Name: 마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: 배우세요 마우스 간의 상온 이식체 외 기계 관류 방법으로, 37도 항온 제어와 미세수술 기술을 활용하여 재현성 있는 결과를 얻습니다. 이 기법은 분자 경로 연구와 새로운 관류액 첨가제 발굴에 활용됩니다.

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이 논문을 쓰는 동안 나는 많은 지원과 도움을 받았다. 특히 제 수술 중 훌륭한 협력과 환자 지원에 대해 팀 동료 XinPei Chen에게 감사드립니다.

동물 실험은 동물 복지에 대한 현행 독일 규정 및 지침과 동물 연구 보고를 위한 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 실험 프로토콜은 독일 튀링겐의 Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz에 의해 승인되었습니다(승인 번호: UKJ - 17 - 106).
참고: 체중이 34± 4g인 수컷 C57BL/6J 마우스(평균 ± 표준 오차[SEM])를 간 기증자로 사용했습니다. 그들은 통제된 환경 조건(50% 습도 및 18 - 23 °C)에서 표준 마우스 차우와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 유지되었습니다. 수술 과정 내내 60회/분 이상의 호흡수를 유지하고, 체온을 34°C 이상으로 유지하였다.
1. 준비
<ol><li>작업 테이블 설정
	<ol><li>멸균 목적으로 모든 수술 기구와 소모품을 고압증기멸균합니다.</li>
		<li>온난화 보드 및 전기 응고를 포함한 모든 장비를 켭니다.</li>
		<li>따뜻한 인큐베이터(37°C)에 25mL 헤파린화(2,500U/L) 식염수가 담긴 50mL 주사기 1개를 넣습니다.</li>
		<li>수술 도구, 6 - 0 실크 봉합사, 멸균 소형 면 어플리케이터, 수의학 식염수(500mL), 부직포 거즈 스폰지(10cm x 10cm)를 수술대에 적절하게 놓습니다.</li>
		<li>26G 바늘을 수술대에 올려 0.5mL 미세원심분리기 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 만들어 담즙 수집을 위한 담도관을 수용합니다.</li>
		<li>캐뉼라(1Fr 폴리우레탄 캐뉼라 또는 UT - 03 폴리에틸렌 캐뉼라)와 담즙 수집을 위해 멸균된 0.5mL 미세원심분리기 튜브를 수술대에 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>자체 제작 문맥 캐뉼라
	<ol><li>집게로 2 Fr 캐뉼라를 잡고 캐뉼라 끝에서 30cm 떨어진 곳에서 1G 바늘로 벽을 뚫습니다. 바늘 끝이 보일 때까지 캐뉼라를 통해 바늘을 밀어 넣습니다.</li>
		<li>캐뉼라의 끝을 다듬어 날카로운 삼각형을 만듭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>헤파린화 식염수의 제조
	<ol><li>최종 농도가 2,500 IU/mL인 헤파린화 식염수 25mL를 준비합니다.</li>
		<li>모든 기포를 제거하고 주사기를 40°C 인큐베이터에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>관류 시스템의 시연
	<ol><li>기계 관류 시스템의 주요 구성 요소에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>오르간실 설치
	<ol><li>오르간 챔버의 레이아웃은 그림 2 를 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>관류 시스템 설정
	<ol><li>압력 모니터링을 위해 실험실 차트 프로그램을 켭니다.</li>
		<li>오르간 챔버 수준에서 압력 교정기와 압력 센서를 연결합니다.</li>
		<li>압력 교정기를 조정하여 0mmHg를 읽고 압력 제어 소프트웨어에서 해당 값을 확인합니다.</li>
		<li>압력 교정기를 20mmHg로 조정하고 압력 제어 소프트웨어에서 해당 값을 다시 확인하십시오.</li>
		<li>수조를 켜고 오르간 챔버를 40°C로 예열합니다.</li>
		<li>증류수 탈이온수로 전체 배관 시스템을 각각 30분 동안 두 번 세척하여 살균 용액이 완전히 제거되도록 합니다.</li>
		<li>철저한 소독을 위해 20분 동안 전체 시스템에 소독 용액의 순환을 시작합니다.</li>
		<li>가스 혼합물(95% 산소(O2)과 5% 이산화탄소(CO2))을 켭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>관류수 충전
	<ol><li>윌리엄스 E 배지 250mL에 소 태아 혈청 50mL, 페니실린/스트렙토마이신 3mL(1mg/mL), 인슐린 0.17mL(100IE/mL), 헤파린 0.34mL(5000U/mL), 하이드로코르티손 0.07mL(100mg/2mL)를 보충하여 완전한 Williams' E 배지를 준비합니다.</li>
		<li>동일한 부피(150mL)의 관류수를 저장소와 오르간 챔버에 추가하여 시스템을 프라이밍합니다. 알림: 충전 과정에서 무균 상태를 유지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 관류액은 폐쇄형 재순환 기계 관류의 이 두 가지 핵심 구성 요소를 통해 지속적으로 펌핑됩니다.</li>
		<li>중간 속도(15mL/분)로 연동 펌프를 켜서 산소가 공급된 매체로 관류 시스템을 프라이밍합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 간 이식
<ol><li>수술 전 준비
	<ol><li>동물의 무게를 잰다. 진통제 부프레노르핀(0.3mg/mL)(0.05mg/kg 체중)을 준비합니다.</li>
		<li>인덕션 챔버를 벽면 콘센트와 연결합니다. 산소를 0.5L/min으로 돌립니다. 이소플루란을 3%로 바꾸십시오.</li>
		<li>깊은 마취 (오른쪽 반사 양성)에 도달 할 때까지 동물을 챔버에 넣으십시오.</li>
		<li>마이크로 주사기를 사용하여 체중에 맞는 용량의 진통제를 피하 투여합니다.</li>
		<li>전기 면도기를 사용하여 복부 피부의 털을 다듬습니다.</li>
		<li>마우스를 수술대로 옮기고 이소플루란 기화기를 2.5%로 켜서 마취를 유지합니다. interdigital toe reflex를 테스트하여 마취 깊이를 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스 복부의 준비
	<ol><li>마우스를 앙와위 자세로 놓습니다.</li>
		<li>적절한 마취 깊이를 두 번 확인하기 위해 디지털 간 반사를 테스트합니다. 네 팔다리를 모두 테이프로 고정하십시오.</li>
		<li>복부의 양쪽을 겨드랑이 중간 라인까지 3 회 연속 요오드 알코올을 사용하여 소독하십시오. 부직포 멸균 거즈를 사용하여 수술 부위 주변을 덮으십시오.</li>
		<li>Metzenbaum 아기 가위와 수술용 집게를 사용하여 마우스의 복부 부위에서 검상돌기 아래 1cm 아래에 3cm 가로 절개를 합니다.</li>
		<li>피부 절개를 양쪽의 겨드랑이 선까지 양측으로 확장합니다.</li>
		<li>스프링 가위를 사용하여 linea alba를 따라 조심스럽게 2cm 세로 절개를합니다.</li>
		<li>전기 응고 및 Vannas 스프링 가위로 복부 근육층을 자릅니다.</li>
		<li>전기 응고로부터 간을 보호하기 위해 젖은 거즈를 조심스럽게 놓으십시오.</li>
		<li>관상 동맥 인대의 더 나은 노출을 위해 xiphoid 과정을 수축시키기 위해 둥근 바늘로 6-0 실크 봉합사를 사용하십시오.</li>
		<li>두 개의 리브 리트랙터를 사용하여 마우스의 복강을 완전히 노출시킵니다.</li>
		<li>젖은 면봉으로 소장을 복강 밖으로 조심스럽게 옮겨 문문을 완전히 노출시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>일반적인 담관 준비
	<ol><li>날카로운 가위로 falciform, phrenic 및 gastrohepatic ligaments를 Transect하십시오.</li>
		<li>치아가 없는 미세한 곡선 집게를 사용하여 총담관을 조심스럽게 제거합니다. 참고: 총담관은 매우 쉽게 손상되어 파손됩니다. 한 번 깨지면 캐뉼러를 사용할 수 없습니다. 해부학 적 위치의 방향으로 인해 구부러진 집게를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>다음 단계를 준비하기 위해 두 개의 6 - 0 실크 봉합사 루프를 총 담관 위에 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>일반적인 담관 캐뉼러 삽입
	<ol><li>30G 바늘로 담관을 조심스럽게 뚫습니다. 뾰족한 곡선 집게를 사용하여 담관 캐뉼러에 맞게 작은 구멍을 확대합니다.</li>
		<li>혈관 캐뉼레이션 집게를 사용하여 담관 캐뉼라를 잡고 담관으로 밀어 넣습니다.</li>
		<li>사전 설정된 6 - 0 봉합 루프로 캐뉼라를 이중으로 고정합니다. 알림: 캐뉼러 삽입 중에 담즙에 의한 저항이 느껴집니다. 힘이 잘 조절되지 않으면 담즙 유출 압력에 의해 캐뉼라가 담도 밖으로 밀려납니다. 캐뉼라의 깊이를 조심스럽게 조정하십시오. 너무 깊으면 담관이 손상될 수 있고, 충분히 깊지 않으면 빠져나갈 수 있습니다.</li>
		<li>성공적인 캐뉼라 삽입 후 캐뉼라의 담즙 흐름을 관찰하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>문맥 준비
	<ol><li>편평한 집게로 문맥을 고정하고 구부러진 집게로 결합 조직을 조심스럽게 풀어줍니다. 문맥이 찢어지지 않도록 세게 당기지 마십시오. 문맥이 손상되면 문맥을 다시 캐뉼러링하기가 어렵습니다.</li>
		<li>분기점보다 약간 우수한 PV를 해부하고 나중에 사용할 수 있도록 합류점에 가까운 PV에 6 - 0 실크 봉합사를 사용하여 첫 번째 봉합사 루프를 배치합니다.</li>
		<li>PV의 나중에 고정을 위해 두 번째 봉합사 루프를 가능한 한 간 문에 가깝게 배치합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>문맥 캐뉼라 삽입
	<ol><li>동맥 클립을 사용하여 원위 문맥을 닫습니다.</li>
		<li>매우 조심스럽게 위의 문맥 캐뉼라 중 하나로 문맥을 뚫습니다. 성공적인 천자 후 캐뉼라 내에서 혈류를 명확하게 관찰 할 수 있습니다.</li>
		<li>미리 배치된 6 - 0 봉합 루프로 PV 캐뉼라를 고정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>간 홍조
	<ol><li>이소플루란을 5%로 늘리고 이소플루란 흡입의 과다 복용으로 마우스를 안락사시킵니다.</li>
		<li>인큐베이터에서 예열 된 헤파린 식염수를 섭취하십시오. 헤파린화 식염수 내부에 형성된 모든 기포를 제거합니다.</li>
		<li>예열 된 헤파린 처리 식염수로 주사기를 주사기 펌프에 고정하십시오.</li>
		<li>주사기 펌프의 연장 튜브를 문맥의 캐뉼라에 연결하고 속도를 2mL/min으로 조정한 후 간 세척을 시작합니다.</li>
		<li>홍조 절차가 끝날 때 간색을 관찰하십시오. 색이 균질한 노란색으로 변하면 간을 절제하십시오.</li>
		<li>횡격막, 간상하 대정맥, 간대정맥, 간동맥, 원위 문맥 및 나머지 결합 조직을 절제합니다.</li>
		<li>간을 페트리 접시에 넣으십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 간과 챔버 연결
<ol><li>간 이식
	<ol><li>페트리 접시를 사용하여 간을 장기 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.</li>
		<li>간이 마르지 않도록 페트리 접시에 소량의 식염수를 보관하십시오. 참고: 이 과정에서 문맥과 담관이 쉽게 뒤틀릴 수 있으며, 이는 간 관류 및 담즙 수집에 영향을 줄 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>문맥 캐뉼라 연결
	<ol><li>주사기로 문맥 캐뉼라에 생리 식염수를 천천히 주입하여 캐뉼라의 기포를 배출합니다.</li>
		<li>문맥 캐뉼라를 장기 챔버의 관류액 유출 튜브에 연결합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>담관 캐뉼라 연결
	<ol><li>장기 챔버에 연결된 고무 캡의 밸브를 통해 마우스 담관 캐뉼라를 안내합니다.</li>
		<li>담관 캐뉼라를 뚜껑에 작은 구멍이 있는 미리 준비된 0.5mL 마이크로튜브에 삽입합니다.</li>
		<li>오르간 챔버 외부의 점토에 마이크로튜브를 놓습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. PV 압력에 따라 유량 조정
<ol><li>연동 펌프를 1mL/분으로 켭니다.</li>
	<li>문맥 압력 판독값을 확인하여 유속을 조정하십시오.</li>
	<li>유속을 조절하여 문맥압을 7 - 10 mmHg 사이의 생리학적 범위로 유지한다. 알림: 공칭 유량은 튜브의 사용 및 위치에 따라 약간 다를 수 있습니다.</li>
</ol>5. 시료 채취
<ol><li>문맥 유입 튜브에서 입구 관류액 샘플을 얻고 기관 챔버에서 3시간 간격으로 출구 관류액 샘플을 얻습니다.</li>
	<li>12시간의 관류 기간이 끝날 때 조직학적 분석을 위해 모든 간엽에서 샘플을 수집합니다.</li>
</ol>

공개할 재정적 이해 상충이 없습니다.

프로토콜의 중요한 단계 간 이식의 두 가지 중요한 단계는 문맥의 캐뉼라 삽입(PV)과 후속 담관 캐뉼라(BD)입니다. 이러한 단계는 성공적인 장기 회수 및 후속 관류 또는 이식 절차를 보장하는 데 가장 중요합니다.
도전과 해결책 PV 캐뉼러는 혈관벽의 손상, 카테터의 변위 및 삽입 과정의 실행 가능성이라는 세 가지 문제를 제시합니다. PV 혈관 벽의 섬세한 특성으로 인해 캐뉼러 삽입 중에 조심스럽게 다루지 않으면 구멍이 뚫리고 출혈이 발생하기 쉽습니다. 또한 PV로 인한 혈액 손실은 문맥압을 감소시켜 PV 캐뉼라 삽입을 더 어렵게 만듭니다. 또한, 문맥 정맥벽의 손상은 간내 혈관계에 공기 색전을 도입할 수 있습니다. 따라서 PV 캐뉼라 생성 과정에서 정밀하고 주의를 기울이는 것은 합병증의 위험을 최소화하는 데 중요합니다.
PV 캐뉼러 삽입 중에 카테터 변위 위...

간 이식은 말기 간 질환이 있는 개인을 위한 황금 표준 치료법입니다. 유감스럽게도 기증자 장기에 대한 수요가 가용 공급을 초과하여 심각한 부족 현상이 발생합니다. 2021년에는 약 24,936명의 환자가 간 이식 대기자 명단에 올랐고 9,234건의 이식만이 성공적으로 수행되었습니다1. 간 이식편의 수요와 공급 사이의 상당한 격차는 기증자 풀을 넓히고 간 이식편의 접근성을 향상시키기 위한 대체 전략을 조사해야 할 시급한 필요성을 강조합니다. 기증자 풀을 확장하는 한 가지 방법은 한계 기증자를 사용하는 것입니다2. 한계 기증자에는 고령, 중등도 또는 중증 지방증이 있는 사람이 포함됩니다. 한계 장기의 이식이 유리한 결과를 가져올 수 있지만 전반적인 결과는 차선책으로 남아 있습니다. 결과적으로, 한계 기증자의 기능을 향상시키기위한 치료 전략의 개발이 현재 진행 중이다 3,4.
전략 중 하나는 기계 관류, 특히 정상 체온 산소 기계 관류를 사용하여 이러한 변연 기관의 기능을 향상시키는 것입니다5. 그러나 정상 체온 산소 기계 관류(NEVLP)의 유익한 효과의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 이해는 여전히 제한적입니다. 유전자 변형 균주를 풍부하게 이용할 수 있는 마우스는 분자 경로를 조사하기 위한 귀중한 모델 역할을 합니다. 예를 들어, 간 허혈-재관류 손상을 완화하는 데 있어 자가포식 경로의 중요성이 점점 더 인식되고 있습니다 6,7. 간 허혈-재관류 손상에서 중요한 분자 경로 중 하나는 miR-20b-5p/ATG7 경로8입니다. 현재, 다수의 ATG 녹아웃 및 조건부 녹아웃 마우스 균주가 이용 가능하지만, 상응하는 쥐 균주는 없다9.
이러한 배경을 바탕으로 마우스 간 이식을 위한 소형화된 NEVLP 플랫폼을 생성하는 것이 목표였습니다. 이 플랫폼은 기증자의 간 기능 향상을 목표로 하는 잠재적인 유전자 변형 전략의 탐색 및 평가를 용이하게 합니다. 또한 시스템이 장기 관류에 적합하여 일반적으로 "장기 복구"라고 하는 간의 생체 외 치료가 가능해야 했습니다.
마우스 간 관류에 대한 관련 시험관 내 데이터의 제한된 가용성을 고려하여 문헌 검토는 쥐에서 수행된 연구에 초점을 맞췄습니다. 2010년부터 2022년까지의 문헌에 대한 체계적인 검색은 "정상 체온 간 관류", "생체 외 또는 시험관 내" 및 "쥐"와 같은 키워드를 사용하여 수행되었습니다. 이 검색은 설치류에서 최적의 조건을 식별하여 가장 적절한 접근 방식을 결정할 수 있도록하는 것을 목표로했습니다.
관류 시스템은 밀폐된 방수 유리 버퍼 저장소, 연동 롤러 펌프, 산소 공급기, 버블 트랩, 열교환기, 오르간 챔버 및 폐쇄형 사이클링 튜브 시스템으로 구성됩니다(그림 1). 이 시스템은 전용 온도 조절기를 사용하여 37°C의 일정한 관류 온도를 정밀하게 유지합니다. 연동 롤러 펌프는 회로 전체에 걸쳐 관류물의 흐름을 구동합니다. 관류 회로는 절연된 워터 재킷 저장소에서 시작됩니다. 그 후, 관류액은 전용 가스통에서 95% 산소와 5% 이산화탄소의 가스 혼합물을 받는 산소 공급기를 통해 전달됩니다. 산소 공급 후, 관류액은 버블 트랩을 통과하며, 여기서 갇힌 버블은 연동 펌프에 의해 저장소로 다시 리디렉션됩니다. 나머지 관류액은 열교환기를 통해 흐르고 오르간 챔버로 들어가 저장소로 돌아갑니다.
여기에서 우리는 마우스 간을 위한 NEVLP를 확립한 경험을 보고하고 산소 운반체 없이 산소가 함유된 배지를 사용하여 수행된 파일럿 실험의 유망한 결과를 공유합니다.

<table><tbody><tr><td>0.5 ml 마이크로 튜브 PP</td><td>Sarstedt</td><td>72699</td><td></td></tr><tr><td>1 Fr 고무 캐뉼라</td><td>Vygon</td><td>샘플 캐뉼라</td><td></td></tr><tr><td>10 &마이크로; L 마이크로 주사기</td><td>해밀턴</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>2 fr 고무 캐뉼라</td><td>Vygon</td><td>샘플 캐뉼라</td><td></td></tr><tr><td>24g 버터플라이 캐뉼라</td><td>테루모</td><td>SR+OF2419</td><td></td></tr><tr><td>26G 버터플라이 캐뉼라</td><td>테루모</td><td>SR+DU2619WX</td><td></td></tr><tr><td>30g 피하 주사 바늘</td><td>스테리칸</td><td>100246</td><td></td></tr><tr><td>50ml 주사기 펌프</td><td>브라운</td><td>110356</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Seide</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>동맥 클립</td><td>Braun</td><td>BH014R</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 가능한 촉촉한 챔버</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4733</td><td></td></tr><tr><td>큰 면 애플리케이터&nbsp;</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974018</td><td></td></tr><tr><td>버블 트랩</td><td>Hugo-Sachs-Elektronik</td><td>V83163</td><td></td></tr><tr><td>Buprenovet (0.3 mg / ml)</td><td>Elanco</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>CIDEX OPA 용액 (2 L)</td><td>Cilag GmbH</td><td>20391</td><td></td></tr><tr><td>단극 절단용 전기 수술 장치 VIO&reg; 50 C</td><td>ERBE</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum(500 ml)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>가스 혼합물 (95 % 산소 및 5 % 이산화탄소)</td><td>주택 공급</td> <td>/</td><td></td></tr> <tr><td>난방 순환 욕조</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>75-0310</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 5000 (IE / 5 ml)</td><td>Braun</td><td>1708.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)</td><td>Pfizer</td><td>15427276</td><td></td></tr><tr><td>Insulin(100 IE / ml)</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>홍채 가위&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (250 ml)</td><td>Cp-Pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>막 산소공급기</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>T18728</td><td></td></tr><tr><td>미세수술 현미경&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>마우스 리트랙터 세트&nbsp;</td><td>Carfil 품질</td><td>180000056</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT</td><td>하마마츠</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>비짠 스폰지&nbsp;</td><td>Kompressen</td><td>866110</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토 마이신 (1 mg / ml)&nbsp;</td><td>C.C.Pro</td><td>Z-13-M</td><td></td></tr><tr><td>관류 연장 튜브 (30 cm)</td><td>Braun</td><td>4256000</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>P-70</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishc 100x15 mm</td><td>VWR&reg;</td><td>391-0578</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (Vet-Sep 스프레이)</td><td>Livisto</td><td>799-416</td><td></td></tr><tr><td>압력 변환기 시뮬레이터</td><td>UTAH Medical Products</td><td>650-950</td><td></td></tr><tr><td>재사용 가능한 혈압 변환기</td><td>AD 기기</td><td>MLT-0380/D</td><td></td></tr><tr><td>S & T Vessel 캐뉼레이션 펜치</td><td>파인 사이언스 기구</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>스몰 코튼 애플리케이터</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>직선 펜치 10 cm&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>봉합사 묶는 집</td>게 <td>Fine Science Instruments</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>주사기 50ml Original Perfusor</td><td>Braun</td><td>8728810F-06</td><td></td></tr><tr><td>UT - 03 Cannula</td><td>Unique Medical, Japan</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Veterinary Saline (500 ml)</td><td>WDT</td><td>18X1807</td><td></td></tr><tr><td>워터 재킷 리저버&nbsp; 2 L</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>73-3441</td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium (500 ML)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 normothermic ex vivo 간 기계 관류

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

이 프로토콜은 마우스 간을 사용하여 최적화된 적혈구가 없는 NEVLP 시스템을 제공합니다. 마우스 간의 생체 외 보존은 변형된 캐뉼라와 기존의 상업용 생체 외 관류 장비에서 채택된 기술을 사용하여 달성되었습니다. 이 시스템은 12시간의 관류 후 보존 결과를 평가하는 데 활용되었습니다. C57BL/6J 마우스를 간 기증자로 사용하였고, 간을 문맥(PV)과 담관(BD)에 캐뉼라(cannul)시킨 후, 따뜻한(37°C) 헤파린화된 식염수로 장기를 세척하여 이식하였다. 이어서, 이식된 간을 관류실로 옮기고 정상 체온 산소화 기계 관류(NEVLP)를 실시했습니다. 관류액 분석을 위해 입구 및 출구 관류액 샘플을 3시간 간격으로 수집했습니다. 관류가 완료되면 조직학적 분석을 위해 간 샘플을 얻었고, Hematoxylin-Eosin(HE) 염색을 통해 변형된 Suzuki-Score를 사용하여 형태학적 완전성을 평가했습니다. 최적화 실험은 다음과 같은 결과를 산출했다 : (1) 30 g 이상의 마우스는 담관 (BD)의 크기가 더 크기 때문에 실험에 더 적합한 것으로 간주되었다. (2) 2 Fr (외경 = 0.66 mm) 폴리우레탄 캐뉼라는 폴리프로필렌 캐뉼라와 비교할 때 문맥 캐뉼라(PV)를 캐뉼레이팅하는 데 더 적합하였다. 이는 폴리우레탄 소재의 향상된 그립감으로 인해 신체에서 장기 챔버로 이동하는 동안 카테터 미끄러짐이 감소했기 때문입니다. (3) 담관(BD)의 캐뉼라의 경우, 1 Fr(외경 = 0.33 mm) 폴리우레탄 캐뉼라가 폴리프로필렌 UT-03(외경 = 0.30 mm) 캐뉼라에 비해 더 효과적인 것으로 나타났다. 이 최적화된 프로토콜을 사용하여 마우스 간은 조직학적 구조에 큰 영향을 미치지 않고 12시간 동안 성공적으로 보존되었습니다. 헤마톡실린-에오신(HE) 염색은 간에서 잘 보존된 형태학적 구조를 나타냈으며, 이는 명확하게 보이는 핵과 간 정현파의 경미한 확장을 가진 주로 생존 가능한 간세포를 특징으로 합니다.

외과 절차의 확립 이 실험에는 총 17마리의 동물이 활용되었다: 14마리의 마우스는 문맥(PV) 및 담관(BD)의 캐뉼라 삽입을 포함하여 장기 조달 과정을 최적화하기 위해 사용되었고, 3마리의 마우스는 절차를 검증하는 데 사용되었다(표 1). 조직학적 결과(도 3)는 최적의 관류 조건의 식별을 용이하게 하기 위해 비교되었다.
관류액의 선택 이전에 활용된 간세포 배양 배지를 본 연구를 위해 선택하였다10,11. 윌리엄스 E 배지는 처음에 윌리엄스와 건에 의해 성숙한 쥐 간 상피 세포의 장기간 시험관 내 배양을 위한 혈청 환원 배지로 설계되었다12. 그럼에도 불구하고,...

정상 체온 생체 외 간 관류(NEVLP) 시스템이 마우스 간을 위해 만들어졌습니다. 이 시스템은 미세 수술에 대한 경험이 필요하지만 재현 가능한 관류 결과를 허용합니다. 마우스 간을 활용하는 능력은 새로운 관류액 첨가제를 식별하기 위한 분자 경로의 조사를 용이하게 하고 장기 복구에 중점을 둔 실험의 실행을 가능하게 합니다.

마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

마우스의 Normothermic ex-vivo 간 기계 관류. Normothermic 산소화 간 관류는 한계 장기를 구출하는 유망한 전략이며 최근 임상 실습에 도입되었습니다. 그러나 기본 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다.형질전환 마우스와 같은 유전자 변형 동물을 활용하여 분자 경로를 추가로 연구하기 위해서는 마우스 모델이 필요하므로 마우스 간을 위한 정상 체온 산소 기계 관류 시스템 구축을 기다리고 있습니다. 다음은 전체 시스템의 구성표입니다. 첫째, 전체 시스템은 물 순환을 통해 자동 온도 조절 컨트롤러에 의해 섭씨 37도에서 제어됩니다.관류액은 연동 펌프에 의해 저장소에서 산소 공급기로 펌핑됩니다. 산소 공급기에는 95 % 산소와 5 % 이산화탄소의 중단없는 가스 흐름이 있습니다. 그런 다음 관류액은 버블 트랩을 통과합니다.기포가있는 관류액은 압력 하에서 저장소로 다시 펌핑됩니다. 나머지 관류액은 튜브가 문맥에 연결된 장기 챔버로 흐릅니다. 관류액은 간에서 간상 카바를 통해 장기 챔버로 배출됩니다.오르간 챔버에서 유출된 관류액은 연동 펌프에 의해 저장소로 다시 보내집니다. 담즙 배액관은 담즙을 수집하기 위해 장기 챔버에 연결됩니다. 이것은 우리의 수술대입니다.모든 수술은 현미경으로 이루어집니다. 우리는 수술 절차 전반에 걸쳐 반 멸균 작동 조건을 유지합니다. 집게로 프렌치 튜브 캐뉼라를 잡으십시오.캐뉼라 끝에서 1cm 떨어진 곳에 30G 바늘로 캐뉼라 벽을 관통합니다. 바늘 끝이 보일 때까지 캐뉼라를 통해 바늘을 밀어 넣습니다. 다음은 26G 카테터와 자체 제작 캐뉼라의 비교 사진입니다. 둘 다 마우스 포털 캐뉼라에 적합합니다.25 밀리리터의 헤파린 처리 식염수를 2, 500 국제 단위 / 밀리리터의 최종 농도로 준비하고 섭씨 40도에 설정된 인큐베이터에 주사기를 놓습니다. 다음은 생체 외 정상 체온 기계 관류 시스템의 주요 구성 요소입니다. 구성 요소에는 주로 오르간 챔버, 자동 온도 조절 기계, 롤러 펌프, 산소 공급기 및 저장소가 포함됩니다.여기에서 오르간 챔버의 자세한 설정을 볼 수 있습니다. 기본적으로 오르간 챔버 본체, 압력 센서, 열교환기, 버블 트랩으로 구성되어 있습니다. 우리는 관류수 입구, 관류수 배출구 및 담즙 배수구를 설치했습니다.이것은 문맥 압력을 모니터링하는 데 사용하는 ADI 모니터링 시스템입니다. ADI 시스템은 압력 센서, 중앙 컨트롤러 및 디스플레이로 구성됩니다. 압력 모니터링을 위해 LabChart 프로그램을 켭니다.압력 센서를 사용하기 전에 보정 및 영점 조정이 필요합니다. 0mm 수은과 20mm 수은을 표시로 사용하여 2단계 교정을 위해 압력 센서를 교정합니다. 문맥 압력의 지속적인 모니터링을 기반으로 압력 변화에 따라 문맥 플루란을 조정할 수 있습니다.시스템을 프라이밍하기 위해 저장소와 오르간 챔버에 동일한 양의 관류액이 있을 때, 충전 과정에서 무균 상태를 유지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 인덕션 챔버를 벽면 콘센트와 연결합니다. 산소를 분당 0.5 리터로 돌립니다.이소플루란을 3%로 돌리고 깊은 마취에 도달할 때까지 동물을 챔버에 넣습니다. 마이크로 주사기를 사용하여 체중에 맞는 용량의 진통제를 바르십시오. 여기에 7 마이크로 리터의 부 프레 노르 핀이 있습니다.이제 수술을 시작합니다. 마우스의 복부를 가로 절개하십시오. 피부 절개는 양쪽의 양측 고기 겨드랑이 라인까지 확장됩니다.linea alba를 따라 조심스럽게 세로 절개를하십시오. 전기 응고와 가위로 복부 근육층을 자릅니다. 전기 응고로부터 간을 보호하기 위해 젖은 거즈를 조심스럽게 놓으십시오.마우스의 복강을 완전히 노출시킵니다. 젖은 면봉으로 소장을 복강 밖으로 조심스럽게 옮겨 문문을 완전히 노출시킵니다. 여기에 표시된 것은 문맥 캐뉼라 및 담관 캐뉼라의 개략도입니다.기본적으로 마우스의 크기에 따라 적절한 캐뉼라를 선택하고 캐뉼라 고정을 위해 6-0 실크 봉합사를 사용합니다. 치아가 없는 미세한 곡선 집게를 사용하여 총담관을 조심스럽게 제거합니다. 총 담관은 매우 쉽게 손상되고 부서집니다.한 번 깨지면 캐뉼러를 사용할 수 없습니다. 해부학 적 위치의 방향으로 인해 구부러진 집게가 작동하기 쉽습니다. 다음 단계를 준비하기 위해 총 담관 위에 두 개의 6-0 실크 봉합사 루프를 놓습니다.30G 바늘로 담관을 조심스럽게 뚫습니다. 뾰족한 곡선 집게를 사용하여 작은 구멍을 확대하여 담관 캐뉼러를 공급할 수 있습니다. 담관 캐뉼라를 가로질러 혈관 캐뉼레이션 집게를 사용하여 담관으로 밀어 넣습니다. 메모.캐뉼라의 순간에, 당신은 담즙에 의해 가져온 저항을 느낄 것입니다. 힘이 잘 조절되지 않으면 담즙 유출 압력에 의해 캐뉼라가 담도 밖으로 밀려납니다. 캐뉼라의 깊이를 조심스럽게 조정하십시오.너무 깊으면 담관이 손상될 수 있고, 충분히 깊지 않으면 빠져나갈 수 있습니다. 담즙 흐름은 성공적인 캐뉼라 삽입 후 캐뉼라에서 관찰 될 수 있습니다. 편평한 집게로 문맥을 고정하고 구부러진 집게로 결합 조직을 조심스럽게 풀어줍니다.문맥이 찢어지지 않도록 여기를 세게 당기지 마십시오. 문맥이 손상되면 문맥을 캐뉼러로 고정하기가 어렵습니다. 자유 문맥 위에 두 개의 6-0 실크 봉합사 루프를 놓습니다.동맥 클립을 사용하여 원위 문맥을 닫습니다. 위의 문맥 캐뉼라 중 하나로 문맥을 매우 조심스럽게 뚫습니다. 성공적인 천자 후 캐뉼라 내에서 혈류를 명확하게 관찰 할 수 있습니다.인큐베이터에서 예열 된 헤파린 식염수를 섭취하십시오. 모든 기포를 제거하십시오. 예열된 헤파린 처리 식염수로 주사기를 주사기 펌프에 고정합니다.주사기 펌프의 연장 튜브를 문맥의 캐뉼라에 연결하십시오. 속도를 분당 2 밀리리터로 조정하고 간 홍조를 시작하십시오. 이소플루란을 5%로 늘리고 과다 복용 이소플루란 흡입으로 마우스를 안락사시킵니다.홍조 절차가 끝날 때 간색을 관찰하십시오. 색이 균질한 노란색으로 변하면 간을 절제하십시오. 페트리 접시를 사용하여 간을 장기 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.간이 부서지는 것을 방지하기 위해 페트리 접시에 소량의 식염수를 보관하십시오. 메모. 이 과정에서 문맥과 담관이 쉽게 뒤틀릴 수 있으며, 이는 간 관류 및 담즙 수집에 영향을 줄 수 있습니다. 주사기로 문맥 캐뉼라에 생리 식염수를 천천히 주입하여 캐뉼라의 기포를 배출합니다.문맥 캐뉼라를 장기 챔버의 관류액 유출 튜브에 연결합니다. 마우스 담관 캐뉼라는 고무 캡으로 닫힌 장기 챔버의 밸브를 통해 안내됩니다. 그런 다음 담즙 튜브를 리드에 작은 구멍이있는 미리 준비된 0.5 밀리리터 마이크로 튜브에 삽입합니다.모든 것이 연결되면 연동 펌프를 켭니다. 문맥 압력 판독값을 확인하여 유속을 조정하십시오. 유속을 조정하여 문맥 압력을 7에서 10mm 수은 사이로 유지하십시오. 메모.공칭 유량은 튜브의 수명과 위치에 따라 약간 달라질 수 있습니다. 이것은 정상 체온 산소화 쥐 간 기계 관류 연구의 문헌 정밀 검사를 기반으로 한 관류액 배지, 관류액 부피 및 관류 압력의 선택입니다. 이것은 마우스 관류 모델을 확립하기 위한 단계별 시험입니다.가장 적합한 카테터를 선택하는 데 약 14 번의 실험이 필요했습니다. 우리 손에는 문맥에 2 개의 프랑스 고무 카테터를 사용하고 담관에 1 개의 프랑스 고무 카테터를 사용하는 것이 모든 카테터가 제자리에 있는 상태에서 균일한 관류를 달성하는 가장 좋은 조합입니다. pH 수준 및 칼륨 수준은 12시간 관류 전체에 걸쳐 안정하였다.pH 수준은 7.26 내지 7.71 범위였고, 칼륨 수준은 리터당 5.9 내지 6.8 밀리몰이었다. HE 염색은 12시간 관류 후 마우스 간의 조직학적 완전성이 비교적 잘 보존되었음을 보여줍니다. 종합하면, 우리는 여기에서 마우스 간을 위한 정상 체온 산소 기계 관류 시스템의 성공적인 구축을 입증했습니다.12 시간 동안 마우스 간을 관류하면 전체 장기에 걸쳐 있지는 않지만 간 형태가 잘 보존되었습니다. 장기간에 걸쳐 완전한 균질 관류를 달성하기 위해서는 더 많은 노력이 필요합니다. 이것이 달성되면, 염증의 역할을 조사하기 위해 IL-2- 녹아웃 마우스를 사용하는 것과 같이 유전자 변형 동물의 사용을 고려할 수 있습니다.

normothermic-ex-vivo-liver-machine-perfusion-in-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

동물 장기 생리학에 대한 연구는 실험적인 생체 외 관류 시스템을 수행하여 달성할 수 있습니다. 이전에 개발한 생체 외 간 관류 모델에 항상성 기관인 돼지 신장을 추가하는 것은 더 나은 생리학적 환경을 달성하기 위한 주요 단계가 될 수 있습니다.

자가 생체 외 관류 돼지 간-신장 실험 단계

지방산 간, 오래된 기증자로부터 이식, 또는 심장 죽음 (DCD) 후 검색 간장 등의 한계 이식 만이 저조한 기존의 차가운 정적 스토리지를 허용. 우리는 이전에 이식 한계 간 이식의 보존, 평가, 수리 subnormothermic 생체 간 관류의 새로운 모델을 개발했다.

Subnormothermic의 기술<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 간 스토리지, 평가를위한 관류 및 한계 간 이식의 수리

여기에서 우리는 기증자 간 이식의 산소 전 현장 기계 관류를 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 조달 및 기계 관류에 대한 간 이식을 준비, 관류 액, 주요 관류 시스템을 준비하고 간 이식의 산소 정상 체온 기계 관류를 수행하는 단계 프로토콜에 의해 단계가 포함되어 있습니다.

기증자의 간을의 현지 외 정상 체온 기계 관류

우리는 subnormothermic 온도 (21 ° C에서)에서 인간의 간 이식의 생체 기계 관류하는 방법을 설명합니다.

Subnormothermic 기계 관류의 수단으로 기능 인간의 간 보존 및 복구

상당한 간 기증자 부족 이며 간 기증자에 대 한 기준을 확대 했습니다. Normothermic ex vivo 간 관류 (NEVLP)를 평가 하 고 장기의 기능을 수정 개발 되었습니다. 이 연구 NEVLP의 쥐 모델을 보여 줍니다 고 간 보존 부상 완화 pegylated catalase의 능력을 테스트 합니다.

Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

이 프로토콜은 포털 정맥 관류를 통한 대사 연구를 위해 손상되지 않은 마우스 간을 절제하는 간단한 방법을 설명합니다.

Ex Vivo 마우스의 포털 정맥을 통한 간 관류

여기에 설명된 간 정상열 기계 관류(NMP)의 돼지 모델은 보존 전략, 생존력 평가 도구 및 장기 복구를 위한 플랫폼으로서 NMP를 연구하는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 이는 높은 번역 가치를 지니고 있지만 기술적으로 까다롭고 노동 집약적입니다.

Porcine Normothermic 격리 간 관류

여기에서는 기존 플랫폼의 높은 비용과 제한된 유연성을 극복하도록 설계된 오픈 소스의 수정 가능한 규범 보온 외 관류 시스템에 대한 프로토콜을 제시하여 전임상 생물 의학 연구에서 보다 접근하기 쉽고 비용 효율적이며 반복적인 사용을 가능하게 합니다.

연구 과학자를 위해 설계된 오픈 소스 normothermic 관류 시스템

이 비디오는 동적으로 변화하는 표면의 조밀한 3D 측정을 제공하는 디지털 프린지 프로젝션 기술의 기초를 설명합니다. 또한 이러한 기술을 기반으로 하는 고속 이진 디포커스 시스템의 설계 및 작동을 보여줍니다.

디지털 프린지 프로젝션 기술을 사용한 고해상도, 고속, 3차원 비디오 이미징

수평 및 수직 특히 전기 액체 브리지는 강도 높은 전기장의 극성 유전체 액체의 상호 작용을 탐구하기위한 간단하고 강력한 도구입니다. 기본 장치와 (예를 들면, 물, DMSO, 및 글리세롤)이 제시된다 세 액체 열 감지 이미지를 포함한 동작의 예들의 구조.

폴라 유전체 액체에서 특히 전기 교량의 준비

배우세요 마우스 간의 상온 이식체 외 기계 관류 방법으로, 37도 항온 제어와 미세수술 기술을 활용하여 재현성 있는 결과를 얻습니다. 이 기법은 분자 경로 연구와 새로운 관류액 첨가제 발굴에 활용됩니다.

마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류

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