Name: 전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 배우세요 전기량 미세호흡계를 사용하여 Drosophila melanogaster의 산소 소비량을 측정하는 방법을. CASK 돌연변이체의 대사율 변화를 분석하여 유전적 요인이 생리에 미치는 영향을 규명합니다.

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애리조나 대학의 Linda Restifo 박사가 CASK 돌연변이의O2 섭취 테스트를 제안하고 CASK 돌연변이와 그 유전자 대조군을 보내준 것에 대해 감사드립니다. 출판비는 University of College Park의 생물학과에서 부서별 재투자 기금으로 제공되었습니다. 공간과 일부 장비는 Shady Grove의 대학에서 제공했습니다.

1. 파리 사육 및 수집
<ol><li>파리를 25°C에서 표준 초파리 먹이가 들어 있는 좁은 유리병에 보관합니다. 참고: 각 유전자형의 샘플 크기는 최소 9개의 복제로 구성되어야 하며, 각 복제는 아래에 설명된 대로 15-25마리의 파리를 포함하는 단일 호흡계 챔버로 구성됩니다.</li>
	<li>2-3일마다 파리를 옮깁니다.</li>
	<li>파리를 CO2로 마취하고, 각 유전자형의 15-25 남성 그룹을 수집하고, 각 그룹을 신선하고 효모가 없는 식품 바이알에 넣습니다. 참고: 수컷은 생식 상태로 인한 변동성을 줄이기 위해 사용되었습니다. 이 방법은 남녀 모두에게 적용됩니다.</li>
	<li>파리가 25 ° C에서 최소 24 시간 동안 회복되도록하십시오. 참고: 실험 시점까지 파리는 1-4일 된 상태여야 합니다. 1.3단계에서 설명한 수집 빈도는 파리의 연령 범위를 좁히기 위해 설정할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 호흡계 챔버 설치 및 조립
<ol><li>수조를 켜고 실험에 원하는 온도로 설정합니다. 참고: 아래 실험은 50mL 슐렝크 튜브를 챔버로 사용하여 25°C에서 수행되었습니다. 구성 요소는 그림 1A, 1B 및 1C와 같이 조립해야 합니다.</li>
	<li>실험실 물티슈에 70% 에탄올을 분사하고(조인트에 직접 뿌리지 않음) 센서 플러그에서 먼지와 오래된 그리스를 닦아 챔버와 센서 플러그의 연마된 유리 조인트를 철저히 청소합니다(그림 1A). 새 실험실 물티슈로 에탄올을 닦아냅니다.</li>
	<li>정수에 적신 면봉 1cm 조각을 챔버 바닥에 놓아 습도를 안정화합니다.<ol><li>충분한 물(~0.5mL)을 추가하여 면봉 바닥에 작은 웅덩이를 만듭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>챔버 조인트에 엎질러진 물을 닦아냅니다.</li>
	<li>깔때기를 사용하여 파리를 라벨이 붙은 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.<ol><li>면봉으로 튜브를 막습니다. 참고: 튜브는 5mL 폴리프로필렌 시험관으로 구성되며, 길이 5.5cm로 자르고 뜨거운 칼로 구멍을 뚫어 실험 챔버와 공기를 자유롭게 교환할 수 있습니다. CO2 마취는 대사 이상을 유발하는 것으로 알려져 있으므로 파리를 잃지 않도록 더 많은주의가 필요한 마취없이 파리를 옮깁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>파리가 있는 환기 튜브 하나를 각 호흡계 챔버(젖은 면 위)에 추가합니다.</li>
	<li>소다 석회 카트리지(튜브당 4-5개의 펠릿)를 채우고 챔버 내부에 파리가 있는 튜브 상단에 놓습니다. 알림: 소다 석회 카트리지는 전동 드릴로 800-4번 천공된 5μL 원심분리기 튜브로 구성됩니다.</li>
	<li>O2 발전기를 통풍구 수준 아래에 포화 황산구리(CuSO4) 용액으로 채우십시오. 알림: O2 발전기는 나사산 아래에 4개의 구멍이 뚫린 나사 캡 원심분리기 튜브로 구성됩니다. 백금(Pt) 및 구리(Cu) 전극은 2핀 커넥터에 납땜되고 캡에 뚫린 구멍에 삽입되고 에폭시로 부착됩니다. CuSO4 의 전기 분해는 실험 유기체에 의해 소비 된 O2 를 생성합니다. CuSO4 는 무척추 동물에게 유독하므로 유출이나 누출을 피하고 즉시 청소하십시오.</li>
	<li>채워진 O 2 발생기를 센서 플러그의2 핀 커넥터에 연결합니다. 알림: 구리 음극은 컨트롤러의 음극 출력과 백금 양극을 양극선에 연결해야 합니다. 반대로 연결하면 실험이 실패합니다.</li>
	<li>센서 플러그의 접지 유리 조인트의 반대쪽에 투명한 실리콘 그리스 두 개를 살짝 묻힙니다.</li>
	<li>플러그를 챔버에 삽입하고 플러그(또는 챔버)를 적당한 압력으로 돌려 조인트에 그리스를 퍼뜨립니다.<ol><li>실험실 물티슈로 과도한 그리스를 닦아냅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플라스틱 켁 클램프를 조인트에 끼워 챔버에 플러그를 고정합니다. 조립된 챔버는 그림 1C와 같아야 합니다.</li>
	<li>그날의 실험에 사용된 챔버 수에 대해 위의 단계를 반복합니다. 참고: 기록할 수 있는 챔버의 수는 사용 가능한 챔버, 컨트롤러 및 컴퓨터에 대한 USB 입력의 수에 의해 제한됩니다. 본 실험에서는 일반적으로 7개의 챔버를 병렬로 실행했습니다. 돌연변이와 같은 실험용 파리는 적절한 대조군과 일치해야 합니다. 환경 변화에 대한 통제로 파리가 없는 동일하게 설정된 챔버가 각 실험에 포함되어야 합니다. 다양한 처리(돌연변이, 야생형, 비행 금지)가 포함된 챔버는 실험 간에 순환되어야 합니다.</li>
	<li>조립된 챔버를 꼭지가 열린 수조의 랙에 놓습니다(그림 1E). 참고: 일주기 변동을 피하기 위해, 챔버는 여기에 설명된 모든 실험에 대해 오전 9시 30분에서 9시 50분 사이에 욕조에 배치되었습니다.</li>
	<li>꼭지를 열어 두십시오(핸들을 꼭지와 평행하게 유지). 알림: 마개에 물이 들어가지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>약 30분 동안 꼭지가 열린 상태에서 챔버가 평형을 이루도록 합니다. 알림: 챔버가 평형을 이루는 동안 전자 장치를 연결하고 아래 설명된 대로 데이터 수집을 설정합니다.</li>
</ol>3. 컨트롤러 및 컴퓨터 설정
<ol><li>O2 발전기에 전류를 공급하는 스위치가 OFF 위치에 있는지 확인하십시오(커넥터에서 멀리 떨어져 있음; 그림 1D).</li>
	<li>각 컨트롤러 박스를 사용 가능한 USB(범용 직렬 버스) 포트에 연결합니다. 알림: 다른 곳에 설명된 컨트롤러 장치의 구성 및 프로그래밍12.</li>
	<li>6선 케이블을 사용하여 컨트롤러를 호흡계 챔버에 연결합니다.</li>
	<li>컨트롤러의 유기 발광 다이오드(OLED) 디스플레이(그림 1D)에 환경 매개변수가 표시되는지 확인합니다.</li>
	<li>컨트롤러의 스위치를 사용하여 O2 발전기를 잠시 켭니다(그림 1D).<ol><li>전류 값이 0에서 35mA에서 55mA 사이로 증가하면 컨트롤러와 챔버를 실험할 준비가 된 것입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 설명된 대로 컨트롤러에서 사용 중인 COM 포트를 확인합니다.,<ol><li>Microsoft Windows에서 시작 아이콘을 클릭합니다.</li>
		<li>설정 아이콘을 클릭합니다.</li>
		<li>Bluetooth 및 장치를 클릭합니다.</li>
		<li>컨트롤러와 해당 COM 포트가 장치 목록에 나타나는지 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>바탕 화면에서 PuTTY를 열고 아래 설명된 대로 호흡 측정기의 각 채널에 대한 로그 파일을 설정합니다. 참고: PuTTY는 COM 포트를 통해 컴퓨터로 데이터를 전송하는 데 사용되는 무료 보안 셸 및 텔넷 클라이언트입니다.<ol><li>"Serial line" 상자에 포트 번호를 입력하여 컨트롤러의 COM 포트를 선택합니다(그림 2A).</li>
		<li>Logging(로깅)을 클릭합니다.</li>
		<li>"Session logging"에서 Printable Output을 선택합니다(그림 2B).</li>
		<li>Log File Name(로그 파일 이름)에서 Browse(찾아보기)를 클릭합니다.</li>
		<li>선택한 폴더에서 설명 정보(예: 날짜, 종, COM 포트 번호)가 포함된 파일 이름을 만듭니다.</li>
		<li>저장을 클릭합니다.</li>
		<li>열기를 클릭합니다. 쉼표로 구분된 데이터가 기록되고 있음을 보여주는 창이 열립니다(그림 2C).</li>
		<li>실험에 사용 중인 다른 모든 컨트롤러에 대해 반복합니다. 각 COM 포트에 대한 입력은 별도의 창으로 나타납니다(그림 2D).</li>
	</ol></li>
</ol>4. 실험 실행
<ol><li>챔버가 30분 동안 평형을 이루면 마개를 닫아 밀봉합니다.</li>
	<li>안정된 환경을 유지하기 위해 욕실과 챔버를 폴리스티렌 폼 상자로 덮으십시오.</li>
	<li>한 시간 더 평형을 유지하십시오.</li>
	<li>컨트롤러 박스의 스위치를 사용하여 각 챔버의 O2 발생기에 전류를 켭니다.</li>
	<li>O2 발생기가 활성화되면 압력이 사전 설정된 OFF 압력으로 증가하는지 확인하십시오. 참고: 대기압보다 약간 높은 1017hPa는 이 일련의 실험에서 "OFF" 압력으로 사용되었습니다. 주변 압력으로 돌아가면 챔버에서 가스가 누출됨을 나타냅니다. 또한 주변 기압에 관계없이 실험 전반에 걸쳐 동일한 압력을 사용할 수 있습니다. "ON" 압력은 1016hPa였으며, 이는 O2 발생기가 활성화되기 전에 압력이 1hPa만 떨어지면 된다는 것을 의미합니다. 이는 초파리에서O2 소비를 측정하기 위한 적절한 민감도를 제공하였다. 챔버가 "OFF" 설정으로 가압되면 전류가 0으로 떨어져야 합니다.</li>
	<li>실험을 3시간 이상 실행합니다. 알림: 고온에서 VO2 가 높을수록 실험 시간이 단축될 수 있습니다. 장비가 작동하는지 수시로 모니터링하되 온도 안정성에 영향을 줄 수 있는 챔버 근처의 과도한 활동을 피하십시오.</li>
</ol>5. 마무리 실험
<ol><li>모든 컨트롤러에서 O2 발전기를 끕니다. 알림: 챔버가 열려 있는 동안 O2 발전기를 작동하지 않도록 먼저 수행하십시오.</li>
	<li>꼭지를 열어 챔버의 봉인을 풉니다.</li>
	<li>PuTTY 창을 5-15분 더 열어 두어 최종 기준선을 제공합니다.</li>
	<li>각 컨트롤러의 PuTTY 창을 닫고 녹화를 종료합니다. 참고: 모든 실험은 오후 4시 50분에서 5시 10분 사이에 종료되었습니다.</li>
	<li>케이블에서 센서를 분리합니다.</li>
	<li>챔버를 건조 랙으로 옮깁니다.</li>
	<li>챔버에서 센서 플러그를 한 번에 하나씩 제거합니다.</li>
	<li>O2 발전기를 분리하고 튜브 랙에 놓습니다.</li>
	<li>센서 플러그에서 그리스를 닦아내고 랙에 보관하십시오.</li>
	<li>챔버 조인트에서 그리스를 청소하고 파리와 소다 석회가 있는 튜브를 제거합니다.</li>
	<li>각 튜브에 있는 파리를 CO2 로 마취하고 웨이트 보트를 두드리며 마이크로 저울로 무게를 잰다.<ol><li>각 튜브의 무게와 파리 수를 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>파리를 버리거나 추가 절차를 위해 따로 보관하십시오.</li>
	<li>카트리지의 소다 석회를 폐기물 용기에 버리십시오.</li>
	<li>O2 발생기를 열고 CuSO4 용액을 폐기물 용기에 버립니다.<ol><li>전극과 튜브를 정제수로 헹굽니다.</li>
		<li>건조를 위해 튜브 랙을 놓습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 전하 전달 데이터 분석
<ol><li>데이터를 쉼표로 구분된 텍스트로 스프레드시트로 가져오고, 각 레코드는 별도의 워크시트로 구성됩니다.</li>
	<li>O2 발생기의 각 펄스에 대한 전류 및 시간 데이터를 기록합니다. 챔버가 가압된 후 첫 번째 펄스부터 시작하여 각 전류 펄스의 시작 시간과 종료 시간(행 번호)을 기록합니다. 이는 전류가 0 이상(일반적으로 약 45-50mA)에서 0 위에 있는 마지막 행까지 갈 때의 행 번호입니다.</li>
	<li>워크시트에 표를 만들어 다음 데이터를 기록합니다.<ol><li>펄스 동안의 평균 전류 진폭: = 각 펄스(현재 열부터)에 대한 AVERAGE([펄스의 첫 번째 행]:[펄스의 마지막 행]).</li>
		<li>펄스 지속 시간: ([펄스의 마지막 행] - [펄스의 첫 번째 행[-한 행]])/각 펄스에 대해 1000(밀리초 단위의 시간에서).</li>
		<li>총 실험 시간: [마지막 펄스 시작 시간] - [챔버 가압 후 첫 번째 펄스 종료 시간](시간 단위(분 열)에서).</li>
	</ol></li>
	<li>그런 다음 각 펄스에 대한 전하 전달(Q)을 계산합니다(평균 전류 X 지속 시간).</li>
	<li>모든 펄스의 전하를 합산하여 총 전하(Qtot)를 계산합니다.</li>
</ol>7.O2 소비량 분석
<ol><li>모든 데이터에 대해 새 스프레드시트를 설정하고 각 챔버에 대해 다음을 입력하거나 계산합니다.<ol><li>Qtot (총 요금)</li>
		<li>두더지(= Q ÷ 96485 × 4)</li>
		<li>mL O2 (= 몰 × 22413 mL / mol)</li>
		<li>총 시간(위의 데이터 분석에서)</li>
		<li>mL min-1 (= mlO2 ÷ 총 시간)</li>
		<li>그램 단위의 무게(실험 후 마취 및 무게 측정된 파리)</li>
		<li>mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ 중량(그램))</li>
		<li>mL/h/g(상기× 60)</li>
		<li>mg/fly (= 파리의 무게 ÷ 파리의 수)</li>
		<li>μL fly-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ 파리 수).</li>
	</ol></li>
	<li>각 치료(예: 유전자형)에 대한 데이터를 표로 작성합니다.</li>
	<li>ANOVA, t-검정 또는 Mann-Whitney u-검정을 사용하여 처리를 비교합니다 13.</li>
</ol>

초파리에 대한 미세호흡계 적응 - CASK 돌연변이 대사에 대한 통찰력

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<li>Herreid, C. F., Full, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cockroaches+on+a+treadmill%3A+Aerobic+running%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cockroaches on a treadmill: Aerobic running.</a> Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

위의 절차는 전자 전기량 미세 호흡계를 사용하여 D. Melanogaster에서O2 소비량을 측정하는 방법을 보여줍니다. 야생형 D. melanogaster에서의O2 소비에 대한 결과 데이터는 다른 사람들에 의해 보고된 것보다 다소 낮지만(표 1) 다양한 방법을 사용하여 대부분의 이전 간행물에서 기술된 범위 내에 있었다 3,6.
중요한 단계는 이 방법의 두 가지 절대적인 요구 사항인 기밀 밀봉과 환경 안정성을 해결했습니다. 기밀 환경을 유지하는 것은 간단하지만 주의가 필요합니다. Schlenk 플라스크와 튜브는 호흡 측정 챔버로 이상적입니다. 유리 구조는 많은 유형의 플라스틱(19)에 존재하는 가스 투과성을 방지하며, 이는 장기간의 ...

신진대사율을 측정하는 능력은 환경적 맥락에서 유기체를 완전히 이해하는 데 매우 중요합니다. 예를 들어, 신진대사율이 수명1에서 차지하는 역할, 신진대사에서 식이요법의 역할2 또는 저산소 스트레스3의 역치를 이해하기 위해서는 신진대사율을 측정할 필요가 있다.
신진대사율을 측정하는 방법에는 두 가지가 있다4. 직접 열량계는 열 생산을 측정하여 에너지 소비를 직접 측정합니다. 간접 열량계는 종종 O 2 소비 (VO2), CO2 생산 또는 둘 다의 호흡 측정 측정을 통해 다른 수단을 통해 에너지 생산을 측정합니다. 직접 열량계는 Drosophila melanogaster5를 포함한 작은 외온에 적용되었지만 호흡 측정법은 기술적으로 더 간단하고 일반적으로 사용됩니다.
야생형 및 돌연변이 D. melanogaster의 대사율을 측정하기 위해 여러 형태의 호흡 측정법이 성공적으로 사용되었으며, 체온6, 사회적 환경3, 식이요법3,7 및 신경발달장애8의 대사 효과에 대한 통찰력을 제공하였다. 이들은 비용과 복잡성이 상당히 다른 두 가지 클래스로 나뉩니다. 압력계는 가장 간단하고 가장 저렴한 9,10으로, 파리를 CO 2 흡수제를 포함하고 얇은 모세관을 통해 유체 저장소에 연결된 밀폐 된 챔버에 넣습니다. O2가 소비되고CO2가 흡수됨에 따라 챔버 내의 압력이 감소하고 유체가 모세관으로 유입됩니다. 따라서 모세관의 유체 충전 부피는 VO2에 비례합니다. 모세관의 유체에 의해 가해지는 힘을 보상하는보다 정교한 버전도 D. melanogaster1에 사용되었습니다. 압력계는 간단하고 저렴하다는 장점이 있지만 압력에 민감하기 때문에 일정한 환경 조건이 필요합니다. 또한, 소비된 O2가 치환되지 않기 때문에, 챔버 내부에서 O2(PO2)의 분압이 서서히 감소한다.
가스 분석을 이용한 호흡 측정법은 D. melanogaster에도 정기적으로 사용됩니다. 이 경우, 가스는 파리를 포함하는 밀폐된 챔버로부터 일정한 간격으로 샘플링되어 적외선 분석기(2,6,11)로 보내진다. 이러한 유형의 장치는 상업적으로 이용 가능하고 환경 조건에 덜 민감하며 샘플링 중에 가스가 새로 고쳐져 PO2가 안정적으로 유지된다는 장점이 있습니다. 그러나 장비는 비싸고 작동이 복잡할 수 있습니다.
최근에 개발된 전기량 마이크로 호흡계(12)는 기존 시스템에 대한 저렴하고 민감하며 안정적인 대안을 제공합니다. 실제로, 유기체는 밀폐 챔버에 배치되어 O 2 를 소비하고 호기 된 CO2 는 흡수성 물질에 의해 제거되어 챔버 압력이 순 감소합니다. 내부 압력이 사전 설정된 임계값(ON 임계값)으로 감소하면 전류가 전해 O2 발생기를 통과하여 압력을 두 번째 임계값(OFF 임계값)으로 되돌려 전기분해를 중지합니다. O2 발생기를 통한 전하 전달은 챔버를 재가압하는 데 필요한 O2의 양에 정비례하며, 따라서 유기체4에 의해 소비되는O2를 측정하는데 사용될 수있다. 이 방법은 매우 민감하고 V O2를 정밀하게 측정하며 O2 를 정기적으로 교체하면 몇 시간 또는 며칠 동안 PO2를 거의 일정한 수준으로 유지할 수 있습니다.
이 연구에 사용된 전기량 미세 호흡계는 다중 모드(압력, 온도 및 습도) 전자 센서를 사용합니다. 센서는 압력의 작은 변화를 감지하고 저압 임계값에 도달하면 O2 생성을 활성화하는 마이크로컨트롤러에 의해 작동됩니다(12). 이 장치는 기성품 부품으로 조립되며 다양한 챔버 및 실험 환경에서 사용할 수 있으며 딱정벌레 Tenebrio molitor에 대한 체질량 및 온도의 영향을 조사하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 본 연구에서, 미세 호흡계는 T. molitor 질량의 약 1%를 갖는 D. melanogaster에서O2 소비량을 측정하도록 조정되었습니다. O2 발생을 활성화하기 위한 임계값을 낮춤으로써 장치의 감도를 높였으며, 온도 제어 수조에서 실험을 수행하거나 챔버 내부의 습도를 100% 또는 그 부근으로 유지함으로써 환경 안정성을 높였습니다.
막 관련 구아닐레이트 키나아제(MAGUK) 계열의 일부인 CASK(Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) 단백질은 다양한 다중 단백질 복합체의 분자 스캐폴드이며 CASK의 돌연변이는 인간 및 D. melanogaster13,14의 신경 발달 장애와 관련이 있습니다. 생존 가능한 D. 멜라노가스터 돌연변이인 CASKΔ18은 도파민성 뉴런(15)의 활성을 방해하고 동종 대조군에 비해 활동 수준을 50% 이상 감소시킨다(14,16). CASK 돌연변이의 감소된 활성 수준과 신진대사 조절에 있어 카테콜아민의 역할로 인해17 우리는 표준 대사율, 즉O2 소비가 대조군에 비해 극적으로 감소할 것이라는 가설을 세웠다.
O2 소비량은 CASKΔ18 및 이들의 야생형 동족체 w(ex33)에서 측정하였다. 파리 그룹을 호흡 측정 챔버에 배치하고, O 2 소비량을 측정하고, O2 소비량을 계산하여 질량 특이적 및 파리 당 기준으로 표현했습니다. 이 장치는 이전 연구와 일치하는 야생형 파리에서 VO2를 기록했으며 야생형 파리와 CASK 돌연변이 파리의 파리당 O2 소비를 구별할 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>19/22 온도계 어댑터</td><td>Wilmad-Labglass</td><td>ML-280-702</td><td>센서 플러그</td></tr><tr><td>2 ml 스크류캡 튜브</td><td>Fisher</td><td>3464</td><td>O2 발전기</td></tr><tr><td>2핀 커넥터</td><td>Zyamy</td><td>40PIN-RFB10</td><td>O2 발전기: 2핀</td></tr><tr><td>4핀 여성 커넥터</td>로 절단 <td>TE Connectivity</td><td>215299-4</td><td>센서 플러그</td></tr><tr><td>5 ml 폴리프로필렌 튜브</td><td>팔콘</td><td>352063</td><td>5.5cm로 자르고 구멍이 뚫려 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>50ml Schlenk Tube 19/22 조인트</td><td>Laboy</td><td>HMF050804</td><td>챔버</td></tr><tr><td>6-도체 케이블</td><td>Zenith</td><td>6-Conductor 26 ga</td><td>케이블</td></tr><tr><td>6-Pin 암 벌크헤드 커넥터</td><td>Switchcraft</td><td>17982-6SG-300</td><td>컨트롤러</td></tr><tr><td>6-Pin 암 커넥터</td><td>Switchcraft</td><td>18982-6SG-522</td><td>센서 플러그</td></tr><tr><td>6-Pin 수 커넥터</td><td>Switchcraft</td><td>16982-6PG-522</td><td>케이블</td></tr><tr><td>800 ul 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td>소다 라임 카트리지</td></tr><tr><td>ABS 플라스틱 인클로저</td><td>버드 산업</td><td>PS-11533-G</td><td>컨트롤러</td></tr><tr><td>Arduino Nano Every</td><td>Arduino LLC</td><td>ABX00028</td><td>컨트롤러</td></tr><tr><td>BME 280 센서</td><td>DIYMall</td><td>FZ1639-BME280</td><td>센서 플러그</td></tr><tr><td>회로 기판</td><td>Lheng</td><td>5 X 7 cm</td><td>컨트롤러</td></tr><tr><td>구리 황산염</td><td>BioPharm</td><td>BC2045</td><td>O2 발전기</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Azulle</td><td>Byte4</td><td>데이터 수집</td></tr><tr><td>코튼 롤</td><td>Kajukajudo</td><td>#2</td><td>플라이 튜브를 연결하기 위해 반으로 자릅니다 습도를 위해 4분으로 자릅니다</td></tr><tr><td>환경 챔버</td><td>Percival</td><td>I30 VLC8</td><td>플라이 케어</td></tr><tr><td>에폭시</td><td>JB Weld</td><td>플라스틱 본더</td><td>O2 발전기의 전극 플라이</td></tr><tr><td>푸드</td><td>랩 익스프레스</td><td>타입 R</td><td>플라이 케어</td></tr><tr><td>켁 클램프</td><td>uxcell</td><td>a20092300ux0418</td><td>챔버의 유리 조인트를 플러그에 고정</td></tr><tr><td>저점도 에폭시</td><td>록타이</td>트 <td>E-30CL</td><td>센서 플러그</td></tr><tr><td>OLED 디스플레이</td><td>IZOKEE</td><td>IZKE31-IIC-WH-3</td><td>컨트롤러</td></tr><tr><td>플래티넘 와이어 24 ga</td><td>uGems</td><td>14349</td><td>O2 발전기</td></tr><tr><td>실리콘 그리스</td><td>Dow-Corning</td><td>고진공 그리스</td><td>씰 챔버 플러그 연결</td></tr><tr><td>Soda Lime</td><td>Jorvet</td><td>JO553</td><td>CO2 흡수</td></tr><tr><td>토글 스위치</td><td>E-Switch</td><td>100SP1T1B1M1QEH</td><td>컨트롤러</td></tr><tr><td>USB 케이블</td><td>Sabrent</td><td>CB-UM63</td><td>컨트롤러</td></tr><tr><td>USB 허브</td><td>Atolla</td><td>Hub 3.0</td><td>컨트롤러 컴퓨터에 컨트롤러 연결</td></tr><tr><td>수조</td><td>Amersham</td><td>56-1165-33</td><td>온도 제어</td></tr><tr><td>수조 탱크</td><td>유리 케이지</td><td>15 리터 무테 아크릴</td><td>호흡계 목욕</td></tr></tbody></table>

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의o2 소비량 측정

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

전기량 미세호흡계는 안정적인 환경을 유지하면서 작은 유기체의O2 소비량을 측정하기 위한 간단하고 저렴한 방법입니다. 전기량 마이크로 호흡계는 O 2 가 소비되고 유기체에 의해 생성 된 CO2 가 흡수 매체에 의해 제거되는 밀폐 챔버로 구성됩니다. 결과적인 압력 감소는 전해 O2 생성을 유발하고, 생성된O2의 양은 이를 생성하는 데 사용된 전하량을 기록하여 측정됩니다. 본 연구에서 이 방법은 장치의 감도와 높은 안정성을 위해 최적화된 환경 조건으로 소그룹으로 테스트된 Drosophila melanogaster에 적용되었습니다. 이 장치에서 야생형 파리가 소비하는O2의 양은 이전 연구에서 측정한 양과 일치합니다. 크기가 작고 덜 활성화되는 것으로 알려진 CASK 돌연변이에 의한 질량 특이적O2 소비는 동종 대조군과 다르지 않았습니다. 그러나, CASK 돌연변이의 크기가 작기 때문에 플라이당 O2 소비가 현저히 감소하였다. 따라서 미세 호흡계는 D. melanogaster에서 O2 소비량을 측정 할 수 있으며 유전자형 간의 적당한 차이를 구별 할 수 있으며 대사율을 측정하기위한 다목적 도구를 추가합니다.

호흡계 컨트롤러의 압력 및 전류 출력은 그림 3A의 한 실험에서 하나의 챔버에 대해 표시됩니다. 첫 번째 긴 전류 펄스는 주변 압력(약 992hPa)에서 사전 설정된 OFF 임계값인 1017hPa까지 챔버를 가압했습니다. 파리가 O 2 를 소비하고 CO 2 가 흡수됨에 따라 압력은 O2 발생기를 통해 전류를 활성화하는 1016hPa의 ON 임계값에 도달할 때까지 천천히 감소했습니다. 표시된 예에서 각 펄스의 평균 진폭은 50.1mA이고 지속 시간은 16.1초이며 펄스당 약 0.81쿨롱(C)의 전하 전달을 생성합니다. 이 챔버의 총 전하 전달은 총 240.0분 동안 3.28C였습니다. 파리의 질량 및 수(총 14.9mg의 무게가 되는 파리 23마리)에 대한 절차에 기술된 계산을 사용하여, 이 챔버 내의 그룹에 대한O2 소비량은 3.19 mL h-1 g-1 또는 2.07 μL h-1...

전기량 호흡 측정법은 작은 유기체의 신진대사율을 측정하는 데 이상적입니다. 본 연구에서 Drosophila melanogaster에 대해 적응시켰을 때, 측정된O2 소비량은 이전 연구에서 야생형 D. melanogaster에 대해 보고된 범위 내에 있었습니다. 더 작고 덜 활동적인 CASK 돌연변이의 플라이당 O2 소비량은 야생형보다 현저히 낮았습니다.

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의O2 소비량 측정

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

우리의 연구는 온도와 활동이 곤충의 신진대사에 어떤 영향을 미치는지에 초점을 맞추고 있습니다. 이것은 종이 주변 환경에서 생존하기 위해 어떻게 진화했는지, 그리고 변화하는 세계에서 어떻게 계속 적응할 것인지를 이해하는 데 필수적입니다. 개별 유기체의 생리와 행동을 이해하는 것은 이러한 노력에 매우 중요합니다.신진대사율은 열 생산을 측정하여 직접 측정하거나 산소 소비량 또는 이산화탄소 생성을 측정하여 간접적으로 측정할 수 있습니다. 초파리처럼 작은 유기체에 의한 열 생산을 측정하는 것이 기술적으로 가능하지만 간접적인 방법이 더 일반적으로 사용됩니다. 이 규모로 신진대사를 측정하기 위한 현재 과제에는 비용, 환경 안정성 및 신뢰성이 포함됩니다.상업적으로 이용 가능한 시스템은 신뢰할 수 있고 안정적이며 비교적 쉽게 구입할 수 있지만 복잡하고 비용이 많이 들 수 있습니다. DIY 압력계는 저렴하지만 오류가 발생할 수 있으며 각 실험에 대해 제작이 필요할 수 있습니다. 전기량 호흡계는 비교적 저렴하고 사용하기 쉬우며 환경 매개변수를 편리하게 판독할 수 있으며 모든 구성 요소를 재사용할 수 있습니다.또한 정기적인 산소 교체는 몇 시간 또는 며칠 동안 안정적인 환경을 유지합니다. 실험실에서는 초파리의 확립된 대조군 균주와 산소 소비에 대한 과잉 및 저활성 돌연변이의 영향 사이의 대사 변화를 연구할 것입니다. 현장에서는 야생 사막 적응 딱정벌레의 신진대사율과 온도 내성을 연구하기 시작할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

대사 질환은 인간에서 가장 흔한 질병 중 하나들이다. 유 전적으로 다루기 쉬운 모델 생물 D. melanogaster의 대사를 조절하는 신규 한 유전자를 확인하는데 사용될 수있다. 이 논문은 자신의 CO 2 생산을 측정하여 파리의 신진 대사 속도를 연구 할 수있는 비교적 간단한 방법을 설명합니다.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

이 논문은 미량의 특정 방사성 표지 대사 기질을 파리에게 공급하는 Drosophila melanogaster의 연료 산화 측정 방법을 설명합니다. 연료 산화로 인해 생성된 호기된 방사성 표지된 CO2 가 수집되고 측정됩니다.

방사성 표지 된 기판에서 이산화탄소 생산에서의 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

마이크로 플레이트 피더 분석법은 Drosophila에서액체 음식 소비를 정량화하기 위한 경제적이고 높은 처리량 방법을 제공합니다. 3D 프린팅 장치는 파리가 트레이서 염료로 공급 용액을 소비하는 1536웰 마이크로 플레이트에 파리가 보관되는 96웰 마이크로 플레이트를 연결합니다. 용액 량 감소는 분광계로 측정됩니다.

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이 기술은 생활의 분자 특성에 대한 양성자 MR 분광법 (1H - MRS HRMAS)를 회전 고해상도 마법 각도의 사용을...

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초파리 melanogaster의는 자발적인 운동 활성 등의 행동에 영향을 미치는 유전 적 또는 환경 적 조작을 공부에 유용하다. 여기에서 우리는 적외선 빔과 자발적인 운동 활성을 정량화하는 데이터 분석 소프트웨어와 함께 모니터를 활용하는 프로토콜을 설명합니다.

의 자발적인 운동 활성의 결정<em&gt; 초파리</em

여기에서는 스트레스를 받는 개인의 회피를 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 패러다임은 강력하면서도 사용자 친화적이며 Drosophila melanogaster의 한 종류의 사회적 상호 작용에 대한 유전자와 환경의 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

사회 회피의 정량화에 대한 간단한 분석 초파리

Drosophila melanogaster의 사회적 공간에 대한 유전자와 환경의 영향은 강력하지만 간단한 분석 패러다임을 통해 정량화할 수 있습니다. 우리는 여기에서 이 사회적 공간에 영향을 미칠 수 있는 다양한 요인을 보여주므로 이 패러다임에서 실험을 설계할 때 고려해야 합니다.

사회적 공간에 영향을 미치는 조건<em&gt; 초파리</em

배우세요 전기량 미세호흡계를 사용하여 Drosophila melanogaster의 산소 소비량을 측정하는 방법을. CASK 돌연변이체의 대사율 변화를 분석하여 유전적 요인이 생리에 미치는 영향을 규명합니다.

전기량 미세호흡계를 사용한 초파리 멜라노가스터의_O2 소비량 측정

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