분해는 리소좀의 산성 환경 내에서 일어난다19. 따라서 단백질을 포함한 미토콘드리아 성분은 미토파지 과정의 종점에서 중성에서 산성 pH로의 전환을 경험합니다. 이 패턴은 mito-Rosella18 및 탠덤 mCherry-GFP-FIS114를 포함한 여러 미토파지 바이오센서의 작용 메커니즘을 뒷받침합니다. 이 센서에는 pH 민감성 녹색 형광 단백질(GFP)과 pH 비민감성 적색 형광 단백질(RFP)이 포함되어 있습니다. 따라서 미토파지의 종점에서 녹색-적색 형광 비율은 GFP 형광단의 소멸로 인해 크게 떨어집니다. 이러한 센서의 주요 제한 사항은 (1) 형광단 사이의 가능한 Förster 공명 에너지 전달(FRET); (2) GFP와 RFP의 차등 성숙률; (3) GFP와 RFP를 연결하는 폴리펩티드의 단백질 분해 절단으로 인한 해리; (4) 형광-방출 중첩; 및 (5) 차등 형광단 밝기 및 담금질15,16.
이러한 한계들 중 일부를 극복하는 센서가 케이마 미토콘드리아 센서(17)이다. mt-Keima 센서(산호 단백질 Keima에서 유래)는 단일 방출 피크(620nm)를 표시합니다. 그러나 여기 피크는 pH에 민감합니다. 그 결과, 높은 pH에서 산성 pH 440로 이동할 때 녹색 여기 (586 nm)에서 적색 (16,17 nm)으로 전환됩니다. 보다 최근의 미토파지 센서인 Mito-SRAI는 고정된 생물학적 샘플(20)에서 측정을 허용함으로써 이 분야를 발전시켰다. 그러나 특정 조직/세포에서 발현하고 별개의 미토콘드리아 구획을 표적으로 삼는 능력과 같은 유전자 센서의 많은 장점에도 불구하고 한계도 있습니다. 한 가지 한계는 유전자 센서가 세포나 동물에서 발현되어야 한다는 것인데, 이는 시간과 자원 집약적일 수 있습니다.
또한 미토콘드리아 자체 내의 센서 발현은 미토콘드리아 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 예쁜꼬마선충 벌레 체벽 근육에서 미토콘드리아 GFP(mtGFP)를 발현하면 미토콘드리아 네트워크(21)가 확장된다. 이 표현형은 미토콘드리아(UPRmt)21에서 펼쳐진 단백질 반응의 활성화에 필수적인 역할을 하는 스트레스 활성화 전사 인자 ATFS-1의 기능에 의존합니다. 따라서 유전적으로 암호화된 미토콘드리아/미토파지 바이오센서는 생체 내에서 미토콘드리아 항상성을 모니터링하는 데 매우 유용하지만 측정하도록 설계된 바로 그 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다.
미토콘드리아/리소좀 특이적 항체 및 염료 미토콘드리아/리소좀 colocalization을 테스트하기 위한 또 다른 전략은 미토콘드리아 외막 단백질 TOM20 및 리소좀 관련 막 단백질 1(LAMP1)22과 같은 미토콘드리아/리소좀 단백질에 대한 항체를 사용하는 것입니다. 대부분의 경우 형광단에 접합된 2차 항체를 사용하여 현미경을 통해 형광 신호를 검출합니다. 또 다른 전략은 유전자 구조를 미토콘드리아/리소좀 염료와 결합하는 것인데, 예를 들어 세포에서 LAMP1::GFP 융합 구조를 발현하는 동시에 적색 미토콘드리아 염료(예: Mitotracker Red)로 염색하는 것입니다16. 이러한 방법론은 효과적이기는 하지만 특정 항체가 필요하며 종종 고정된 표본으로 작업하거나 형광 표지된 미토콘드리아/리소좀을 발현하는 세포/형질전환 동물을 생성하는 것을 포함합니다.
여기에서는 예쁜꼬마선충 및 인간 암 세포주 Hep-3B에서 합성 디아민 O,O(옥탄-1,8-디일)비스(하이드록실아민)(이하 VL-85023이라고 함)의 미토파지 활성화 특성을 평가하기 위한 상업용 리소좀/미토콘드리아/핵 염색 키트의 활용에 대해 간략하게 설명합니다(그림 1). 염색 키트에는 이러한 소기관을 특이적으로 염색하는 리소좀/미토콘드리아/핵 표적 염료의 혼합물이 포함되어 있다23. 우리는 이전에 이 키트를 사용하여 예쁜꼬마선충23에서 1,8 디아미노옥탄(이하 VL-004라고 함)의 미토파지 활성을 입증했습니다. 중요하게도, 우리는 미토-로젤라 바이오센서와 미토콘드리아:핵 DNA 함량의 qPCR 측정으로 염색 키트 결과를 검증했습니다23. 이 염색 키트는 다음과 같은 이점을 제공합니다. 첫째, 미토콘드리아 바이오센서를 발현하는 형질전환 동물이나 세포를 생성할 필요가 없다. 따라서 우리는 변형되지 않은 야생형 동물이나 세포를 연구할 수 있으므로 많은 시간과 돈과 노동력을 절약할 수 있습니다. 또한, 언급한 바와 같이, 발현된 미토콘드리아 바이오센서는 미토콘드리아 기능을 변화시킬 수 있다. 둘째, 키트는 비용 효율적이고 사용하기 쉽고 빠릅니다. 셋째, 예쁜꼬마선충과 인간 세포에서 이 방법을 입증하지만 다른 세포 유형 및 유기체에 대해 변형될 수 있습니다.
즉, 다른 방법과 마찬가지로 염색 키트 프로토콜에는 단점이 있습니다. 예를 들어, 시약과 함께 웜의 배양은 음식이 없을 때 수행됩니다 (우리는 죽은 박테리아조차도 염색 효율을 현저히 감소시키는 것을 보았습니다). 잠복기는 비교적 짧지만 이 기간에도 미토파지를 포함한 항상성 반응이 변경될 수 있습니다. 또한, ER/미토콘드리아/핵 단백질 및 기타 생체 분자에 대한 염료의 결합은 이러한 세포 기관의 활성에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 유전자 센서를 사용한 미토파지 측정과 달리 화학적 고정을 거친 벌레 및 세포로 작업합니다. 따라서 동일한 웜/셀을 서로 다른 시간에 계속 모니터링하는 것은 불가능합니다. 따라서 특정 생리학적 과정에서 미토파지의 기능을 검증하기 위해 다양한 방법론을 결합하는 것이 좋습니다. 아래에서 우리는 VL-850이 예쁜꼬마선충 벌레와 Hep-3B 세포에서 강력한 미토파지를 유도한다는 것을 보여주는 새로운 데이터를 제시합니다. 따라서 이러한 데이터는 VL-850이 예쁜꼬마선충의 수명을 연장하고 건강한 예쁜꼬마선 충 의 유도를 통해 예 쁜꼬마선충 을 산화적 손상으로부터 보호한다는 가설을 더욱 뒷받침합니다. 우리는 강력한 미토파지 유도제24인 양성자 이오노포어 카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)을 양성 대조군으로 사용했습니다.

<table><tbody><tr><td>시약 또는 자원</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler-Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD-Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD-Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD-Difco 211705</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast 추출물</td><td>BD-Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)</td><td>시그마</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td><강한>화학</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜레스트롤</td><td>Thermo Fisher</td><td>C/5360/48</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당</td><td>생물학 산업</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>이중 증류수 (DDW)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS 열 비활성화</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>글루테라데히드 (25 %)</td> <td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼 1 M</td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>L- 글루아타민</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>리소좀/미토콘드리아/핵 염색 Cytopainter 시약</td><td>Abcam</td><td>ab139487</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>시그마</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>파라포말리데히드(16%)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15720</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188 용액</td><td>시그마</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소칼</td>륨 <td>Millipore</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Bio-Lab</td><td>1903059100</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Gadot</td><td>1310732</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 도데카하이드레이트</td><td>시그마</td><td>4273</td><td></td></tr><tr><td>테트라사이클린 하이드로클로</td>라이드 <td>시그마</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>생물학 산업</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>VL-850: 1,8-디아미노옥시-옥탄</td><td>특허<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>강력한>유리/플라스틱 일회용품</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m 주사기 필터</td><td>Millex GV</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Lifegene</td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 페트리 플레이트</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL Erlenmeyer Flask</td><td>IsoLab, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 멸균 폴리프로필렌 튜브</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 페트리 접시</td><td>Bar Naor</td><td></td><td></td>BN9015810</tr><tr><td>500개&nbsp; mL 진공 필터/저장 병 시스템, 0.22&nbsp; &뮤; m</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPE205500S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 멸균 폴리프로필렌 튜브</td><td>Lifegene</td><td>LTB50-500</td><td></td></tr><tr><td>Deckgl&auml; ser 현미경 커버 유리 24 x 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>유리 시험관 (10 mL- 13 x 100 mm) 붕규산 유리</td><td>Pyrex</td><td>99445-13</td><td></td></tr><tr><td>iBiDi 8 well &mu;-slides</td><td>iBiDi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 24 x 40 mm</td><td>Bar Naor</td><td>BN1052421ECALN</td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 이리듐 0.25 mM 와이어</td><td>World Precision Instruments</td><td>PT1002</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell counter CellDrop BF</td><td>DeNovix</td><td>CellDrop BF-UNLTD</td><td></td></tr><tr><td>Microspin FV-2400</td><td>Biosan</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk 컨포칼 현미경, DAPI, FITC 및 TRITC 필터 및 명시야, 60x CFI Plan-Apochromat Lambda 유형 렌즈(에어 렌즈) 및 NIS-Elements 소프트웨어</td> <td>포함니콘</td><td>CSU-W1</td><td></td></tr>, <tr><td>올림푸스 SZ61, 실체 현미경</td>, <td>올림푸스</td><td>SZ61</td><td></td></tr>, <tr><td>pH 측정기</td>, <td>메틀러 톨레도</td><td></td> MT30019032 <td></td></tr><tr><td>리볼버, 조정 가능한 실험실 회전 장치,</td><td>Labnet</td><td>H5600</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 기관 특이적 염료를 사용한 caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 mitophagy 검출

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

미토콘드리아는 에너지 생산, 지질 대사, 칼슘 항상성, 헴 생합성, 조절된 세포 사멸 및 활성 산소 종(ROS) 생성을 포함한 다양한 생물학적 기능에 필수적입니다. ROS는 주요 생물학적 과정에 필수적입니다. 그러나 통제되지 않으면 미토콘드리아 손상을 포함한 산화적 손상을 유발할 수 있습니다. 손상된 미토콘드리아는 더 많은 ROS를 방출하여 세포 손상과 질병 상태를 심화시킵니다. 미토콘드리아 자가포식(mitophagy)이라는 항상성 과정은 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거한 다음 새로운 미토콘드리아로 대체합니다. 여러 미토파지 경로가 있으며, 일반적인 종점은 리소좀에서 손상된 미토콘드리아의 분해입니다. 
유전자 센서, 항체 면역형광 및 전자 현미경을 포함한 여러 방법론에서 이 엔드포인트를 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 미토파지를 검사하는 각 방법은 특정 조직/세포 표적화(유전자 센서 사용) 및 매우 상세하게(전자 현미경 사용)와 같은 장점이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 종종 고가의 자원, 훈련된 인력 및 형질전환 동물을 만드는 것과 같은 실제 실험 전에 긴 준비 시간이 필요합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아와 리소좀을 표적으로 하는 상업적으로 이용 가능한 형광 염료를 사용하여 미토파지를 측정하기 위한 비용 효율적인 대안을 제시합니다. 이 방법은 선충 Caenorhabditis elegans 및 인간 간 세포에서 미토파지를 효과적으로 측정하며, 이는 다른 모델 시스템에서 잠재적인 효율성을 나타냅니다.

VL-850을 사용한 예쁜꼬 마선충 벌레와 Hep-3B 세포 모두에서 강력한 미토파지 반응 유도 VL-850은 예 쁜꼬마선충 과 인간 각질형성세포(HaCaT 세포)를 산화 스트레스로부터 보호한다23. 그 작용 메커니즘을 더 자세히 탐구하기 위해 VL-850이 예쁜꼬마선충 및 기타 인간 세포에서 미토파지를 유도하는지 여부를 조사했습니다. 이를 테스트하기 위해 예쁜꼬마선충 (젊은 성인, L1 후 3일)을 62.5μM VL-850, 5μM FCCP(양성 대조군) 및 비히클(음성 대조군)에 6시간 동안 노출시켰습니다. 상기한 바와 같이, 염색 시약을 사용하여 미토파지를 측정하였다. VL-850에 62.5μM 농도를 사용하기로 한 이유는 지렁이를 산화 스트레스로부터 보호하고 수명을 크게 연장하기 때문입니다23. VL-850은 벌레의 머리 체벽 근육에 강력...

전자 현미경, 유전자 센서 및 면역형광을 통해 미토파지를 탐색하려면 값비싼 장비, 숙련된 인력 및 상당한 시간 투자가 필요합니다. 여기에서 우리는 Caenorhabditis elegans 와 간암 세포주 모두에서 미토파지 과정을 정량화하는 상용 형광 염료 키트의 효능을 입증합니다.

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...

미토파지에 의한 손상된 미토콘드리아의 분해는 미토콘드리아 네트워크의 기능에 필수적입니다. 불행히도,이 과정은 나이가 들면서 감소합니다. 우리는 알츠하이머 병을 포함한 노화 및 노화 관련 질병에서 미토파지의 기능을 이해하기 위해 미토파지를 활성화하여 건강한 노화를 촉진하는 약물을 개발하고 사용합니다.가장 큰 과제 중 하나는 미토파지 과정에 영향을 미치지 않고 측정하는 것입니다. 최근 연구에 따르면 근육 세포의 미토콘드리아에서 GFP 발현은 MT UPR이라는 스트레스를 유발합니다. 따라서 형질전환되지 않은 동물이나 세포에 염료를 사용하는 것이 필수적이며 유전 기술을 보완합니다.우리의 프로토콜에는 세 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 형질전환 동물 또는 미토파지 바이오센서를 발현하는 세포를 생성할 필요가 없다. 둘째, 전자 현미경의 경우와 같이 값비싼 인프라와 전문 지식이 필요하지 않습니다.셋째, 세포 소기관 염료 칵테일은 상업적으로 이용 가능하며 프로토콜은 간단하고 빠릅니다. 새로운 미토파지 활성화 화합물 VL-850은 강력한 미토파지를 유도하여 산화 스트레스로부터 보호하고 수명을 연장합니다. 이제 가장 큰 문제는 기본 행동 메커니즘을 결정하는 것입니다.우리는 예쁜꼬마선충과 포유류 세포를 사용하여 세포에서 유기체에 이르기까지 여러 수준에서 메커니즘을 탐구했습니다.

detection-mitophagy-caenorhabditis-elegans-mammalian-cells-using

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

저하 및 재활용을위한 효모 공포의 산성 루멘에 organelles의 전달을 모니터링하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 인코딩 듀얼 발광 형광 산도 - 바이오 센서 및 형광 현미경을 사용하여 개별 세포의 시각화와 대상 organelles의 특정 상표에 의존합니다.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

이 비디오는 예쁜꼬마선충의 미토파지를 연구하기 위한 생체 내 분석을 보여줍니다. 선충을 미토파지 유도 약물에 노출시키면 손상된 미토콘드리아의 미토파지 수용체인 DCT-1과 자가포식체막 단백질 LGG-1 사이의 공동 국소화에 의해 미토파지의 발생을 평가합니다.

형질전환 선충에서 Mitophagy를 검출하기 위한 In Vivo 분석

골격 근육은 운동을 위해 필수적이며, 몸의 주요 단백질 저장소입니다. C. elegans의 내 근육 건강 측정이 설명되어 있습니다. 근육의 구조와 기능에 대한 전향 적 변화는 지역화 된 GFP 및 양이온 성 염료를 사용하여 평가됩니다.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해 C. 엘레

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

이 프로토콜 열 스트레스 단백질 핵 전 좌는 녹색 형광 단백질 (GFP) 퓨전 단백질 마커로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용 하 여 추적 하는 방법을 보여 줍니다 얼룩. 프로토콜을 얼룩이 DAPI 빨리 고 GFP 단백질 subcellular 지 방화 신호 유지.

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

Mitophagy, 미토 콘 드리 아, 선택적 저하 미토 콘 드 리아 항상성에 연루 되어 고 다양 한 인간 질병에 폐지. 그러나, mitophagy 활동을 측정 하기 위한 편리한 실험적인 방법을 매우 제한 됩니다. 여기, 우리는 cytometry를 사용 하 여 mitophagy 활동을 측정 하기 위한 중요 한 분석 결과 제공 합니다.

형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

미토파지는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘입니다. 그러나, 생체 내 미토파지의 평가는 신뢰할 수 있는 정량적 분석의 부족으로 인해 방해를 받는다. 여기에 제시된 것은 세포 투과성 녹색 형광 미토콘드리아 염료와 적색 형광 리소좀 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 미토파지를 관찰하기위한 프로토콜입니다.

미토콘드리아와 리소좀을 위한 형광 염료로 미토파지 시각화

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

이 프로토콜은 노화 중 예쁜꼬마선충 의 여러 조직에서 미토콘드리아 형태를 이미징하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공합니다.

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

남성에서 spermatids을 분리하고 활성화하기위한...

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

학습하세요 Caenorhabditis elegans와 Hep3B 간암 세포에서 형광 염료 키트를 활용한 미토파지 정량화 방법을. 이 기술은 노화 및 연령 관련 질병 연구에 필수적인 도구입니다.

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

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