Name: 자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 배우세요 마이크로프리즘을 활용한 신경 집단 장기 이미징 기법으로 고정 및 자유롭게 움직이는 동물의 대뇌피질 감각 정보 처리를 비교 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 자연적 행동 맥락에서 신경 동역학을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

수술 프로토콜과 형질전환 마우스 균주 공유에 대한 조언을 해주신 Ms. Charu Reddy와 Matteo Carandini 교수(Cortex Lab)에게 감사드립니다. 수술 개발 전반에 걸친 지도와 도움을 주신 Norbert Hogrefe 박사(Inscopix)에게 감사드립니다. 수술 설정 및 데이터 처리에 도움을 주신 Ms Andreea Aldea (Sun Lab)에게 감사드립니다. 이 작업은 Moorfields Eye Charity의 지원을 받았습니다.

머리에 고정되고 자유롭게 움직이는 동물에서 Microprism을 사용한 다층 이미징

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Vaziri, A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+the+optical+dimension+in+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Reshaping the optical dimension in optogenetics.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+at+pre-+and+postsynaptic+sites+of+layer+2%2F3+cells+in+developing+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).</li>
<li>Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cellular+imaging+of+mouse+visual+cortex+during+operant+behavior+and+passive+viewing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing.</a> Front Cell Neurosci. 4, 3(2010).</li>
<li>Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+field+of+view+two-photon+mesoscope+with+subcellular+resolution+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging.</a> Elife. 5, 14472(2016).</li>
<li>Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-dependent+emergence+of+behavioral+representation+in+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex.</a> Cell Rep. 32 (4), 107970(2020).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo.+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).</li>
<li>Seaton, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-component+structural+plasticity+mediated+by+%CE%B1CaMKII+autophosphorylation+on+basal+dendrites+of+cortical+layer+2%2F3+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones.</a> J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li>
<li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li>
<li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures%3A+Imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li>
<li>Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minicolumn+hypothesis+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The minicolumn hypothesis in neuroscience.</a> Brain. 125, 935-951 (2002).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+fluorescence+microscopy+for+imaging+brain+activity+in+freely-behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals.</a> Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).</li>
<li>Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+cortical+Ca2%2B+imaging+in+freely+moving+mice+with+prism+probes+and+miniaturized+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. (124), e55579(2017).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical%2C+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS One. 9 (2), 88678(2014).</li>
<li>Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+imaging+of+cortical+dynamics+during+sensory+perception+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior.</a> J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+denoising%2C+deconvolution%2C+and+demixing+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data.</a> Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> Elife. 7, 28728(2018).</li>
<li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+deep-brain+imaging+in+mouse+using+visible-light+optical+coherence+tomography+through+chronic+microprism+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window.</a> Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).</li>
<li>Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+elastic+propagation+of+cortical+seizures+in%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Reliable and elastic propagation of cortical seizures in.</a> Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).</li>
<li>Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+micro-organization+of+grid+cells+revealed+by+cellular-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging.</a> Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).</li>
<li>Barson, D., Hamodi, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mesoscopic+and+two-photon+imaging+of+neuronal+activity+in+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits.</a> Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).</li>
<li>Paquelet, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+activity+and+network+properties+of+dorsal+raphe+nucleus+serotonin+neurons+during+emotionally+salient+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors.</a> Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+microelectrode+arrays+integrated+with+microprisms+for+electrophysiology+and+simultaneous+two-photon+imaging+across+cortical+layers%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+rapid+plasticity+in+hippocampal+CA1+representations+during+novel+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences.</a> Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+two-photon+microscopy+for+enlarged+field-of-view%2C+multi-plane+and+long-term+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging.</a> Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).</li>
<li>Engelbrecht, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-compact+fiber-optic+two-photon+microscope+for+functional+fluorescence+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo.</a> Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-%CE%BC+Periscope%2C+a+tool+for+multilayer+optical+recordings%2C+optogenetic+stimulations+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both.</a> Elife. 10, 72894(2021).</li>
<li>Stibůrek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((110+%CE%BCm+thin+endo-microscope+for+deep-brain+in+vivo+observations+of+neuronal+connectivity%2C+activity+and+blood+flow+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics.</a> Nat Commun. 14 (1), 1897(2023).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 이해 상충이 없음을 선언합니다.

여기에서 우리는 동일한 신경 집단에서 머리가 고정되고 자유롭게 움직이는 조건에서 뉴런을 관찰하고 직접 비교할 수 있는 능력을 보여주었습니다. 우리가 시각 피질에서 응용을 시연하는 동안, 이 프로토콜은 피질 영역과 심부 핵 24,25,26,27,28 뿐만 아니라 다른 데이터 수집 및 행동 설정(29,30)과 같은 다수의 다른 뇌 영역에 적용될 수 있다.
최적의 데이터 수집을 가능하게 하는 이 프로토콜 내의 중요한 단계를 기록해 두는 것이 중요합니다. 첫째, z-stack을 수행할 때 전체적으로 일관된 휘도를 유지하는 것이 중요합니다. 앞서 설명했듯이 빛은 더 많은 조직을 통과할수록 산란됩니다. 따라서 이득을 증가시킴으로써 레이저는 조직을 더 관통하고 ROI를 자극할 수 있는 더 많은 힘을 가지고 있습니다. 그러나, 이것은 형광성 구조 및 광독성의 과다 노출을 일으키는 원인이 되고 피질의 표면에 조직을 표백할지도 모르기 때문에, 깊은 조직에 있는 ROI를 흥분하기 위하여 요구된 이득에 z 더미를 시작하는 것은 조언되지 않습니다. 따라서 상대 지수 기울기 옵션을 선택하면 소프트웨어가 z-스택의 모든 단계에서 최적이 될 수 있도록 필요한 전력의 일정한 기울기를 계산할 수 있습니다. 둘째, 시간이 지남에 따라 세포 세트를 일관되게 정합하는 데 도움이 되는 다음 중요한 단계는 첫 번째 단광자 이미징 세션에서 촬영한 동영상의 평균 이미지를 저장하는 것입니다. 이를 통해 사용자는 후속 이미징 세션을 원본 이미지와 비교하여 세포 세트 및 데이터 수집의 연속성을 보장할 수 있습니다.
경량의 소형 이광자 현미경이 독립적으로 설계되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다.31,32 자유롭게 행동하는 동물의 고해상도 이미징이 가능합니다. 고해상도 생체 내 이미징의 흥미로운 발전을 강조하지만 제한된 시야(FOV)와 고도로 전문화된 설계로 인해 일반 최종 사용자에게는 어려움이 있습니다. 우리가 설명한 방법은 상용 공급업체에서 쉽게 구할 수 있는 잘 정립된 여러 플랫폼을 통합하여 접근 가능한 선택이 되도록 합니다. 이론적으로, 이것은 또한 오픈 소스 미니스코프 및 일반적인 이광자 현미경(33,34)과 호환되는 맞춤형, 자체 조립된 마이크로프리즘으로 대체될 수 있다.
그럼에도 불구하고 이 프로토콜은 오류가 실행 불가능한 FOV로 이어질 수 있고 결과적으로 데이터가 손상될 수 있기 때문에 정확한 마이크로프리즘 이식과 같은 문제에 직면해 있습니다. 다양한 양식에서 일관된 FOV를 유지하는 것은 이미징 획득에 사용되는 다양한 대물렌즈로 인해 어려운 일입니다. 그러나 마이크로 프리즘의 XY 축이 고정되어 있기 때문에 FOV의 변화는 Z 축을 따릅니다. 따라서 두 이미징 모드(예: 혈관, 피질 조직의 인공물 및 동일한 뉴런)에 존재하는 특정 랜드마크가 FOV를 동기화하는 데 사용됩니다. 또한 서로 다른 양식에서 동일한 뉴런을 정렬하고 식별하기 위해 등록을 적용하는 것이 중요합니다. 알아야 할 또 다른 과제는 두 가지 방식 모두에서 획득하는 동안 GCaMP 조직의 광표백을 최소화하는 것입니다. 따라서 레코딩에 소요되는 시간을 줄이고, 신호 대 노이즈 비율을 최적화하고(LED/레이저 출력이 아닌 게인을 증가시킴으로써), 이미징 세션 사이에 24-48시간을 기다리는 것이 중요합니다.
이러한 내재된 복잡성에도 불구하고, 당사의 프로토콜은 외과적 정밀도와 적절한 이미지 처리 기술로 실행될 때 신경 활동을 비교하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 이를 통해 엄격하게 통제된 작업에서 머리가 고정된 상태와 보다 자연스러운 행동을 모방하는 자유롭게 움직이는 상태를 비교할 수 있으므로 신경 과학 분야의 잠재적 응용 분야가 확장됩니다.

광학 시스템과 유전자 변형 형광 지표의 새로운 기술을 결합한 생체 내 이광자 형광 이미징(in vivo two-photon fluorescent imaging)1,2의 출현은 살아있는 뇌의 복잡한 구조, 기능 및 가소성을 조사하기 위한 신경 과학의 강력한 기술로 부상했습니다 3,4. 특히, 이 이미징 방식은 뉴런의 형태와 동적 활동을 모두 포착함으로써 기존 전기생리학에 비해 비교할 수 없는 이점을 제공하여 식별된 뉴런의 장기 추적을 용이하게 합니다 5,6,7,8.
주목할 만한 장점에도 불구하고, 고해상도 형광 이미징을 적용하려면 동물의 이동성을 제한하는 정적인 머리 고정 설정이 필요한 경우가 많습니다 9,10,11. 또한, 뉴런을 시각화하기 위해 투명한 유리 표면을 사용하면 관찰이 하나 이상의 수평면으로 제한되어, 상이한 피질 깊이(12)에 걸쳐 확장되는 수직 과정의 역학에 대한 탐색이 제한된다.
이러한 한계를 해결하기 위해 본 연구는 헤드 플레이트 고정, 마이크로 프리즘 및 미니스코프를 통합하여 다층 및 다중 모드 기능을 갖춘 이미징 양식을 만드는 혁신적인 수술 절차를 간략하게 설명합니다. 마이크로프리즘은 피질기둥(13,14,15,16)을 따라 수직처리를 관찰할 수 있게 해주는데, 이는 정보가 피질의 여러 층을 통과할 때 어떻게 처리되고 변형되는지, 그리고 소성 변화 동안 수직 처리가 어떻게 변경되는지를 이해하는 데 매우 중요하다. 더욱이, 다양한 실험 설정(17,18,19)을 포함하는 머리 고정 패러다임과 자유롭게 움직이는 환경에서 동일한 신경 집단의 이미징을 허용합니다: 예를 들어, 감각 지각 평가 및 2광자 패러다임 하에서 안정적인 기록과 같은 잘 제어된 패러다임에는 머리 고정이 종종 필요한 반면, 자유롭게 움직이는 것은 행동 연구를 위한 보다 자연스럽고 유연한 환경을 제공합니다. 따라서 두 모드에서 직접 비교를 수행할 수 있는 능력은 유연하고 기능적인 응답을 가능하게 하는 미세 회로에 대한 이해를 높이는 데 매우 중요합니다.
본질적으로, 형광 이미징에서 헤드 플레이트 고정, 마이크로 프리즘 및 미니스코프의 통합은 뇌 구조와 기능의 복잡성을 조사할 수 있는 유망한 플랫폼을 제공합니다. 연구원들은 모든 피질층에 걸쳐 다양한 깊이에서 식별된 세포 집단을 샘플링하고, 잘 통제된 패러다임과 자연 패러다임 모두에서 반응을 직접 비교하고,20개월 동안 장기적인 변화를 모니터링할 수 있습니다. 이 접근 방식은 이러한 신경 집단이 다양한 실험 조건에서 시간이 지남에 따라 어떻게 상호 작용하고 변화하는지에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 신경 회로의 동적 특성에 대한 창을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>주입용 0.9% 염화나트륨 용액(Vetivex 11) 250ml</td><td>Dechra</td><td>20091607</td><td>수화 및 약물 재조정을 위한 식염수</td></tr><tr><td>18004-1 트레핀 1.8mm 직경 버</td><td>FST</td><td>18004-18</td><td>드릴 비트</td></tr><tr><td>1ml 주사기</td><td>Terumo</td><td>MDSS01SE</td><td>1ml 주사기</td></tr><tr><td>23G x 5/8인치 6% LUER 바늘</td><td>Terumo</td><td>NN-2316R</td><td>23G 바늘</td></tr><tr><td>71000 자동 정위 장치 (내장 소프트웨어 포함</td>) <td>RWD-RWD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>흡수성 지혈 젤라틴 스폰지 (10x10x10mm)</td> <td>Surgispon</td><td>SSP-101010</td><td>젤 폼</td></tr><tr><td>알코올 패드 70 % 이소 프로필 알코올</td><td>브라운</td><td>9160612</td><td>알코올 패드</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>모든 소매점</td> <td>-</td> <td>수술 중 눈을 가리는 호일</td></tr><tr><td>인공 뇌척수액&nbsp;</td><td>Tocris Bioscience a Bio-Techne 브랜드</td><td>3525/25ML</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>자동 마이크로주입 펌프</td><td>WPI</td><td>8091</td><td></td></tr><tr><td>베타딘 용액 (10% 요오드화 포비돈) 500ml</td><td>Videne/Ecolab</td><td>3030440</td><td>Betadine</td></tr><tr><td>Bruker Ultime 2Pplus (맞춤형)</td>Bruker-Two-photon <td></td><td></td><td>이미징 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>Cardiff Aldasorber</td><td>Vet-Tech</td><td>AN006</td><td>마취 흡수기</td></tr><tr><td>CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC</td><td>Nikon</td><td>MRH48230</td><td>20x 대물 렌즈</td></tr><tr><td>컴팩트 마취 시스템 - 단일 가스 - 이소플루란 K/F, 산소 농축기 모델: ZY-5AC 및 청소 유닛</td><td>Vet-Tech</td><td>AN001</td><td>컴팩트 마취 시스템&nbsp;</td></tr><tr><td>Contec 프로클로르&nbsp;</td><td>Aston Pharma</td><td>AP2111L1</td><td>소독제 (차아 염소산)</td></tr> <tr><td>덱사메타손 인산나트륨 주사제, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25</td><td>Hikma</td><td>Covetrus:70789</td><td>덱사메타손</td></tr><tr><td>해부 칼, 절삭날 4mm, 두께 0.5mm, 스테인레스 스틸</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>피질 인시시노용 칼</td></tr><tr><td>양면, 비 펑크 마우스 & 신생아 쥐 귀바</td><td>스톨팅</td><td>51649</td><td>귀바</td></tr><tr><td>더미 현미경</td><td>Inscopix</td><td>더미 현미경</td><td>이식을 돕기 위해</td></tr><tr><td>에탄올 (100%)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>40-1712-25</td><td>70% 에탄올을 만드는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>피셔브랜드&nbsp; 니트릴 인디고 일회용 장갑 PPE Cat III</td><td>FischerScientific</td><td>17182182</td><td>장갑</td></tr><tr><td>동종 모니터 50-7222-F</td><td>하버드 장치</td><td>50-7222-F</td><td>동종 모니터링 시스템/가열 패드</td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어</td><td>ImageJ</td><td>-</td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Inscopix 데이터 처리 소프트웨어(IDPS)</td><td>Inscopix-One-photon</td><td></td> <td>칼슘 이미징 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Insight Duals-232, S/N 2043</td><td>InSight</td><td>Insight Spectra X3</td><td>Two-photon imaging laser</td></tr><tr><td>IsoFlo 250ml 100% w/w 흡입</td><td>Zoetis</td><td>WM 42058/4195</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive</td><td>World Precision Intruments (WPI)</td><td>KWIK-SIL</td><td>실리콘 접착제</td></tr><tr><td>MICROMOT 전원 어댑터 NG 2/S, 드릴 유닛 60/E</td><td>PROXXON</td> <td>포함NO 28 515</td><td>핸드헬드 드릴</td></tr><tr><td>nVoke 통합 이미징 및 광유전학 시스템 패키지</td><td>Inscopix-One-photon</td><td></td> <td>이미징 시스템 및 소프트웨어</td></tr><tr><td>ProView 임플란트 키트</td><td>Inscopix</td><td>ProView 임플란트 키트</td><td>더미 현미경, 스테레오택시 암 및 부착물&nbsp;</td></tr><tr><td>ProView 프리즘 프로브</td><td>Inscopix</td><td>1050-002203</td><td>마이크로프리즘 렌즈</td></tr><tr><td>Rimadyl (50mg/ml)</td><td>Zoetis</td><td>VM 42058/4123</td><td>Carprofen&nbsp;</td></tr><tr><td>테이블 클램프가 있는 관절 팔의 실체 택시 현미경</td><td>WPI</td><td>PZMTIII-AAC&nbsp;</td><td>현미경</td></tr><tr><td>Super-Bond Universal 키트, SUN Medical</td><td>Prestige-Dental</td><td>K058E</td><td>접착 시멘트</td></tr><tr><td>투포톤 칼슘 이미지 소프트웨어</td><td>Suite2P</td><td>-</td><td>투포톤 칼슘 이미징 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Vapouriser</td><td>Vet-Tech-Isoflurane</td><td></td> <td>vapouriser</td></tr><tr><td>Xailin 윤활 눈 연고 5g</td><td>Xailin-Night</td><td>MLG/28/1551</td><td>안과 연고&nbsp;</td></tr></tbody></table>

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

다광자 현미경 및 분자 기술의 발전으로 형광 이미징은 빠르게 성장하여 살아있는 뇌 조직의 구조, 기능 및 가소성을 연구하기 위한 강력한 접근 방식이 되고 있습니다. 기존의 전기생리학과 비교했을 때, 형광 현미경은 세포의 형태뿐만 아니라 신경 활동도 포착할 수 있어 단세포 또는 세포 내 분해능으로 식별된 뉴런 집단을 장기간 기록할 수 있습니다. 그러나 고해상도 이미징은 일반적으로 동물의 움직임을 제한하는 안정적인 머리 고정 설정이 필요하며, 투명 유리의 평평한 표면을 준비하면 하나 이상의 수평면에서 뉴런을 시각화할 수 있지만 다양한 깊이에서 실행되는 수직 프로세스를 연구하는 데는 제한적입니다. 여기에서는 헤드 플레이트 고정과 다층 및 다중 모드 이미징을 제공하는 마이크로 프리즘을 결합하는 절차를 설명합니다. 이 수술 준비는 생쥐 시각 피질의 전체 기둥에 접근할 수 있을 뿐만 아니라 머리 고정 위치에서 2광자 이미징과 자유롭게 움직이는 패러다임에서 1광자 이미징을 가능하게 합니다. 이 접근법을 사용하면 다양한 피질 층에서 식별된 세포 집단을 샘플링하고, 머리가 고정되고 자유롭게 움직이는 상태에서 반응을 등록하고, 수개월에 걸친 장기적인 변화를 추적할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 미세 회로에 대한 포괄적인 분석을 제공하여 잘 제어된 자극과 자연스러운 행동 패러다임에 의해 유발되는 신경 활동을 직접 비교할 수 있습니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 조건에서 1광자 및 2광자 이미징 방식을 모두 사용하여 몇 주 동안 동일한 뉴런 집단의 만성 다층 생체 내 칼슘 이미징을 수행하는 방법이 나타났습니다. 여기에서 동물이 어둠 속에서 열린 경기장을 탐험하는 동안 단광자 이미징에서 일치하는 뉴런 집단을 식별하는 능력이 입증되었습니다(그림 7A). 식별된 뉴런에서 칼슘 흔적을 추출하고 비교를 위해 z-점수를 매겼습니다(그림 7B). 뉴런은 3주 간격으로 진행된 세션에서 비슷한 수준의 형광 및 발화율을 보였습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65387/65387fig07v2.jpg"> 그림 7: 일차 시각 피질의 칼슘 역학은 3주에 걸친 세션에 걸쳐 안정적으로 등록될 수 있습니다. (A) 3주에 걸쳐 자유롭게 움직이는 단광자 칼슘 이미징 하에서 동일한 시야의 3개의 개별 기록에서 최대 투영 이미지 위에 겹쳐진 식별된 뉴런의 공간 필터. ROI는 (B)에 표시된 순서대로 레이블이 지정됩니다. 두 번째(가운데) 및 세 번째(오른쪽) 세션의 어두운 영역은 첫 번째(왼쪽) 세션을 참조로 사용하여 이미지 정합을 수행한 결과입니다(스케일 막대는 0.5mm를 나타냄). (B) (A)에 표시된 첫 번째(왼쪽), 두 번째(중간) 및 세 번째(오른쪽) 세션에서 등록된 ROI의 Z-점수 칼슘 활성. 수평 눈금 막대는 10초이고 수직 눈금 막대는 10sd입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65387/65387fig07largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
다음으로, 다양한 이미징 양식에 걸친 신경 세포 집단의 등록이 입증되었습니다. 단광자 및 이광자 이미징 세션은 같은 날 수행되었습니다. ROI는 단광자 데이터에서 식별되고 셀 맵을 생성하기 위해 수동으로 큐레이팅되었습니다(그림 8A). 마찬가지로, 이광자 데이터를 처리하여 셀 맵을 생성했으며, 이를 통해 셀이 자동으로 식별되고 데모를 위해 수동으로 선택되었습니다. 그런 다음 1광자 세션의 평균 투영 이미지를 MIRA 플랫폼을 사용하여 2광자 z-스택의 최대 투영 이미지에 정렬했습니다(그림 8B). 그런 다음 이 뒤틀린 셀 맵을 내보내고, 2광자 최대 투영 이미지에 겹쳐서 2광자 셀 맵과 정렬했습니다(그림 8C). 이를 통해 두 이미징 방식(그림 8D)에서 동일한 세포의 활성을 보여주는 세포 식별이 가능했으며, 이는 신경 반응의 정량적 분석에 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65387/65387fig08.jpg"> 그림 8: 서로 다른 이미징 양식 사이에 등록된 1차 시각 피질의 칼슘 역학. (A) 자유롭게 움직이는 단일 광자 세션의 최대 투영 이미지에 오버레이된 식별된 뉴런의 공간 필터. 표지된 뉴런은 (C)에 제시된 이광자 기록 데이터에 성공적으로 등록된 뉴런입니다. (B) (A)에 표시된 것과 동일한 윤곽이 (C)에 표시된 2광자 세션 데이터와 일치하도록 뒤틀렸습니다. (C) 정렬 후 (A)에 표시된 ROI의 공간 필터(흰색) 및 같은 날 2광자 헤드 고정 기록 세션(녹색)에서 2P 처리 소프트웨어를 사용하여 식별된 ROI는 2광자 세션의 최대 투영 이미지 위에 오버레이됩니다. 겹치는 ROI는 등록된 것으로 간주되며 추가 분석을 위해 선택됩니다(축척 막대는 0.5mm를 나타냄). (D) 1광자(왼쪽) 및 2광자(오른쪽) 기록 세션에서 등록된 ROI의 Z-점수 칼슘 활성(수평 눈금 막대는 10초, 수직 눈금 막대는 10sd). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65387/65387fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for ...

시스템 신경 과학은 특히 분자 및 유전적 접근 방식과 결합된 이미징 기술의 발전으로 큰 이점을 얻습니다. 연구자들은 뇌의 기능을 더 미세한 규모, 더 긴 시간, 더 많은 위치에서 해부하기 위해 고해상도, 만성 기록 및 세포 유형별 표적화를 점점 더 많이 사용하고 있습니다. 실험 패러다임에서 주목할 만한 변화 중 하나는 마취된 기록에서 깨어 있거나 자유롭게 움직이는 상태로 이동하는 것입니다.이 접근 방식을 사용하면 자연 조건에서 뇌 활동을 특성화할 수 있지만 자극 및 측정에 대한 정확한 제어가 필요하기도 합니다. 이 프로토콜을 사용하면 머리가 고정되어 있고 자유롭게 움직이는 동물의 동일한 신경 집단을 이미지화할 수 있습니다. 우리는 잘 통제된 패러다임과 자연적 패러다임 모두에서 그들의 활동을 직접 비교할 수 있습니다.우리의 프로토콜은 대뇌 피질 층에 걸친 감각 정보 처리를 연구할 수 있게 합니다. 이를 통해 머리가 고정된 상태에서 제어된 감각 자극에 대한 신경 반응과 자유로운 움직임 중 행동 작업을 비교할 수 있으므로 감각 처리 역학에 대한 이해를 용이하게 할 수 있습니다.

long-term-imaging-identified-neural-populations-using-microprisms

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스를 네크로 텍스에 삽입 마우스 오른쪽 단추로 각도 마이크로 일반적으로 통에 발견 관점 여러 피질 레이어의 깊은 화상을 허용합니다. 원 - mm 마이크로는 다양한 현장의 전망 (~ 900 μm의)와 돌기 쪽이를 해결하기 위해 충분한 공간 해상도를 제공합니다. 우리는 계층 V의 연결 이미지와 마이크로를 사용하여 neocortical 혈관 영상을 보여줍니다.

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

이 방법은 탐색 및 동물의 머리의 확고한 고정을 필요로 미세한 영상 또는 단일 세포 전기 생리학 녹음하는 동안 탐험하는 마우스 유형, 친숙한 환경을 만듭니다.

평면 바닥의 공기 해제 플랫폼 : 새로운 방법이 깨어에 현미경 또는 전기 생리학과 행동을 결합하여 자유롭게 설치류 이동

여기서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 대규모 Ca 2+ 영상을 수행하는 절차를 제시합니다. 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 헤드 장착 현미경을 사용하여 수백 개의 활성 세포를 동시에 관찰 할 수 있습니다.

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

이 문서는 주입 캐뉼라와 마우스의 해마의 CA1 영역에 이식으로 보충 된 맞춤형 이미징 창의 준비를 보여줍니다.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.

깨어있는 마우스 에서 반복되는 생체 내 이미징을위한 두개골 창 이식

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

배우세요 마이크로프리즘을 활용한 신경 집단 장기 이미징 기법으로 고정 및 자유롭게 움직이는 동물의 대뇌피질 감각 정보 처리를 비교 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 자연적 행동 맥락에서 신경 동역학을 연구하는 데 활용됩니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

더 많은 동영상 탐색