Name: 살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 배우세요 살아있는 효모 세포에서 mtHyPer7 비율계량 바이오센서를 이용한 미토콘드리아 과산화물 정량 측정 방법을. Saccharomyces cerevisiae를 사용하여 산화 스트레스와 노화 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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저자는 전문적인 기술 지원을 제공한 Katherine Filpo Lopez에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)(GM122589 및 AG051047)의 보조금으로 LP에 지원되었습니다.
이 연구는 컬럼비아 대학의 허버트 어빙 종합 암 센터(Herbert Irving Comprehensive Cancer Center)의 컨포칼 및 특수 현미경 공유 리소스(Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource)를 사용했으며, NIH/NCI 암 센터 지원 보조금 P30CA013696(Cancer Center Support Grant )을 통해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

mtHyper7을 사용한 살아있는 효모 세포의 미토콘드리아 과산화물 이미징

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

이 프로토콜에서는 살아있는 신진 효모 세포에서 미토콘드리아H2O2를 평가하기 위해 바이오센서로서 mtHyPer7을 사용하는 방법이 설명되어 있습니다. 바이오센서는 CRISPR 기반 방법을 사용하여 구성되며 선택 가능한 마커를 사용하지 않고 효모 게놈의 보존된 유전자가 없는 영역에 도입됩니다. 플라스미드 기반 바이오센서와 비교했을 때, 통합 바이오센서는 모든 세포에서 일관된 수준으로 발현되어 보다 신뢰할 수 있는 정량화 결과를 제공합니다. mtHyPer7 발현 세포를 생성하는 데 선택 가능한 마커가 사용되지 않아 더 넓은 범위의 균주 배경을 사용할 수 있고 바이오센서 발현 세포의 유전자 변형을 용이하게 합니다. mtHyPer7 단백질은 미토콘드리아 형태, 기능, 분포 또는 세포 성장률에 눈에 띄는 영향 없이 미토콘드리아를 정확하게 표적으로 합니다. mtHyPer7은 외부에서 첨가된H2O2에 대한 용량 의존적 반응을 나타낸다. 또한 mtHyPer7은 세포 내 분해능으로 미토콘드리아 품질의 이질성을 보고할 수 있습니다. 마지막으로, 미토콘드리아 표적 바이오센서를 이미징하기 위해 광시야 현미경이 아닌 스피닝 디스크 컨포칼 현미경을 사용하면 형광단에 대한 광표백이 줄어들고 세포 내 차이를 분석하기 위한 고해상도 이미지가 생성됩니다.
한계 및 대안 접근 방식 이 방법은 세포가 커버슬립 아래에서 건조되기 때문에 10분 이상 세포를 이미징하는 데 적합하지 않습니다. 장기간의 이미징을 위해, 한천 패드 방법(46 )을 사용하거나 SC 배지로 채워진 유리-바닥 배양 접시에 세포를 고정시키는 것이 더 낫다.
바이오센서의 선택은 실험 조건 하에서 표적의 농도에 따라 결정되어야 합니다. HyPer7의 감도가 너무 높으면 HyPer3 또는 HyPerRed47,48과 같은 다른 HyPer 버전을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 다른 HyPer 프로브는 pH에 더 민감하다는 점에 유의해야 합니다. 더 높은 감도를 위해서는 퍼옥시레독신 기반 roGFP가 더 적합할 수 있습니다(roGFP2Tsa2ΔCR)27.
H 2 O2센서의 산화 정상 상태는 산화 및 환원 속도 모두와 관련이 있습니다. 바이오센서의 산화율은 주로H2O2에 의해 발생하지만, 환원율은 세포와 세포소기관에서 활성화되는 항산화 환원 시스템에 의존한다. HyPer7은 효모 세포질의 티오레독신 시스템에 의해 주로 감소되는 것으로 나타났으며, 그 환원은 roGFP2Tsa2ΔCR27보다 빠릅니다. 그러므로, 프로브의 상이한 환원 메카니즘 및 반응 동역학은H2O2바이오센서의 측정을 해석할 때 고려되어야 한다. 특히, 바이오센서 판독으로부터H2O2수준을 추론하기 위해서는, 환원 시스템이 실험 동안 일정한 용량을 유지한다고 가정해야 한다. 여기에 설명된 스크립트에 대한 대안으로서, 다양한 다른 소프트웨어가 산화 환원 센서(49)의 분석을 위해 자유롭게 이용가능하게 되었다.
중요 단계 모든 바이오센서의 경우, 바이오센서 자체가 측정 공정에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 것이 중요합니다. 따라서 각 실험 조건에서 균주의 성장과 미토콘드리아 형태를 비교하는 것이 중요합니다. 여기에서 미토콘드리아 형태는 막 전위 의존적 방식으로 미토콘드리아를 염색하는 MitoTracker Red를 사용하여 평가됩니다. 그러나 변형되지 않은 세포와 바이오센서로 변형된 세포의 미토콘드리아를 비교하려면 대체 막 전위 감지 미토콘드리아 필수 염료인 테트라메틸로다민 메틸 에스테르(TMRM) 또는 막 전위와 무관하게 미토콘드리아를 염색하는 MitoTracker Green을 사용하여 염색할 수 있습니다. 유해한 영향이 의심되는 경우 표현 수준을 줄이거나 통합 사이트를 변경하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
프로브의 선량-반응 거동과 이미징 기법의 신호 대 노이즈 비율을 검증하는 것도 확실한 결과를 수집하는 데 필수적입니다. 그룹 내의 변동성이 그룹 간의 변동성을 초과하면 차이를 탐지하기가 어려워집니다. 집단 내 변동성은 실제 모집단 변동 또는 검출 과정의 잡음으로 인해 발생할 수 있습니다. 신호:노이즈 비율을 높이는 주요 단계는 이미지 획득(픽셀 값 범위 및 노이즈), 배경 빼기 및 임계값입니다.
계산 단계에서 노이즈 효과를 줄일 수도 있습니다. 가장 간단한 방법은 비율 이미지 측정(Results.csv)에서 가중 평균 강도를 계산하는 것이며, 여기서 각 픽셀은 여기 효율 간의 국소 비율을 나타냅니다. 이렇게 하면 "픽셀 단위" 비율이 생성됩니다. 그러나 영상 신호:잡음 비율이 낮으면 분자 채널과 분모 채널 모두에서 ROI에 대한 가중 평균 강도를 계산한 다음 이 두 가중 평균 간의 비율("지역별" 비율)을 계산하여 보다 강력한 결과를 얻을 수 있습니다.
이진화 방법을 선택하려면 피지 명령 이미지 | 조정 | 자동 임계값 을 사용하여 내장된 모든 피지 방법을 자동으로 시도할 수 있습니다. 세그멘테이션(임계값 설정)을 평가하기 위해 저장된 마스크는 Edit | 선택 | Create Selection을 ROI Manager에 추가하고( T 키를 눌러) Raw 이미지 파일에서 활성화합니다. 미토콘드리아가 적절하게 검출되지 않으면 다른 분할 방법을 시도해야 합니다.
이미지를 비교할 때는 동일한 이미징 조건으로 모든 이미지를 획득하고 동일한 대비 향상으로 모든 이미지를 표시하는 것이 중요합니다.
이미징 조건을 최적화할 때 미토콘드리아 이동을 고려해야 합니다. 미토콘드리아가 405nm와 488nm에서 여기 사이에서 크게 이동하면 비율 이미지가 정확하지 않습니다. 노출 시간을 <500ms로 유지하고 사용 가능한 가장 빠른 방법(예: 트리거 펄스 또는 음향 광학 조정 가능 필터)으로 여기를 변경하는 것이 좋습니다. Z 스택을 캡처할 때 다음 Z 단계로 이동하기 전에 각 Z 단계에 대해 두 가진을 모두 수행해야 합니다.
결과를 표시하기 위해 색조(색상)의 변화는 강도의 변화보다 사람의 눈에 더 분명합니다. 따라서 비율 값은 더 쉽게 시각적으로 해석할 수 있도록 색상 눈금으로 변환됩니다. 컬러화된 이미지는 모든 미토콘드리아 픽셀이 동일한 밝기로 나타나는 비변조 또는 원본 이미지의 픽셀 강도를 사용하여 컬러화된 이미지의 강도를 설정하는 강도 변조될 수 있습니다.
수정 및 문제 해결 파라콰트에 대한 챌린지를 통해 미토콘드리아 기능을 확인하는 대안으로, 세포는 복제 도금되거나 발효성 및 비발효성 탄소원에 접종될 수 있습니다.
배경 빼기의 경우 롤링 볼 빼기( Process | 배경 빼기...) 조명 불균일성을 제거하는 데에도 사용할 수 있습니다. 셀이 있어도 빼는 배경이 변경되지 않는지 확인해야 합니다( 배경 만들기 옵션을 선택하고 결과 검사).
요약하면, mtHyPer7 프로브는 살아있는 세포에서 효모 미토콘드리아의 형태학적 및 기능적 상태를 관련시키기 위한 일관되고 최소 침습적인 방법을 제공하며, 유전적으로 다루기 쉽고 쉽게 접근할 수 있는 모델 시스템에서 중요한 세포 스트레스 요인 및 신호 분자를 연구할 수 있습니다.

미토콘드리아는 산화적 인산화와 전자 수송을 통해 ATP를 생성하는 기능으로 잘 알려진 필수 진핵 세포 소기관이다1. 또한 미토콘드리아는 칼슘 저장, 지질, 아미노산, 지방산 및 철-황 클러스터의 합성, 신호 전달 2,3을 위한 장소입니다. 세포 내에서 미토콘드리아는 세포 유형과 대사 상태에 따라 달라지는 특징적인 형태와 분포를 가진 동적 네트워크를 형성합니다. 또한 미토콘드리아는 융합하고 분열할 수 있지만 세포 내의 모든 미토콘드리아가 동일한 것은 아닙니다. 수많은 연구에서 막 전위 및 산화 상태 4,5,6과 같은 속성에서 개별 세포 내에서 미토콘드리아의 기능적 이질성을 문서화했습니다. 이러한 미토콘드리아 기능의 변화는 부분적으로 mtDNA 돌연변이(핵 DNA보다 더 빠른 비율로 발생)로 인한 세포 소기관의 손상과 세포 기관 내부 및 외부에서 생성된 활성 산소 종(ROS)에 의한 산화 손상에 기인합니다 7,8,9. 세포소기관의 손상은 손상을 복구하거나 수리할 수 없을 정도로 손상된 미토콘드리아를 제거하는 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘에 의해 완화됩니다10.
과산화수소(H2O2)는 세포 단백질, 핵산 및 지질에 대한 산화적 손상의 원인인 활성 산소종입니다. 그러나,H2O2는 표적 단백질(11,12)에서 티올의 가역적 산화를 통해 세포 활동을 조절하는 신호 분자로서도 작용한다. H2 O2 는 미토콘드리아 전자 수송 사슬에서 누출되는 전자와 NADPH 산화 효소 및 모노 아민 산화 효소 13,14,15,16,17,18,19,20과 같은 특정 효소에 의해 생성됩니다. 또한 티오레독신과 글루타티온21,22,23을 기반으로 하는 항산화 시스템에 의해 비활성화됩니다. 따라서 미토콘드리아 H2O2 수준의 분석은 정상적인 미토콘드리아 및 세포 기능과 산화 스트레스 조건에서이 대사 산물의 역할을 이해하는 데 중요합니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 세포 기관(mtHyPer7)을 표적으로 하는 유전적으로 인코딩된 비율계량 H2O2 바이오센서인 HyPer7을 사용하여 미토콘드리아H2O2를 검출하는 것입니다. mtHyPer7은 녹색 형광 단백질(GFP)의 원형 치환 형태인 ATP9의 미토콘드리아 신호 서열(Su9 전서열)과 Neisseria meningitidis24의 OxyR 단백질의 H 2 O2결합 도메인으로 구성된 키메라입니다(그림 1). 원형으로 치환된 GFP에서는, 본래 GFP의 N- 그리고 C 말단은 융합되고 새로운 말단은 본래 GFP25와 비교된 그것의 괴기한 특성의 단백질 그리고 더 중대한 lability에 단백질에 더 중대한 기동성을 나누어 주는 발색단의 가까이에 형성됩니다. mtHyPer7의 OxyR 도메인과 H2O2의 상호 작용은 친화성이 높고H2O2선택적이며보존된 시스테인 잔기 및 이황화물 브리지 형성의 가역적 산화를 유도합니다. OxyR의 산화와 관련된 구조적 변화는 mtHyPer7에서 원형으로 치환된 GFP로 전달되며, 이는 환원 상태의 405nm에서H2O2-산화 상태(26)의 488nm로 mtHyPer7 발색단의 최대 여기의 스펙트럼 이동을 초래한다. 따라서 488nm 대 405nm에서 여기(excitation)에 대한 반응으로 mtHyPer7로부터의 형광 비율은H2O2에 의한 프로브의 산화를 반영합니다.
이상적으로, 바이오센서는 표적 분자에 대한 실시간, 절대적, 정량적 판독값을 제공해야 합니다. 그러나 불행히도 실제 측정에서 이것이 항상 가능한 것은 아닙니다. mtHyPer7과 같은 산화 센서의 경우 실시간 판독값은 이황화 브리지의 감소 속도에 영향을 받습니다. ROS 바이오센서에 의해 사용되는 환원 시스템은 서로 다르며, 이는 티오레독신 시스템에 의해 환원된 HyPer7과 효모 세포질27의 글루타티온에 의해 환원된 roGFP2-Tsa2ΔCR의 비교에서 볼 수 있듯이 프로브 반응 역학을 극적으로 변화시킬 수 있습니다. 따라서 mtHyPer7 비율로부터 상대적인H2O2농도에 대한 결론을 도출하려면 환원 시스템이 실험 중에 일정한 용량을 유지한다고 가정해야 합니다. 이러한 고려사항에도 불구하고, HyPer7 및 관련 프로브는 살아있는 세포(25,28,29)에서H2O2에 관한 정보를 획득하기 위해 다양한 맥락에서 사용되어 왔다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg"> 그림 1: H 2 O2바이오센서 mtHyPer7의 설계, 분자 메커니즘 및 여기/방출 스펙트럼. (A) mtHyPer7 프로브는 Neisseria meningitidis의 OxyR-RD 도메인에 원형 치환된 GFP를 삽입하여 유도됩니다. 그것은 Neurospora crassa (Su9)의 ATP synthase의 subunit 9에서 미토콘드리아 표적화 서열을 포함합니다. (B) mtHyPer7의H2O2-감지 메커니즘의 그림. RD 영역에서 시스테인이 산화되면 488nm에서 여기(excitation) 시 형광 방출이 증가하고 405nm에서 여기(excitation)에 의해 생성된 방출이 감소합니다. (C) 산화 및 환원 형태의 HyPer7의 여기 및 방출 스펙트럼. 이 그림은 Pak et al.24의 허가를 받아 재인쇄되었습니다. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; cpGFP = 원형으로 치환된 GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
mtHyPer7의 이러한 비율계량 이미징은 미토콘드리아H2O2정량 분석에 중요한 이점을 제공합니다24,27; 프로브 집중을 위한 내부 제어를 제공합니다. 또한, H2O2 노광에 의해 생성된 여기 피크의 이동은 H2O2의 포화 농도에서도 완전하지 않다. 따라서 비율 이미징은 분석에 두 개의 스펙트럼 포인트를 통합하여 감도를 높일 수 있습니다.
여기에 사용된 mtHyPer7 프로브는H2O2에 대한 친화도가 매우 높고 pH24에 대한 민감도가 상대적으로 낮으며, 예쁜꼬마선충 미토콘드리아30을 성공적으로 표적으로 삼았습니다. 이 단백질은 효모27,31에도 사용되었습니다. 그러나 이전 연구에서는 mtHyPer7의 플라스미드 매개 발현에 의존했으며, 이로 인해 프로브 발현27에서 세포 간 변동성이 발생했습니다. 또한, 이 프로토콜에 기술된 구조체는 마커가 없는 통합을 위한 CRISPR 기반 접근법을 사용하여 염색체 X32의 보존된 유전자가 없는 영역에 통합되었습니다. 통합된 바이오센서 유전자의 발현은 또한 강력한 구성적 TEF1 프로모터에 의해 조절된다(그림 2). 결과적으로, 플라스미드-매개 바이오센서 발현을 사용하여 관찰된 것과 비교하여 효모 세포 집단에서 바이오센서의 보다 안정적이고 일관된 발현이 존재하며, 바이오센서를 지닌 세포는 선택적 배지를 필요로 하지 않고 증식될 수 있다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg"> 그림 2: CRISPR에 의한 mtHyPer7 발현 세포 생성. Cas9 및 sgRNA 함유 플라스미드(YN2_1_LT58_X2site) 및 PCR 증폭 mtHyPer7 함유 바이오센서 구조체는 리튬 아세테이트 형질전환에 의해 신생 효모 세포에 도입됩니다. 염색체 X(X2)의 유전자 없는 삽입 부위는 sgRNA와 Cas9 단백질에 의해 인식 및 절단되며, 바이오센서는 상동 재조합에 의해 게놈에 통합됩니다. 현미경 스크리닝, 콜로니 PCR 및 시퀀싱에 의해 성공적인 형질전환체를 확인한 후, Cas9 플라스미드는 비선택적 배지에서의 성장에 의해 제거(경화)됩니다. 약어: sgRNA = 단일 가이드 RNA; TEF = 전사 인핸서 인자. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마지막으로, mtHyPer7은 다른 ROS 바이오센서에 비해 장점이 있습니다. 예를 들어, ROS를 검출하는 데 사용되는 유기 염료(예: 디하이드로에티듐[DHE]2 및 MitoSOX3)는 불균일하거나 비특이적인 염색을 생성할 수 있으며 종종 에탄올 또는 디메틸 설폭사이드와 같은 용매로 전달되므로 용매 효과에 대한 추가 제어가 필요합니다. ROS 바이오센서의 또 다른 부류는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 바이오센서(예를 들어, 세포 산화 환원 상태4에 대한 산화 환원 플루오르, 및 과산화물 센서 HSP-FRET5, OxyFRET 6 및 PerFRET6)이다. 이 프로브는 유전적으로 암호화되고 원칙적으로 매우 민감하며 잘 특성화된 미토콘드리아 신호 서열을 사용하여 미토콘드리아를 정량적으로 표적화할 수 있습니다. 그러나 교차 여기(cross-excitation) 및 블리드 스루(bleed-through)로 인한 배경과 FRET가 발생하기 위한 형광단의 근접성 및 방향에 대한 엄격한 요구 사항을 포함하여 FRET 기반 프로브를 사용하는 데 어려움이 있습니다33,34. 또한 FRET 프로브는 스펙트럼 이동 프로브에 비해 관심 세포에서 발현하기 위해 더 큰 구조가 필요한 두 개의 형광 단백질로 구성됩니다. 여기에 설명된 프로토콜은 HyPer7 기반 바이오센서의 강점을 활용하고, 살아있는 효모의 미토콘드리아에서 과산화물의 정량적 이미징을 위해 이 컴팩트하고 비율계량적이며 친화성이 높은 유전자 인코딩 프로브를 사용하기 위해 개발되었습니다.

<table><tbody><tr><td>100x/1.45 Plan Apo Lambda 대물 렌즈</td><td>Nikon</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>아데닌 설페이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Difco</td><td>DF0145170</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Difco</td><td>DF0118170</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Difco</td><td>DF211705</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 효모 추출물</td><td>BD Difco</td><td></td><td></td>DF0127179</tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss Immersol Immersion Oil</td><td>Carl Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>포도당(D-(+)-포도당)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>E. cloni 10G 화학 물질 유능한 세포</td>, <td>Bioserch Technologies</td><td>, 60108</td><td></td></tr>, <tr><td>FIJI</td>, <td>NIH</td><td></td>, <td>Schindelin et al, 2012</td></tr>, <tr><td>G418 (Geneticin)</td><td>Sigma-Aldrich</td>, <td>A1720</td><td></td></tr>, <tr><td>GFP 방출 필터</td><td>, Chroma</td><td></td><td>525/50</td></tr>, <tr><td>Gibson 어셈블리</td>, <td>New England Biolabs,</td><td>E2611</td><td></td></tr>, <tr><td>Graphpad, Prism 7</td>, <td>GraphPad</td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>H2O2(안정)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td><td>Pon Lab</td><td>JYE057/EP41</td><td>Liao et al 20201</td></tr><tr><td>인큐베이터 셰이커</td>, <td>New Brunswick Scientific</td><td>E24</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR 키트</td>, <td>Roche 시퀀싱 및 생명 과학, Kapa Biosystems, 매사추세츠 주 윌밍턴</td><td>KK1006</td><td></td></tr><tr><td>L-아르기닌 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8094</td><td></td></tr><tr><td>레이저</td><td>애질런트</td><td></td><td>405 및 488nm</td></tr><tr><td>L-히스티딘 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>H5659</td><td></td></tr><tr><td>L-류신</td><td>시그마-알드리치</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신 염산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-페닐알라닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5482</td><td></td></tr><tr><td>L-트립토판</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8941</td><td></td></tr><tr><td>L-티로신</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8566</td><td></td></tr><tr><td>mHyPer7 플라스미드</td><td>이 연구</td>는 <td>JYE116</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버슬립</td><td>ThermoScientific</td><td>3406</td><td>#1.5 (170 &마이크로; m 두께)</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>ThermoScientific</td><td>3050</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>M7513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>현미경 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>니콘 Ti 이클립스 반전 현미경</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라콰트 (메틸 바이올로겐 디클로라이드 수화물)</td> <td>시그마-알드리치</td><td>Cat. 856177&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RStudio</td><td>Posit.co</td><td>무료 데스크탑 버전</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Beckman</td><td>BU530</td><td></td></tr><tr><td>Stagetop 인큐베이터</td><td>Tokai Hit</td><td>INU</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>아미노산이 없는 황산암모늄을 함유한 효모 질소 염기(YNB)</td><td>BD Difco</td><td>DF0919073</td><td></td></tr><tr><td>YN2_1_ LT58_X2site</td><td>Addgene</td><td></td><td>177705 Pianale 외 2021</td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCMOS 카메라</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mthyper7의 이미징

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

미토콘드리아 기능 장애 또는 기능 변화는 신경 퇴행성 및 근골격계 질환, 암 및 정상적인 노화를 포함한 많은 질병과 상태에서 발견됩니다. 여기에서, 유전적으로 인코딩된, 최소 침습적, 비율계량 바이오센서를 사용하여 세포 및 세포 내 해상도에서 살아있는 효모 세포의 미토콘드리아 기능을 평가하는 접근법을 설명합니다. 바이오센서인 미토콘드리아 표적 HyPer7(mtHyPer7)은 미토콘드리아에서 과산화수소(H2O2)를 검출합니다. 이는 원형으로 치환된 형광 단백질에 융합된 미토콘드리아 신호 서열과 박테리아 OxyR 단백질의H2O2-반응 도메인으로 구성됩니다. 바이오센서는 플라스미드 기반 구조에 비해 더 일관된 발현을 위해 CRISPR-Cas9 마커가 없는 시스템을 사용하여 생성되고 효모 게놈에 통합됩니다.
mtHyPer7은 미토콘드리아를 정량적으로 표적으로 하고, 효모 성장률이나 미토콘드리아 형태에 검출할 수 있는 영향을 미치지 않으며, 정상적인 성장 조건 및 산화 스트레스에 노출될 때 미토콘드리아H 2 O2에 대한 정량적 판독값을 제공합니다. 이 프로토콜은 스피닝 디스크 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 이미징 조건을 최적화하고 무료로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 정량 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 이러한 도구를 사용하면 세포 내 및 집단 내 세포 간 모두에서 미토콘드리아에 대한 풍부한 시공간 정보를 수집할 수 있습니다. 또한, 여기에 설명된 워크플로우는 다른 바이오센서를 검증하는 데 사용할 수 있습니다.

mtHyPer7이 미토콘드리아H2O2를 평가하기에 적합한 프로브임을 확인하기 위해 mtHyPer7의 국소화와 효모 미토콘드리아 및 세포 건강에 미치는 영향을 평가했습니다. mtHyPer7의 표적화를 평가하기 위해 미토콘드리아를 mtHyPer7을 발현하는 대조군 효모 세포와 효모에서 중요한 미토콘드리아 특이적 염료인 MitoTracker Red로 염색했습니다. MitoTracker Red 염색을 사용하여 미토콘드리아는 모-새싹 축을 따라 정렬되고 새싹 끝과 새싹 원위부에 있는 모세포 끝단에 축적된 긴 관형 구조로 분해되었습니다(41). 미토콘드리아 형태는 대조군과 mtHyPer7 발현 세포에서 유사했습니다. 또한 mtHyPer7은 MitoTracker Red-stained 미토콘드리아와 함께 국소화되었습니다(그림 3A). 따라서 mtHyPer7은 정상적인 미토콘드리아 형태나 분포에 영향을 미치지 않고 미토콘드리아를 효율적이고 정량적으로 표적으로 삼았습니다.
다음으로, 미토콘드리아의 세포 적합성 및 산화 스트레스에 대한 민감도에 대한 mtHyPer7의 효과를 평가하기 위해 추가 검증 실험을 수행했습니다. 농축 또는 합성 포도당 기반 배지(각각 YPD 또는 SC)에서 mtHyPer7 발현 세포의 성장률은 형질전환되지 않은 야생형 세포의 성장률과 유사합니다(그림 3B,D). 미토콘드리아의 산화 스트레스에 대한 가능한 영향을 평가하기 위해 대조군 및 mtHyPer7 발현 효모를 미토콘드리아에 축적되어 세포 소기관24,27에서 과산화물 수준을 높이는 산화 환원 활성 소분자인 낮은 수준의 파라콰트로 처리했습니다. mtHyPer7 발현이 미토콘드리아의 산화 스트레스를 유도하거나 산화 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하는 경우, mtHyPer7 발현 세포는 파라콰트 처리에 대한 민감도가 각각 증가하거나 감소해야 합니다. 낮은 수준의 파라콰트를 사용한 처리는 효모 성장률의 감소를 초래했습니다. 더욱이, 파라콰트의 존재 하에서 야생형 및 mtHyPer7 발현 세포의 성장률은 유사하였다(그림 3C,E). 그러므로, 바이오센서의 발현은 발아 효모 세포에서 현저한 세포 스트레스를 생성하거나 미토콘드리아 산화 스트레스에 대한 효모의 민감성을 변화시키지 않았다.
mtHyPer7이 신진 효모에서 미토콘드리아 H 2 O 2 를 연구하는 데 적합하다는 증거를 감안할 때, mtHyPer7이 중간 로그 단계 야생형 효모에서 미토콘드리아 H 2 O 2 와 외부에서 첨가 된 H 2 O2에 의해 유도 된 미토콘드리아 H 2 O 2의 변화를 검출 할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. H2O2적정 실험을 수행하고, 미토콘드리아에서 평균 산화:환원(O/R) mtHyPer7 비율을 측정하였다.
자동화된 분석 스크립트는 여러 출력 파일을 생성했습니다.
비율 이미지(ratio.tif): 배경 보정되고 임계값이 있는 488nm 및 405nm 스택의 비율로 구성된 Z 스택입니다. 이 스택은 추가 처리 없이 피지에서 볼 수 있습니다. 그러나 보기 전에 프로토콜 단계 4.3 또는 5.6에 설명된 대로 대비를 높이거나 이미지를 채색하는 것이 좋습니다.
마스크 이미지(mask.tif): 분석에 사용되는 임계값 미토콘드리아 영역으로 구성된 Z 스택입니다. 이 이미지는 임계값의 정확도를 평가하는 데 사용해야 합니다.
분석에 사용되는 ROI(ROIs.zip): 이 파일을 피지에서 열면 원본 이미지와 함께 ROI가 이미지에 겹쳐져 결과 테이블과 원본 이미지를 상호 참조합니다. 각 ROI는 셀 번호와 ROI 번호로 이름이 바뀝니다.
분자, 분모 및 비율 이미지의 각 슬라이스에 대한 임계값 미토콘드리아의 면적, 평균 및 통합 밀도를 포함하는 측정 테이블(NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv). 미토콘드리아가 없거나 초점이 맞지 않는 절편에서는 NaN이 기록됩니다.
배경 및 노이즈 보정, 임계값 설정 및 비율 계산에 사용되는 옵션을 문서화하는 로그 파일(Log.txt)입니다.
mtHyPer7의 O/R 비율은 외부에서 첨가된1-2mM에서 정체기에 도달한H2O2농도에 대한 용량 의존적 반응을 나타냈다(도 7). 놀랍게도, HyPer7 비율은 대조군보다 0.1mMH2O2에 노출된 세포에서 더 낮았지만, 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 이 현상에 대한 한 가지 설명은 낮은 수준의 스트레스 요인에 대한 노출이 항산화 메커니즘과 같은 스트레스 반응을 유도할 수 있는 호르메시스 반응일 수 있으며, 이는 차례로 프로브에 의해 검출될 수 있는 ROS의 양을 낮춥니다. 반대로 스트레스 요인 수준이 높을수록 내부 스트레스 반응을 압도하여 HyPer7의 판독값이 높아질 수 있습니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg"> 그림 7 : 외부에서 첨가 된 H 2 O 2에 대한 mtHyPer7의 반응. (A) 405 nm 및 488 nm 여기 이미지의 최대 투영 및 H 2 O 2 농도의 중간 로그 상 셀에서 mtHyPer7의 비율 계량 이미지의 평균 강도 투영. 의사 색상은 산화:감소된 mtHyPer7 비율(하단의 배율)을 나타냅니다. 눈금 막대 = 1μm. 셀 윤곽선은 흰색으로 표시됩니다. n &gt; 조건당 100개 셀. (B) 다른 농도의 H 2 O2 로 처리 된 신진 효모 세포에서 mtHyPer7 산화 : 감소 된 비율의 정량화. 5개의 독립적인 시행의 평균이 표시되며, 각 시행마다 모양과 색상이 다른 기호가 표시됩니다. 산화 : 환원 된 mtHyPer7 비율의 평균 ± SEM : 1.794 ± 0.07627 (처리 없음), 1.357 ± 0.03295 (0.1 mM), 2.571 ± 0.3186 (0.5 mM), 6.693 ± 0.5194 (1 mM), 7.017 ± 0.1197 (2 mM). p &lt; 0.0001(Tukey의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석). p 값은 ****p &lt; 0.0001로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마지막으로, 이전 연구에서는 더 환원되고 과산화물을 덜 함유하는 더 적합한 미토콘드리아가 효모 딸 세포(yeast daughter cell)4에 의해 우선적으로 유전되고, 세포질 카탈라아제(cytosolic catalase)가 효모 딸 세포(yeast daughter cell)로 운반되어 활성화된다는 것을 밝혔다(42,43,44,45). 이 연구는 효모 세포 분열 중 미토콘드리아의 비대칭 유전과 딸 세포 적합성 및 수명, 모녀 연령 비대칭에서 이 과정의 역할을 문서화합니다. H2O2의 차이가모체와 새싹 사이에 존재하는지 여부를 테스트하기 위해, mtHyPer7을 새싹과 모세포에서 측정하였다. 효모 세포 내에서 미토콘드리아H 2 O 2 의 차이가 관찰되었으며, H 2 O 2 바이오 센서 판독 값의 미묘하지만 통계적으로 유의한감소가 모세포의 미토콘드리아와 비교하여 새싹의 미토콘드리아에서 감지되었습니다 (그림 8). 이러한 발견은 새싹의 미토콘드리아가 산화 스트레스로부터 더 잘 보호된다는 이전 발견과 일치합니다. 또한 mtHyPer7이 신진 효모의 세포 및 세포 내 분해능으로 미토콘드리아 H 2O2에 대한 정량적 판독 값을 제공 할 수 있다는 문서를 제공합니다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg"> 그림 8: 미토콘드리아 H2 O2 수준은 딸 세포에서 더 낮습니다. (A) 대표 셀에서 mtHyPer7의 비율계량 이미지의 최대 투영. 의사 색상은 산화:감소된 mtHyPer7 비율(하단의 배율)을 나타냅니다. 비율의 세포 내 차이가 분명합니다 (화살촉). 눈금 막대 = 1μm. 셀 윤곽선: 흰색. (B) 새싹과 모세포의 mtHyPer7 비율의 차이. 각 개별 셀에 대해 새싹 비율 값에서 어머니 비율 값을 빼고 점으로 표시했습니다. n = 5개의 독립적인 실험에서 풀링된 193개의 세포, 각 실험에 대해 서로 다른 색상의 기호로 표시됨. 새싹과 모세포의 mtHyPer7 비율 차이에 대한 평균 ± SEM: -0.04297 ± 0.01266. p = 0.0008(쌍체 t-검정) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 S1: 본 연구에서 사용된 균주. 사용 된 효모 균주 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%201%20Strains%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 S2: 본 연구에 사용된 플라스미드. 사용된 플라스미드 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental%20Table%202%20Plasmids%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충표 S3: 본 연구에 사용된 프라이머. 사용된 프라이머 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%203%20Primers%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 바이오센서 플라스미드 구축을 위한 프로토콜. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang%20et%20al%20Supp%20Protocol%202023.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 자동화된 분석을 위한 스크립트. 각 스크립트에 대해 샘플 입력 파일 및 출력 파일이 제공됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

과산화수소 (H 2 O2)는 산화 손상의 원인이자 신호 분자입니다. 이 프로토콜은 살아있는 효모에서 유전적으로 인코딩된 비율계량 바이오센서인 미토콘드리아 표적 HyPer7(mtHyPer7)을 사용하여 미토콘드리아H2O2를 측정하는 방법을 설명합니다. 무료로 제공되는 소프트웨어를 사용하여 이미징 조건을 최적화하고 정량적 세포 및 세포 내 분석을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다.

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

미토콘드리아는 에너지 동원, 중추 대사, 중요한 거대분자 생산, 칼슘 저장 및 신호 전달을 촉진하는 세포 내 세포 기관입니다. 결과적으로 세포 기능, 체력 및 수명 조절에 중요한 역할을 합니다. 우리의 연구는 신생 효모인 맥주효모균 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 모델 유기체로 사용하여 미토콘드리아가 노화에 미치는 영향을 조사하는 데 중점을 둡니다.살아있는 세포 이미징은 미토콘드리아 기능의 변화를 관찰할 수 있는 최고의 도구입니다. 여기서는 미토콘드리아 HyPer7이라고 하는 유전적으로 인코딩된 비율 메트릭 스펙트럼 이동 바이오센서를 활용하는 방법을 설명합니다. mtHyPer7은 세포 구성 요소를 손상시킬 수 있는 활성 산소종인 과산화수소를 검출하지만 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 신호 분자로도 기능합니다.mtHyPer7은 과산화수소에 대한 친화력이 높고 pH에 대한 민감도가 낮습니다. 효모 게놈에 통합되어 효모 세포 집단에서 안정적이고 일관된 발현을 초래합니다. 마지막으로, 미토콘드리아를 정량적으로 표적으로 하며 세포 또는 미토콘드리아 기능이나 체력에 감지할 수 있는 영향을 미치지 않습니다.mtHyPer7과 같은 바이오센서는 세포 내 해상도에서 미토콘드리아 기능을 연구하고, 미토콘드리아 품질 관리의 기초가 되는 메커니즘을 찾고, 해당 과정이 세포 적합성, 사료 및 수명에 미치는 영향을 조사하는 데 매우 중요합니다. mtHyPer7 염색제는 활성산소종 검출에 사용되는 유기 염료와 달리 일관된 노동력을 제공합니다. FRET 기반 센서에 비해 mtHyPer7은 더 컴팩트하며 교차 여기 및 블리드 스루와 같은 문제는 물론 FRET의 정확한 위치 지정 및 방향 요구 사항을 방지합니다.

imaging-mthyper7-ratiometric-biosensor-for-mitochondrial-peroxide

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 살아있는 효모 세포에서 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 모니터링하기 위해, GFP를 기반으로하는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다.

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