Name: 투과 전자 현미경 워크플로우, 결과 분석 및 데이터 관리에 대한 머신 비전 접근 방식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 머신 비전 기반 투과 전자 현미경 워크플로우와 데이터 관리 방법을. 실시간 전자선 선량 추적 및 자동화된 교정 알고리즘을 활용하여 복잡한 데이터셋 분석 효율성을 높이고 실험 재현성을 향상시킵니다.

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이 작업은 노스 캐롤라이나 주와 국립 과학 재단 (수상 번호 ECCS-2025064)이 지원하는 노스 캐롤라이나 주립 대학의 분석 계측 시설 (AIF)에서 부분적으로 수행되었습니다. AIF는 NNCI(National Nanotechnology Coordinated Infrastructure)의 사이트인 RTNN(North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network)의 회원입니다. 저자는 200kV CFEG 제올라이트 선량 임계 값 연구 결과를 제공 한 파리 시테 대학의 CNRS 연구 책임자 인 Damien Alloyeau에게 감사드립니다.

1. 방법 1: TEM 및 주사 TEM(STEM) 이미징 모드를 위한 투과 전자 현미경의 선량 보정
<ol><li>피코 전류계를 켜고 선량 보정을 시작하기 전에 최소 30분 동안 예열하십시오. 선량 교정 홀더를 TEM에 로드하고 빠른 연결 케이블을 사용하여 교정 홀더를 피코 전류계에 연결합니다.</li>
	<li>TEM 모드의 현미경에서 컬럼 밸브를 열고 선량 홀더에서 35μm 기준 구멍을 찾습니다(그림 2). MVS 소프트웨어 애플리케이션을 실행하고 실험 옵션에서 Dose(교정 자동화)를 선택합니다. 알림: 기준 구멍 위치는 초기 교정 후 소프트웨어에 의해 저장되므로 소프트웨어가 향후 교정을 위해 자동으로 위치를 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>연결 아이콘(그림 1A)을 클릭하고 현미경을 선택하여 TEM과 MVS 소프트웨어 간의 연결을 활성화합니다. 연결되면 카메라/감지기의 이미지가 소프트웨어의 이미지 뷰어에 표시됩니다. 알림: 유센트릭 높이를 최적화할 필요는 없으며 팁의 두께로 인해 기준 구멍의 가장자리가 흐릿하게 나타날 수 있습니다. 이것은 현재 측정에 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>Dose(용량) 탭으로 이동한 다음 Dose Calibration(용량 보정)으로 이동합니다. 선량 영역 보정 프로세스를 선택하고 소프트웨어 프롬프트에 따라 요청된 사용자 구성 가능한 값(예: 조리개 및 모노크로메이터 설정)을 입력합니다. 선량 영역 교정이 완료된 후 선량 전류 교정 프로세스를 선택하고 소프트웨어 프롬프트를 따릅니다.</li>
	<li>실험 중에 사용할 수 있는 각 스폿 크기, 조리개 또는 모노크로메이터 설정에 대해 보정 프로세스(1.4단계)를 반복합니다.</li>
	<li>TEM 모드에 대한 보정 프로세스가 완료되면 1.4단계를 반복하여 STEM 모드에 대한 전자 선량을 보정합니다. 알림: STEM 모드에서는 선량 영역 보정 을 수행할 필요가 없습니다.</li>
	<li>원하는 모든 교정이 완료되면 세션 닫기를 클릭하고 선량 교정 홀더를 제거한 다음 MVS 소프트웨어의 시작 화면으로 돌아갑니다.</li>
</ol>2. 방법 2: MVS 및 선량 소프트웨어를 사용한 선량 역치 결정
<ol><li>샘플과 함께 표준 TEM 그리드(시판되는 ZSM-5 제올라이트 나노입자가 이 예에서 사용됨)를 표준 TEM 홀더에 로드합니다. 홀더를 TEM에 삽입하고 관심 영역(결정질 제올라이트 나노입자)을 찾습니다.</li>
	<li>MVS 소프트웨어 응용 프로그램을 열고 기타를 선택합니다. 참고: 샘플에 대한 추가 정보(예: 샘플 식별자 및 설명, 작업자 이름, 실험 노트)를 실험 매개변수 필드에 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>1.3단계를 반복하여 MVS 소프트웨어에 연결하고 MVS 소프트웨어 인터페이스의 이미지 메타데이터 탭으로 이동하여 라이브 디스플레이에 표시된 이미지 스트림에 오버레이할 배율, 최대 선량 및 선량률 메타데이터를 선택합니다. 사용자가 원하는 경우 다른 메타데이터가 포함될 수 있다. 용량 관리 제어를 보여주는 MVS 소프트웨어 인터페이스의 스크린샷은 보충 파일 1에 나와 있습니다.</li>
	<li>Dose(선량) 탭을 열고 Dose Management(선량 관리) 및 Enable Dose Monitoring(선량 모니터링 활성화)을 선택하여 자동 전자 선량 추적을 활성화합니다. Show Dose Layer(선량 레이어 표시)를 선택하여 선량 색상 오버레이를 표시합니다.</li>
	<li>고선량 수준 및 고선량률에 대한 값을 설정하고 저장을 누릅니다(이 예에서는 각각 60,000 e-/Å 2 및 500 e-/Å2·s 값이 사용됨).</li>
	<li>Settings(설정) 탭으로 이동하여 Dose(선량)를 선택하고 Dose Navigation Map Opacity(선량 탐색 맵 불투명도) 및 Dose Image Overlay Opacity(선량 이미지 오버레이 불투명도) 값을 설정합니다(이 예에서는 각각 0.50 및 0.30 값이 사용됨). </li>
	<li>라이브 이미지 뷰어(Live Image Viewer) 창에서 드리프트 보정(Drift Correct)을 클릭하여 드리프트 보정을 활성화합니다.</li>
	<li>Data View 탭으로 이동하여 메타데이터 값 Defocus 및 Focus Quotient를 Y축에 플로팅합니다. 참고: 사용 가능한 메타데이터 값은 실험 중에 데이터 보기 테이블에서 실시간으로 그릴 수 있습니다.</li>
	<li>Focus Assist를 활성화한 다음 Calibrate Focus(초점 보정)를 선택하여 자동 초점 지원 보정을 실행합니다. 초점 보정 루틴이 완료되면 데이터 보기 탭을 닫습니다.</li>
	<li>MVS 소프트웨어에서 Image Analysis 탭을 열고 Live FFT 및 Quadrant 1 & 2 옵션을 활성화하십시오.</li>
	<li>현미경의 소프트웨어 컨트롤을 사용하여 전자 플럭스가 ~500e-/Å2·s가 되도록 빔 조건을 조정하고 샘플의 새 영역으로 이동하고 MVS 소프트웨어의 라이브 뷰에서 샘플 ROI를 중앙에 배치합니다. 알림: 큰 s를 만들 때tage 이동, 드리프트 제어 및 초점 지원은 자동으로 비활성화되며 새 ROI가 선택되면 다시 참여해야 합니다.</li>
	<li>Tag 기능을 사용하여 소프트웨어의 복용량 조건을 기록해 두십시오. 태그 아이콘을 강조 표시하고 원하는 텍스트를 입력하여 타임라인 내의 특정 이미지 시리즈를 나타냅니다. 태그 아이콘이 선택 취소될 때까지 이미지에 이 텍스트로 태그가 지정됩니다.</li>
	<li>FFT 플롯의 원자 구조에 해당하는 피크가 사라질 때까지 동일한 ROI를 지속적으로 이미징하면서 일정한 선량률을 유지합니다.</li>
	<li>배율을 줄이고, 선량 관리 탭을 열고, 선량 레이어 표시를 활성화하여 색상으로 구분된 선량 맵을 오버레이합니다. 참고: 이 기능은 s의 영역에 대한 시각적 참조를 제공합니다.amp전자빔에 노출된 영역과 상대 선량 노출. 커서로 개별 이미지에서 이러한 영역을 강조 표시하면 해당 선량 값이 표시됩니다.</li>
	<li>연결을 끊고 Connect(연결)를 선택 취소하여 세션을 종료한 다음 Close Session(세션 닫기)을 선택합니다. MVS 소프트웨어에 저장된 데이터가 후속 실험 중에 겹쳐쓰여지지 않도록 세션 데이터의 사본을 외부 소스에 저장합니다(보충 파일 2).</li>
</ol>3. 방법 3 : 분석 소프트웨어를 사용하여 메타 데이터 및 추세 분석 및 데이터 내보내기
<ol><li>분석 소프트웨어(완전히 동기화된 데이터 세트를 보기 위한 오프라인 소프트웨어)를 실행하고 파일 라이브러리에서 실험 세션 파일을 선택하여 엽니다. 참고: 사용자는 실험 중에 MVS 소프트웨어의 세션 검토 아이콘을 통해 분석 소프트웨어에 액세스할 수도 있습니다.</li>
	<li>이미지 뷰 포트 아래의 DC 탭을 활성화하여 드리프트 보정된 이미지를 표시하고 이미지 메타데이터 탭에서 해당 오버레이 데이터 상자를 선택하여 원하는 데이터 오버레이를 선택합니다(이 예에서는 현미경, 날짜/시간, 선량률, 최대 선량 및 배율이 사용됨). 다른 메타데이터는 사용자가 원하는 대로 플롯팅될 수 있다.</li>
	<li>Max Dose 및 Dose Rate에 대한 타임라인 상자를 선택하여 이러한 값의 그래픽 플롯을 타임라인에 추가합니다. 이러한 그래픽 플롯을 강조 표시하거나 스크롤하여 뷰포트에 표시된 이미지를 업데이트합니다. Notes(메모), Image Analysis(이미지 분석), Toolbox(도구 상자) 및 Data View(데이터 보기) 탭을 통해 다양한 도구에 액세스할 수 있습니다.<ol><li>이미지 분석 탭을 통해 각 이미지에 대한 FFT에 액세스하고 라이브 FFT를 클릭하여 이미지를 스크롤하는 동안 FFT를 업데이트합니다.</li>
		<li>FFT 피크의 페이딩을 사용하여 제올라이트 구조가 결정성을 잃는 시점을 결정합니다. 해당 이미지로 기록된 최대 선량 값을 기록합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>필터 옵션을 사용하면 연결된 메타데이터의 손실 없이 큰 데이터 세트를 더 작고 공유 가능한 데이터 세트로 쉽게 필터링할 수 있습니다. 필터 패널을 열고 선량률이 ~500 e-/Å2·s 이상인 데이터만 선택되도록 슬라이더를 조정하고 선량 임계값 연구라는 이름을 사용하여 새 컬렉션을 저장합니다. 참고: 연결된 메타데이터 형식 중 하나에 대해 필터를 적용할 수 있습니다.</li>
	<li>세션의 이미지와 메타데이터를 스케일 막대 및 메타데이터 오버레이로 보강된 다른 파일 형식으로 내보냅니다.<ol><li>라이브러리 창에서 컬렉션을 강조 표시하고 선택 항목을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 Publish 를 선택합니다. Publish( 게시 ) 창에서 파일 형식 내보내기에 대해 원하는 옵션을 선택합니다.</li>
		<li>드리프트 보정 데이터 탭을 선택하고 원하는 메타데이터와 FFT의 오버레이를 적용합니다(FFT 오버레이를 원하는 대로 배치합니다. FFT로 내보낸 이미지의 예는 그림 3 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>동일한 [제작 ] 옵션을 사용하여 이미지 시리즈를 동영상 파일로 내보냅니다. 타임라인에서 이미지를 강조 표시하거나, 필터 옵션을 사용하거나, 전체 데이터베이스 파일을 내보내 이미지를 선택합니다. 원하는 동영상 형식, 프레임 속도 및 파일 위치를 선택합니다. 200 kV TEM을 사용하여 얻어진 제올라이트 분해 실험의 동영상은 보충 파일 3에 제공된다.</li>
	<li>게시하는 동안 메타데이터(CSV) 옵션을 선택하여 획득한 이미지와 별도로 메타데이터를 CSV 파일로 내보냅니다. 참고: Raw 및 드리프트 보정 이미지는 별도의 CSV로 내보내집니다(보충 파일 4 및 보충 파일 5).</li>
</ol>4. 방법 4 : 산화철 나노 입자에 대한 금의 현장 가열 연구
<ol><li>에탄올에 현탁된 나노촉매(Au/FeOx)를 현장 히터 E-칩, 미코-일렉트로니컬(MEM) 샘플 지지체에 떨어뜨리고 자연 건조시킵니다. 샘플을 현장 가열 홀더에 장착하고 샘플이 있는 홀더를 TEM에 삽입하고 제공된 케이블을 사용하여 홀더를 전원 공급 장치에 연결합니다. TEM 컨트롤을 사용하여 샘플 ROI를 찾습니다. 참고: 이 실험은 MVS 소프트웨어와 완전히 통합된 가열 홀더를 사용하여 온도 메타데이터를 이미지에 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>MVS 소프트웨어에서 적절한 워크플로우 옵션을 선택합니다(이 예에서는 Fusion 워크플로우 가 사용되었지만 기타를 선택하여 다른 제조업체 가열 홀더를 사용할 수 있음).</li>
	<li>워크플로 프롬프트에 따라 보정 파일을 로드하고 장치 점검을 수행하여 홀더와 가열 E-칩 사이의 전기적 연결을 확인합니다. </li>
	<li>앞의 2.3-2.10단계에서 설명한 대로 현미경을 MVS 소프트웨어에 연결하고(이 예에서는 선량률, 최대 선량, 일치 상관관계, 드리프트 속도 및 채널 A 온도에 대한 메타데이터 값이 선택됨) 샘플 ROI를 시야의 중앙에 배치합니다.</li>
	<li>Fusion AX 탭을 열고 온도를 설정하고 적용합니다.</li>
	<li>채널 A 설정 버튼을 클릭하여 온도 제어 설정에 액세스합니다. 온도 기능과 수동 제어 모드를 선택합니다.</li>
	<li>실험 버튼을 클릭하여 실험 컨트롤에 액세스합니다. Ramp 속도를 10°C/s로 설정하고 목표를 600°C로 설정합니다. 적용 을 클릭하여 실험을 시작합니다. 참고: Fusion AX 탭을 열지 않고도 MVS 소프트웨어의 오른쪽 하단 모서리에 있는 빠른 액세스 버튼을 사용하여 언제든지 실험을 일시 중지하거나 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>설정 온도인 600°C에 도달하면 Fusion AX 탭을 열고 실험을 선택합니다. 램프 속도를 2°C로, 목표를 800°C로 변경합니다. 적용을 클릭하여 실험을 시작합니다. 알림: 가열 r을 적용하는 절차amp 사용되는 현장 난방 시스템에 따라 다릅니다. 온도 램프를 적용하기 위해 위에서 강조 표시된 단계는 이 예에서 사용된 시스템에 적용됩니다.</li>
	<li>2.10단계와 같이 태깅 기능을 사용하여 실험 중에 이벤트 또는 관심 지점을 강조 표시합니다. 샘플을 계속 이미지화하고 원하는 대로 온도 프로파일을 조정합니다. 완료되면 세션 종료 를 클릭하고 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 저장합니다(대표 결과에서 논의된 데이터베이스 파일의 일부는 보충 파일 6으로 제공됨).</li>
	<li>분석 소프트웨어를 열어 세션을 검토합니다. 온도, 템플릿 모핑 계수, 선량률 및 누적 선량을 타임라인에 표시합니다. 3.6단계와 3.7단계에서 설명한 단계를 사용하여 원하는 대로 이미지와 동영상을 내보냅니다. 이미지와 동영상은 선량 맵 오버레이를 사용하거나 사용하지 않고 내보낼 수 있습니다(그림 4).</li>
</ol>

머신 비전 접근 방식을 사용한 TEM 워크플로우, 결과 분석 및 데이터 관리

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</ol>

모든 저자는 Protochips, Inc.의 직원입니다.

TEM 실험 결과의 해석은 종종 현미경 설정, 이미징 조건, 그리고 operando 또는 in situ 실험의 경우 환경 또는 자극의 변화와 같은 많은 상호 연결된 실험 매개변수에 따라 달라집니다 1,23. 이러한 파라미터가 지속적으로 수정될 수 있는 대규모 TEM 데이터 세트의 정확한 분석을 위해서는 실험실 저널 또는 기타 외부 문서 소스에 각 이미지에 대한 각 조건과 설정을 정확하게 기록하기 위해 작업자의 상당한 주의가 필요합니다. TEM 데이터 세트의 크기와 복잡성이 증가함에 따라 수동 기록 보관을 관리할 수 없게 되고 주요 정보가 누락되거나 부정확하게 기록될 수 있습니다. 여기에 설명된 MVS 소프트웨어는 현미경, 검출기/카메라 및 기타 시스템(예: 현장 샘플 홀더)에서 실험 중에 생성된 메타데이터를 통합하고 해당 이미지와 정렬합니다.
메타데이터 통합 외에도 이 소프트웨어는 머신 비전 알고리즘을 적용하여 드리프트 보정 및 초점 지원 기능을 사용하여 공간, 빔 및 디지털 보정의 조합을 통해 시야를 추적하고 안정화합니다. 드리프트 보정 기능이 사용되면 MVS 소프트웨어로 가져온 첫 번째 이미지를 사용하여 교차 상관 '템플릿' 이미지가 생성됩니다. 그런 다음 템플릿을 들어오는 이미지와 비교하여 샘플 드리프트 또는 이동의 방향과 크기를 계산합니다. 이 정보를 통해 MVS 소프트웨어는 스테이지 위치, 빔 또는 이미지 이동, 디지털 이미지 보정의 세 가지 매개변수 중 하나 이상을 조정하여 이미지 기능을 동일한 위치에 유지하는 데 필요한 보정을 자동으로 적용합니다. 포커스 어시스트 기능은 알고리즘 조합을 활용하여 각 이미지에 초점 점수라고 하는 초점 값을 할당하고, 이 점수를 비교하여 샘플의 초점을 유지하기 위해 적용할 디포커스 조정의 크기와 방향을 결정합니다. STEM 이미징 모드에서 MVS 소프트웨어는 초점 점수를 할당하기 위해 정규화된 분산의 독점 버전을 통해 대비를 최대화하려고 시도합니다. TEM 모드에서는 FFT에서 방사형 강도 합이 계산되어 초점 점수를 계산하는 데 사용됩니다. MVS 소프트웨어가 이미지에 대한 올바른 초점 점수를 정확하게 계산할 수 없을 때 초점을 최적화하는 기능에 대한 제한이 발생합니다. 이는 일반적으로 현미경이 잘못 정렬되거나 보정 중에 샘플의 초점이 크게 맞지 않아 소프트웨어가 올바른 시작 초점 점수 값을 올바르게 계산하지 못할 때 발생합니다. MVS 소프트웨어는 FFT의 격자 무늬가 초점 점수 알고리즘을 '압도'할 수 있기 때문에 잘 정의된 격자 무늬가 있는 샘플에 대한 초점 점수를 계산하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 샘플이 초점에서 벗어나면 초점 점수가 초점 변화를 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 반대로, 낮은 배율이나 낮은 FFT 신호를 가진 샘플로 작업하면 좋은 초점 점수를 계산하기가 어려울 수 있습니다. 이러한 어려움을 완화하기 위해, MVS 소프트웨어는 디폴트 설정이 샘플에 적합하지 않은 경우 포커스 스코어를 계산하기 위해 사용자에 의해 선택될 수 있는 다수의 추가 알고리즘을 포함한다. 주어진 실험에 가장 적합한 알고리즘을 결정하기 위해 사례별로 테스트하고 적용해야 합니다.
시간 경과에 따른 샘플 구조의 형태학적 변화는 템플릿 모핑 인자를 사용하여 설명됩니다. 이 필터는 등록 알고리즘이 시간 경과에 따른 형태학적 변화를 설명하도록 연산자에 의해 조정될 수 있습니다. 또한 이 소프트웨어는 연속 이미지, 현미경 설정, 카메라 또는 검출기 설정을 모니터링하여 시료 구조의 변화로 인해 트리거될 때와 작업자가 현미경, 카메라 또는 검출기 매개변수를 변경한 후 템플릿을 자동으로 업데이트합니다. 그림 4, 그림 5, 보충 파일 7 및 보충 파일 8에서 볼 수 있듯이 MVS 소프트웨어는 효과적이고 즉각적인 안정화를 제공하여 동적으로 이동하거나 변화하는 샘플의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다. 이 소프트웨어는 현장 실험 중에 가열 램프를 적용할 때 발생하는 것과 같이 매우 높은 드리프트 또는 샘플 이동 속도를 제어할 수 있지만 , 샘플이 매우 빠르게 움직이거나 드리프트하는 경우 소프트웨어가 제어할 수 있는 최대 스테이지 보정 또는 빔 이동에는 한계가 있습니다. 이 제한은 이미지 업데이트 속도, 시야 크기 및 드리프트 속도의 함수입니다. 주어진 시야와 이미지 업데이트 속도에 대해 보정할 수 있는 최대 드리프트 속도가 있으며 물리적 움직임을 따라갈 수 없으면 프로세스가 종료되거나 불안정해질 수 있습니다. 드리프트 수정(Drift Correct )과 같은 특징이 적용될 때 생성된 정합 템플릿으로부터, 추가로 계산된 메타데이터가 생성될 수 있다. 예를 들어, 상관 관계 일치 는 계열의 템플릿 간 변경 정도에 대한 수치 기록이며 샘플이 변경된 실험 타임라인의 지점을 식별하는 데 사용됩니다. 높은 일치 상관 관계 값은 형태가 변경된 샘플에 해당하고, 낮은 일치 상관 값은 구조가 비교적 정적으로 유지되는 샘플에 해당합니다. 일치 상관관계는 그래픽으로 표시할 수 있어 사용자가 중요한 샘플 변화에 해당하는 시리즈의 이미지를 빠르게 찾아낼 수 있으므로 현장 연구에 특히 유용합니다. 그러나 드리프트 보정 기능이 활성 상태로 유지되는 동안 이러한 작업이 수행되는 경우 높은 일치 상관 관계 값이 스테이지 이동 또는 배율 변경과 같은 이미징 조건의 변화에도 해당할 수 있음을 이해하는 것이 중요합니다.
여기에 제시된 보정 워크플로는 고유한 보정 홀더와 반자동 보정 루틴을 활용하여 작업자의 개입을 최소화하면서 다양한 렌즈 조건에서 빔을 정확하게 보정합니다. 선량 교정 루틴은 TEM에 설치된 MVS 소프트웨어를 통해 액세스할 수 있습니다. MVS 소프트웨어는 관련 현미경 설정을 자동으로 읽어 모든 측정값을 저장하여 이후 실험에 사용할 수 있도록 합니다. 일부 TEM에서는 조리개 또는 모노크로메이터 설정을 읽을 수 없으며, 교정 및 사용 중에 작업자가 MVS 소프트웨어 설정에 입력해야 합니다. 프로그램 프롬프트에 따라 이러한 운영자 입력 설정을 최신 상태로 유지하는 데 도움이 되는 미리 알림이 소프트웨어에 내장되어 있습니다. 현미경 컬럼의 다른 곳에 통합된 홀더에 의존하지 않고 집전체가 내장된 홀더를 개발하는 것은 신중한 설계 선택입니다. 이를 통해 집전체를 샘플과 동일한 평면에 배치할 수 있으므로 빔 편향으로 인한 전류 측정 오류 또는 서로 다른 빔 위치의 구멍에 의한 전자 흡수 차이를 제거할 수 있습니다. MVS 소프트웨어는 자동화된 루틴을 따라 렌즈 조건의 모든 조합에 대한 빔 전류 및 면적을 측정합니다. 그런 다음 소프트웨어는 이러한 측정된 보정을 카메라 또는 스크린 전류와 연관시키고 실험 중에 배율 등의 변화를 빔 영역으로 외삽할 수 있습니다. 이러한 보정 파일은 일단 생성되면 즉시 사용할 수 있으며 소프트웨어가 향후 세션에서 사용되는 동일한 설정을 감지하면 나중에 사용할 수 있도록 자동으로 저장됩니다. 보정 파일의 수명은 현미경마다 다르지만 저자는 현재 값에 대한 실질적인 변화를 관찰하지 않고도 몇 달 동안 동일한 보정 파일을 사용할 수 있다는 것을 발견했습니다. 특히 저온 FEG 방출 건에서 이러한 보정을 관련성 있게 유지하는 데 도움이 되는 총의 방출 프로파일을 모니터링하는 루틴이 내장되어 있습니다.
현미경 간 선량 측정의 정규화와 시료의 빔 노출에 대한 자동 추적은 서로 다른 현미경 시스템에서 수행 할 수있는 실험 간의 선량 조건을 정량적으로 비교할 수 있기 때문에 MVS 소프트웨어의 중요한 기능입니다. 다른 현미경을 사용하여 동일한 실험 중에 얻은 제올라이트 샘플(ZSM-5)의 선량 유도 분해는 최대 누적 또는 역치 전자 선량(~60.000 e-/Å 2 ~500 e-/Å2·s) 두 설정 모두에 대해. 이러한 비교 결과는 선량 소프트웨어가 재현 가능한 정량적 선량 측정을 용이하게 한다는 것을 보여줍니다. 각 실험에서 전체 FFT 스폿 소실이 관찰되는 누적 선량의 작은 차이는 두 현미경이 사용하는 가속 전압이 다르기 때문일 수 있으며, 가속 전압이 낮을수록 방사선 손상 경로가 더 커지고, 가속 전압이 높을수록 일반적으로 더 많은 연쇄 손상이 발생합니다 24. ZSM-5 나노입자의 임계 선량에 대한 문헌 결과는 모든 FFT 스폿의 완전한 소실이 아니라 첫 번째 FFT 스폿 소실을 사용하여 9,000-14,000 e-/Å2 범위입니다(25,26). 우리의 결과에서, 첫 번째 FFT 반점 소실은 약 25,000 e-/Å2의 누적 선량에 해당합니다. 이전 연구에서는 형광체 스크린을 사용하여 얻은 전류 측정에 의존했는데, 이는 패러데이 컵과 비교할 때 빔 전류 측정을 과소평가하는 것으로 잘 문서화되어 있습니다15. 결정된 임계 선량은 선량을 추적하기 위해 사용되는 FFT 피크에 따라 2배 이상 변할 수 있습니다. 이는 더 높은 공간 주파수가 먼저 저하되고 측정 중에 사용된 영역 액세스에 따라 다른 값이 발생할 수 있음을 나타냅니다(우리의 결과는 특정 구조적 특징보다는 전체 제올라이트 결정의 FFT 지점에 초점을 맞췄습니다)25,26. 이러한 기술과 현재 교정의 차이는 결과와 이전 문헌 연구에서 보고된 두 실험 간의 값 차이를 설명합니다.
전자 선량 상호 작용은 많은 TEM 실험에서 중요한 요소이지만, 현장 및 특히 액체 -EM 연구는 그 효과에 특히 민감합니다. 전자빔에 의한 액체의 방사선 분해는 샘플과 상호 작용할 수 있는 화학적 반응성 종의 캐스케이드를 생성하여 분석을 복잡하게 만듭니다. 액체 EM 실험 중에 사용되는 선량률 또는 플루언스와 누적 선량은 모두 액체 방사선 분해로 인해 생성된 라디칼 종의 농도에 영향을 미칠 수 있습니다27,28. 따라서 실험 전반에 걸쳐 누적 선량 및 선량률 메타데이터를 모두 수집하고 기록하면 이미지와 샘플의 선량 이력 간의 직접적인 상관 관계를 파악할 수 있으며 이러한 실험에서 전자빔의 영향을 설명하고 제어하는 보다 정확한 방법입니다. 이 프로토콜에서는 다루지 않지만 liquid-EM에 대한 용량 관리 기능의 유용성에 대한 예는 그림 6에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig06.jpg"> 그림 6: in situ liquid-EM 실험 중 금 나노입자의 빔 유도 성장. (A) 지역 전체에 걸친 누적 선량 맵의 색상 오버레이를 사용한 결과 입자 성장의 저배율 STEM 개요. 오버레이의 빨간색 영역은 누적 선량 노출이 높은 영역을 나타내고 노란색 영역은 노출이 낮은 영역을 나타냅니다. 커서로 개별 픽셀을 강조 표시하거나 포함된 그리기 도구를 사용하여 영역 위에 상자를 그리면 해당 픽셀 또는 영역에 대한 누적 선량이 표시됩니다. 스케일 바는 2μm입니다. (B,C) A에서 주황색 상자(b,c)로 표시된 영역의 고배율 STEM 이미지. 더 높은 누적 선량(10.811 e-/Å 2)에 노출된 영역 b는 더 낮은 누적 선량(0.032 e-/Å2)에 노출된 영역 c에서 발견된 것보다 더 큰 입자를 포함합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
풍부한 선량률 및 누적 선량 메타데이터는 선량 의존적 나노물질 성장 및 분해 경로의 분석을 단순화합니다. 그림 6은 액체-EM 실험 중 물에서 금 금륨(HAuCl3) 이온 용액의 빔 유도 환원을 보여줍니다. 도 6A의 컬러 선량 맵 오버레이로부터, 누적 전자 선량이 나노 입자(29,30,31,32)의 결과 크기 및 형상에 영향을 미친다는 것을 쉽게 시각화 할 수있다. 저배율 STEM 개요는 높은(빨간색) 및 낮은(노란색) 누적 선량에 노출된 영역을 보여줍니다. 더 높은 선량에 노출된 영역의 입자는 더 낮은 누적 선량에 노출된 영역의 입자보다 큽니다. 선량 메타데이터가 픽셀 수준에서 각 이미지에 직접 포함되기 때문에 액체-EM 실험에서 전자 선량의 복잡한 효과를 이전에는 달성할 수 없었던 방식으로 체계적으로 분석할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 우리는 MVS 소프트웨어가 픽셀 단위로 샘플에 전달되는 전자 선량과 총 선량을 모두 보정, 모니터링 및 추적하기 위한 포괄적인 솔루션을 제공한다는 것을 입증했습니다. 이 기능은 선량에 민감한 샘플을 이미징하고 전자빔 상호 작용을 이해하기 위한 새로운 패러다임을 열어줍니다. 액체 EM 실험에서는 전자 선량이 수행하는 역할에 대한 보다 효과적인 조사를 가능하게 하고 실험 재현성을 향상시킬 수 있기 때문에 특히 흥미진진합니다. 이 새로운 프레임워크를 통해 선량률 및 축적된 선량 정보를 정확하게 수집하고, TEM 결과에 대한 보다 정확한 해석을 위해 이 데이터를 커뮤니티와 쉽게 공유할 수 있으며, FAIR 주요 보고 및 분석을 가능하게 하여 과학적 협력 및 데이터 공유를 발전시킬 수 있기를 바랍니다.

투과 전자 현미경(TEM)과 그 기능은 카메라, 검출기, 샘플 홀더 및 컴퓨팅 기술의 발전으로 엄청난 이점을 얻었습니다. 그러나 이러한 발전은 단절된 데이터 스트림, 인간 작업의 한계 및 번거로운 데이터 분석으로 인해 방해를 받고 있습니다 1,2. 또한, 현장 및 작동 실험은 TEM을 실시간 나노 스케일 실험실에 적용하여 가스 또는 액체 환경에서 샘플을 연구하는 동시에 다양한 외부 자극을 적용 할 수 있습니다 3,4,5. 이러한 복잡한 워크플로의 채택은 이러한 한계를 확대할 뿐이며, 결과적으로 이러한 데이터 스트림의 크기와 복잡성이 증가함에 따라 우려가 커지고 있습니다. 따라서 데이터를 찾고, 액세스하고, 상호 운용하고, 재사용하기 위해 기계 실행 가능성을 활용하는 것이 점점 더 강조되고 있으며, 이는 FAIR 원칙6으로 알려져 있습니다. FAIR 원칙 개념에 따라 연구 데이터를 게시하는 것은 전 세계 정부 기관으로부터 호의적인 관심을 받았으며7,8, 머신 비전 소프트웨어를 사용하여 FAIR 원칙을 적용하는 것이 채택의 핵심 단계입니다.
머신 비전 동기화(MVS) 소프트웨어 플랫폼은 복잡하고 메타데이터가 많은 TEM 실험(특히 현장 및 운영 실험)을 수행하고 분석하는 데 내재된 특정 문제점에 대응하여 개발되었습니다9. MVS 소프트웨어는 TEM에 설치되면 현미경 컬럼, 검출기 및 통합 현장 시스템을 연결, 통합 및 통신합니다. 이를 통해 지속적으로 이미지를 수집하고 해당 이미지를 실험 메타데이터와 정렬하여 처음부터 끝까지 실험의 타임라인인 포괄적인 검색 가능한 데이터베이스를 형성할 수 있습니다(그림 1). 이러한 연결성을 통해 MVS 소프트웨어는 샘플이 형태학적 변화를 겪고 있는 경우에도 관심 영역(ROI)을 지능적으로 추적하고 안정화하는 알고리즘을 적용할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 드리프트 컨트롤 및 포커스 어시스트 기능을 통해 ROI를 안정화하기 위해 필요에 따라 스테이지, 빔 및 디지털 보정에 조정을 적용합니다. 이 소프트웨어는 다양한 실험 시스템에서 생성된 원시 메타데이터로 이미지를 풍부하게 할 뿐만 아니라 이미지 분석 알고리즘을 사용하여 이미지 간의 변수를 계산하여 샘플 드리프트 또는 초점 변화를 자동으로 보정할 수 있는 새로운 계산 메타데이터를 생성할 수 있습니다.
MVS 소프트웨어를 통해 수집된 TEM 이미지 및 관련 메타데이터는 분석 소프트웨어인 Studio(이하 분석 소프트웨어라고 함)10의 무료 오프라인 버전을 통해 누구나 열고 볼 수 있는 실험 타임라인으로 구성됩니다. 실험 중에 MVS 소프트웨어는 현미경의 카메라 또는 검출기에서 세 가지 유형의 이미지를 동기화하고 기록하며, 이는 이미지 뷰어 아래의 타임라인 상단에 표시됩니다: 단일 획득(TEM 소프트웨어에서 직접 획득한 개별 단일 획득 이미지), 원시(디지털 드리프트 보정이 적용되지 않은 검출기/카메라 라이브 스트림의 이미지, 이러한 이미지는 다음을 통해 물리적으로 보정되었을 수 있습니다. 스테이지 이동 또는 빔 이동) 및 드리프트 수정(디지털 드리프트된 감지기/카메라 라이브 스트림의 이미지). 실험 또는 세션 중에 수집된 데이터는 포함된 메타데이터의 손실 없이 컬렉션이라고 하는 더 작은 섹션 또는 데이터 조각으로 더 구체화할 수 있습니다. 분석 소프트웨어에서 이미지, 이미지 스택 및 메타데이터를 다양한 개방형 이미지 및 스프레드시트 유형으로 직접 내보내 다른 도구 및 프로그램을 사용하여 분석할 수 있습니다.
MVS 소프트웨어가 지원하는 현미경 제어, 안정화 및 메타데이터 통합 프레임워크를 통해 현재 TEM 워크플로의 한계를 완화하도록 설계된 추가 머신 비전 프로그램 또는 모듈을 구현할 수도 있습니다. 이 동기화 플랫폼을 활용하기 위해 개발된 첫 번째 모듈 중 하나는 전자 선량 보정 및 샘플 내 빔 노출 영역의 공간 추적입니다. 모든 TEM 이미지는 샘플과 전자빔 사이의 상호 작용으로 형성됩니다. 그러나, 이러한 상호작용은 또한 방사선 분해 및 연쇄 손상(knock-on damage)과 같은 샘플에 대한 부정적이고 피할 수 없는 영향을 초래할 수 있으며, 이미지를 생성하기 위해 충분히 높은 전자 선량을 적용하는 것과 결과적인 빔 손상(13, 14)을 최소화하는 것 사이의 신중한 균형을 필요로 한다.
많은 사용자들이 전자 선량을 추정하기 위해 스크린 전류 측정에 의존하지만, 이 방법은 실제 빔 전류(15)를 광범위하게 과소평가하는 것으로 나타났다. 정성적 선량 값은 동일한 설정으로 동일한 현미경의 스크린 전류를 통해 얻을 수 있지만 다른 현미경 또는 설정을 사용하여 이러한 선량 조건을 재현하는 것은 매우 주관적입니다. 또한 실험 중에 사용자가 수행한 이미징 매개변수 조정(예: 스폿 크기, 조리개, 배율 또는 강도)은 결과 선량을 계산하기 위해 스크린 전류를 별도로 측정해야 합니다. 사용자는 주어진 실험 동안에 사용된 이미징 조건을 엄격하게 제한하거나, 사용된 각각의 렌즈 조건을 세심하게 측정하고 기록하여, 현미경의 정상 작동을 위해 실현 가능한 것 이상으로 실험을 상당히 복잡하게 하고 연장시켜야 한다(16, 17).
이 프로토콜의 선량 소프트웨어라고 하는 선량은 자동 전류 측정이 가능하도록 설계된 전용 교정 홀더를 활용하는 선량 교정 소프트웨어 모듈입니다. 정확한 빔 전류 교정을 위한 황금 표준인 패러데이 컵(15)은 교정 홀더의 팁에 통합되어 있습니다. MVS 소프트웨어는 각 렌즈 조건에 대해 일련의 빔 전류 및 빔 영역 보정을 수행하고 해당 값을 픽셀 수준의 이미지에 포함합니다.
이 비디오 기사에서는 대표적인 나노 물질 샘플을 사용하여 TEM 워크플로우의 모든 영역을 향상시키도록 설계된 MVS 소프트웨어 프로토콜을 제시합니다. 빔 민감성 제올라이트 나노입자 샘플(14)은 보정 및 투여량 관리 워크플로우를 시연하기 위해 사용된다. 우리는 가열 될 때 상당한 형태 학적 변화를 겪는 Au /FeOx 나노 촉매18,19 샘플을 사용하여 대표적인 현장 가열 실험을 수행합니다. 이 현장 실험은 소프트웨어의 안정화 알고리즘과 여러 메타데이터 스트림을 대조하는 기능을 강조하며, 이는 현장 및 운영 연구에 내재된 과제입니다. 프로토콜에 설명되어 있지는 않지만 고유한 전자 선량 감도로 인해 액체-EM 연구(이전에 문헌20,21,22에 보고된 프로토콜)에 대한 소프트웨어 유용성의 대표적인 예와 이러한 기술을 적용하여 액체-EM 실험에 대한 선량의 효과에 대한 이해를 향상시키는 방법에 대해 논의합니다. 마지막으로 오프라인 분석 소프트웨어를 사용하여 다양한 이미지, 비디오 및 데이터 파일을 시각화, 필터링 및 액세스 가능한 다른 형식으로 내보내는 데이터 분석을 간소화하는 방법을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig01.jpg"> 그림 1: MVS 및 분석 소프트웨어의 사용자 인터페이스 예. (A) 동기화 소프트웨어 이미지 보기 창 및 제어판. TEM과 동기화 소프트웨어 간의 연결은 현미경의 이미지와 메타데이터를 동기화 소프트웨어로 스트리밍하는 연결 버튼을 활성화하여 설정됩니다. 이미지 뷰어에서 작업자는 드리프트 보정 및 초점 지원과 같은 다양한 머신 비전 지원 작업을 수행할 수 있습니다. 또한 데이터 수집을 방해하지 않고 Tag Images 및 Review Session을 적용할 수 있는 기능을 제공합니다. (B) 이미지 뷰 포트, 타임라인, 메타데이터 및 분석 패널의 위치를 강조 표시하는 이미지 분석 소프트웨어의 스크린샷. 분석 소프트웨어는 실험 중 어느 시점에서나 액세스할 수 있으며, 세션 검토 버튼을 사용하여 해당 시점까지 획득한 이미지를 검토할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>ARM200F CFEG</td><td>JEOL</td><td></td><td>투과 전자 현미경(200kV)</td></tr><tr><td>AXON DOSE 교정 홀더</td><td>Protochips, Inc.</td>ThermoFisher ScientificTEM AXON DOSE 소프트웨어용 <td>AXA-FC-TFS</td><td>선량 교정 및 관리 하드웨어 패키지</td></tr><tr><td>:&nbsp; 버전 10.6.5.3</td><td>Protochips, Inc.</td><td>AX-MOD-DOSE-01-1YR</td><td>용량 교정 및 관리 소프트웨어</td></tr><tr><td>AXON Studio 소프트웨어: 버전 10.6.5.3</td><td>Protochips, Inc.</td><td>부품 번호 없음. </td><td>AXON 데이터 세트에 대한 오프라인 분석 소프트웨어&nbsp; success.protochips.com 에서 다운로드할 수 있습니다.&nbsp; AXON Studio 소프트웨어의 무료 사본은 다음에서 다운로드 할 수 있습니다. success.protochips.com</td></tr><tr><td>AXON Synchronicity Core</td><td>Protochips, Inc.</td><td>AXON-CORE</td><td>동기화 소프트웨어의 하드웨어 구성 요소입니다.</td></tr><tr><td>AXON 동시성 소프트웨어:&nbsp; 버전 10.6.5.3</td><td>Protochips, Inc.</td><td>AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR</td><td>동기화 소프트웨어</td></tr><tr><td>Fusion 현장 가열 E-chip</td><td>Protochips, Inc.</td><td>E-FHDC-VO-10</td><td>샘플 지원 탄소 필름이 있는 E-칩.&nbsp; 현장 난방 시스템</td></tr><tr><td>Fusion Select 현장 난방 시스템</td><td>Protochips, Inc.</td>와 함께 사용<td>FFAD-6200-EXP</td><td>ThermoFisher Scientific TEM용 현장 MEMS 가열 시스템.</td></tr><tr><td>금 (III) 염화물 (50 % 금 기준) 수화물 50790</td><td>Sigma Aldrich</td><td>27988-77-8</td><td>Au / FeOx 나노 촉매를 제조하는 데 사용됩니다. 공침전 합성 절차는 C. Sze et al. Materials Letters에서 따랐습니다. 36 (1&ndash; 4), 11&ndash; 16 (1998)</td></tr><tr><td>Iron (III) Oxide 310050 (Fe2O3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1309-37-1</td><td>Au/FeOx 나노 촉매를 제조하는 데 사용됩니다. 공침전 합성 절차는 C. Sze et al. Materials Letters에서 따랐습니다. 36 (1&ndash; 4), 11&ndash; 16 (1998)</td></tr><tr><td>Titan ChemiSTEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Transmission Electron Microscope (300 kV)</td></tr><tr><td>제올라이트 ZSM-5</td><td>Zeolyst</td><td>CBV 8014</td><td>&nbsp; 나노 촉매 샘플:&nbsp; 80 SiO2/Al2O3 몰 비율</td></tr></tbody></table>

투과 전자 현미경 워크플로우, 결과 분석 및 데이터 관리에 대한 머신 비전 접근 방식

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

투과 전자 현미경(TEM)을 통해 사용자는 기본적인 원자 규모로 재료를 연구할 수 있습니다. 복잡한 실험은 시간이 많이 걸리고 복잡한 분석이 필요한 수많은 매개변수가 있는 수천 개의 이미지를 일상적으로 생성합니다. AXON synchronicity는 TEM 연구에 내재된 문제점을 해결하기 위해 설계된 머신 비전 동기화(MVS) 소프트웨어 솔루션입니다. 현미경에 설치되면 실험 중에 현미경, 검출기 및 현장 시스템에서 생성된 이미지와 메타데이터를 지속적으로 동기화할 수 있습니다. 이러한 연결성을 통해 공간, 빔 및 디지털 보정의 조합을 적용하여 시야 내에서 관심 영역을 중앙 및 추적하고 즉각적인 이미지 안정화를 제공하는 머신 비전 알고리즘을 적용할 수 있습니다. 이러한 안정화에 의해 제공되는 해상도의 실질적인 향상에 더하여, 메타데이터 동기화는 이미지들 사이의 변수들을 계산하는 계산 및 이미지 분석 알고리즘의 적용을 가능하게 한다. 이 계산된 메타데이터는 추세를 분석하거나 데이터 세트 내에서 주요 관심 영역을 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이는 향후 새로운 통찰력과 보다 정교한 머신 비전 기능의 개발로 이어질 수 있습니다. 이 계산된 메타데이터를 기반으로 하는 모듈 중 하나는 선량 보정 및 관리입니다. 선량 모듈은 픽셀 단위로 샘플의 특정 영역에 전달되는 전자 플루언스(e-/Å 2·s-1) 및 누적 선량(e-/Å2)에 대한 최첨단 교정, 추적 및 관리를 제공합니다. 이를 통해 전자빔과 시료 사이의 상호 작용에 대한 포괄적인 개요를 볼 수 있습니다. 실험 분석은 이미지와 해당 메타데이터로 구성된 데이터 세트를 쉽게 시각화, 정렬, 필터링 및 내보낼 수 있는 전용 분석 소프트웨어를 통해 간소화됩니다. 이러한 도구를 결합하면 효율적인 협업 및 실험 분석이 용이하고 데이터 마이닝을 장려하며 현미경 경험을 향상시킬 수 있습니다.

이 연구는 TEM 이미징 및 현장 실험을 위해 MVS 소프트웨어를 사용한 데이터 수집의 유용성을 강조합니다. 현미경 정렬 및 조건 설정은 TEM 제조업체의 기본 컨트롤을 통해 수행되고 선택되었습니다. 초기 설정 후 이 비디오 문서에 제시된 프로토콜은 MVS 소프트웨어를 통해 수행되었습니다. 300 kV TEM을 200 kV 콜드 FEG를 사용하여 획득시킨 비교 제올라이트 데이터를 제외하고는, 비디오 프로토콜 및 대표 데이터에 제시된 모든 실험에 사용하였다(도 3D-F 및 표 1). 모든 메타데이터는 MVS 소프트웨어에 의해 자동으로 수집되고 해당 이미지에 정렬되었습니다.
소프트웨어를 실행하고 메뉴에서 적절한 워크플로우를 선택한 후 그림 1A와 같이 이미지 뷰어의 맨 왼쪽에 있는 도구 모음에서 연결 버튼을 활성화하여 현미경에 연결합니다. 연결 버튼을 강조 표시하면 현미경의 이미지 및 관련 메타데이터가 자동으로 MVS 소프트웨어로 스트리밍되어 이미지 보기 창에 나타납니다. 이러한 이미지 및 관련 메타데이터는 타임라인에 새 데이터를 기록하는 것을 방해하지 않고 열고, 검토하고, 분석할 수 있는 타임라인에 시간순으로 저장됩니다(그림 1B). 스트리밍은 사용자가 연결 아이콘을 비활성화하여 언제든지 중단할 수 있습니다.
연결이 활성화되면 MVS 소프트웨어 프레임워크에 종속된 다른 워크플로우에 액세스할 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에 표시된 예에서ampMVS 소프트웨어의 다른 기능을 사용하기 전에 선량 보정을 수행해야 합니다. 선량 교정은 MVS 소프트웨어에 의해 제어되는 자동화된 프로세스입니다. 전용 패러데이 컵 선량 교정 홀더를 사용하여 매개변수 조합에 대한 빔의 전류와 면적을 측정합니다. 그림 2에 표시된 패러데이 컵 교정 홀더는 빔 전류를 정밀하게 측정하는 외부 피코 전류계에 연결됩니다. 현미경에 삽입되면 기준 정렬 구멍이 중앙에 배치되고 보정할 원하는 빔 조건(스폿 크기, 조리개 및 배율)이 소프트웨어에 입력됩니다. 소프트웨어는 선택한 조건의 각 조합에 대해 일련의 보정 단계를 수행합니다. 선량 교정 중에 홀더는 통합 패러데이 집전체 컵과 관통 구멍 사이를 자동으로 이동합니다. 렌즈 조건의 각 조합에 대한 전류 측정은 피코 전류계에 의해 패러데이 컵에서 측정됩니다. 그런 다음 소프트웨어는 스테이지를 변환하여 스루홀의 빔 중앙에 배치하고 빔 영역은 머신 비전 알고리즘을 통해 결정됩니다. 이 일련의 측정은 강도/밝기와 빔 영역 간의 관계에 대한 프로필을 작성합니다. 이를 통해 소프트웨어는 시야에 관계없이 실험 중에 강도/밝기 설정이 조정될 때 빔 영역을 추정할 수 있습니다. 누적 선량 및 선량률에 대한 값은 이러한 빔 전류 및 빔 면적 측정을 사용하여 계산되고 선량 보정 파일이 생성됩니다. 이 프로세스는 본질적으로 TEM 및 개별 렌즈 조건에 대한 선량 "지문"을 정의합니다. 일단 선량이 TEM에 대해 보정되면, 사용자는 선량 정보의 손실이나 수동 메모 작성 없이 정상적으로 작동하고 배율과 강도를 자유롭게 조정할 수 있다(17). 교정이 완료되면 용량 교정 홀더가 제거되어 s가 허용됩니다.amp정상적으로 삽입할 수 있습니다. TEM 및 STEM 모드에 대한 보정 프로세스는 일반적으로 10분 미만이 소요됩니다.
선량 조건을 보정한 후, 상업적으로 구입한 제올라이트 나노입자(ZSM-5) 샘플을 고선량률 조건에서 이미지화하여 샘플이 너무 손상되어 구조 정보를 제공할 수 없는 역치(누적) 선량을 결정했습니다. ZSM-5 나노 입자를 에탄올에 현탁시키고 종래의 구리 TEM 그리드 상에 드롭캐스트하였다. 이들은 3의 스폿 크기와 100μm 콘덴서 조리개를 사용하여 TEM 모드에서 300kV에서 연속적으로 이미지화되었습니다. 높은 선량률 조건에서 MVS 소프트웨어가 판독한 선량률은 519e-/Å2·s였습니다. 시야의 나노 입자는 FFT의 피크가 사라질 때까지 연속적으로 이미지화되었으며, 이는 그림 3A-C 및 보충 파일 3에 표시된 바와 같이 결정 구조의 분해를 나타냅니다. 오버레이(실시간 실험 중 또는 분석 소프트웨어에서 나중에 추가할 수 있음)를 TEM 이미지에 적용하여 날짜와 시간, 선량률, 최대(누적) 선량 및 배율을 표시했습니다. 투여량 비율은 실험 동안 일정하게 유지되었고, 누적 투여량(최대 투여량)은 시간의 함수로서 증가하였다. FFT 피크는 연속 이미징 42초 후에 사라지기 시작했습니다(그림 3B). 1분 20초 및 ~60,000 e-/Å2의 누적 선량에서 FFT 피크는 완전히 사라졌습니다(그림 3C).
이 보정 방법이 다른 설정에서 작동하는 다른 현미경에 적용할 수 있는 정량적 선량 측정을 생성한다는 것을 보여주기 위해 동일한 보정 프로세스와 제올라이트 분해 실험이 200kV 저온 전계 방출 건(FEG) TEM 및 스폿 크기 1을 사용하여 수행되었습니다. 이 현미경은 방법 1에 설명된 것과 동일한 절차를 사용하여 보정되었으며 방법 2에 설명된 동일한 실험은 새로운 스폿 크기 및 조리개 설정을 사용하여 수행되었습니다. 빔 설정은 두 실험 사이에 적용된 선량률의 차이가 무시할 수 있도록 조정되었습니다(499 e-/Å 2·s 대 519 e-/Å2·s). 그림 3DF에 표시되고 표 1에 요약된 바와 같이, FFT 스폿은 1분 50초의 연속 이미징 및 58,230 e-/Å2의 누적 선량 후에 완전히 사라지며, 이는 첫 번째 실험에서 얻은 값과 일치합니다.
가열 실험을 수행하여 MVS 소프트웨어가 현장 실험에 어떻게 도움이 될 수 있는지에 대한 예가 표시되었습니다. 대표적인 나노촉매 샘플인 Au/FeOx(공개된 절차19에 따라 합성됨)는 고온에서 역동적인 형태학적 및 구조적 변화를 겪기 때문에 예시 시스템으로 선택되었습니다. 이러한 온도에 의한 이동성은 온도 변화18 동안 시료 자체의 움직임과 시료 지지대의 열팽창으로 인해 시야 내에서 ROI를 중앙에 유지하는 것을 어렵게 만듭니다. 드리프트 보정 및 초점 지원 기능을 활성화한 상태에서 샘플은 800°C에서 ~30초 동안 이미지화되었습니다. 고온에서 Au/FeOx 내의 금 나노입자는 산화철 지지체의 표면을 따라 이동하고 소결되어 그림 4와 보충 파일 7의 동영상과 같이 더 큰 입자를 형성했습니다. 그림 5는 현장 가열 실험 중에 다양한 시점(그림 5G)에서 기록된 Au/FeOx 나노촉매 내의 다공성 영역에 대한 일련의 TEM 스냅샷(그림 5A-F)을 보여줍니다. ROI의 조정된 드리프트 값은 소프트웨어에 의해 자동으로 계산되었습니다. 시리즈가 진행되는 동안 이미지의 조정된 드리프트 및 온도 값은 그림 5G에 그래픽으로 표시됩니다. 예상대로 샘플의 배위 드리프트는 온도 프로파일이 ~9nm/min에서 ~62nm/min으로 증가함에 따라 증가하고 온도가 일정하게 유지됨에 따라 평준화쪽으로 감소하기 시작합니다. 이러한 높은 드리프트 속도와 샘플 형태의 변화에도 불구하고 온도 상승 중에 고해상도 이미지를 쉽게 얻을 수 있으며 보충 파일 8에 표시된 것처럼 다공성 영역 내의 움직임을 나타냅니다. 보충 참조 File 9 다운로드 지침 및 컴퓨터 사양에 대한 설명입니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig02.jpg"> 그림 2: 전자 선량 교정 및 추적 . (A) 선량은 빔 전류 측정을 위해 샘플 평면에 위치한 집전체가있는 전용 샘플 홀더를 사용하여 보정됩니다. (B) 팁 디자인의 특징 그림: 왼쪽: 패러데이 컵; 중간: 기준점 구멍; 오른쪽: 관통 구멍(C). 적용된 전자 선량은 이미지 내에서 다양한 선량 노출을 나타내기 위해 색상으로 구분된 맵을 사용하여 소프트웨어에서 시각화할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig03.jpg"> 그림 3: 제올라이트(ZSM-5) 나노입자의 분해를 유도한 전자 선량. (A-C) 300kV FEG 및 519e-/Å2·s; 제올라이트는 1분 20초 이내에 분해됩니다. (D-E) 1분 50초 동안 촬영한 스냅샷은 200kV 저온 FEG TEM 및 499e-/Å2·s; 삽입물은 시간이 지남에 따라 FFT 스폿이 페이딩되는 것을 보여줍니다. 스케일 바는 60nm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig04.jpg"> 그림 4: AXON synchronicity는 머신 비전 알고리즘을 적용하여 동적으로 진화하는 샘플을 추적하고 안정화합니다. 실험 중에 생성된 메타데이터는 타임라인을 따라 그릴 수 있으므로 사용자는 실험 중에 생성된 이미지 시리즈를 스크롤할 때 이미지를 관련 메타데이터와 빠르게 페어링할 수 있습니다. (AH) 800°C에서 나노촉매 샘플(Au/FeOx)의 이미지는 선량 맵 오버레이가 있는 경우(A-D) 및 없는 경우(EH) 모두에서 28초 동안 기록되었습니다. 오버레이의 빨간색 영역은 누적 선량 노출이 높은 영역을 나타내고 노란색 영역은 노출이 낮은 영역을 나타냅니다. 개별 픽셀을 강조 표시하면 해당 픽셀의 누적 선량이 표시됩니다. 패널 EH의 흰색 화살표는 실험 중에 병합되는 두 입자를 나타내고 주황색 화살표는 움직이는 금 입자의 궤적을 나타냅니다. (I) A-H에 표시된 이미지 시리즈에 대해 분석 소프트웨어에 의해 생성된 실험 타임라인. 타임라인 상단의 주황색 점은 디지털로 보정되지 않은 원시 이미지를 나타내고 파란색 점은 드리프트 보정 이미지를 나타냅니다. 주황색 세로 막대는 패널 AH에 표시된 이미지에 해당하는 타임라인의 점을 나타냅니다. 스케일 바는 40nm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65446/65446fig05.jpg"> 그림 5: 다양한 시점에서 Au/FeOx 나노촉매 내 다공성 영역의 TEM 스냅샷. MVS 소프트웨어는 머신 비전 알고리즘에 의해 표시된 대로 스테이지, 빔 시프트 및 디지털 보정의 적용을 통해 온도 상승 중에 발생하는 것과 같이 높은 드리프트 속도 중에도 샘플을 안정화하고 중앙에 배치합니다. (A-F) Au/FeOx 나노촉매 내의 다공성 영역에 대한 TEM 스냅샷으로, 현장 가열 실험 중 다양한 (G) 시점에서 기록되었습니다. ROI의 드리프트 속도는 MVS 소프트웨어에 의해 실험 중에 자동으로 계산되고 기록됩니다. (G)에 표시된 바와 같이, 온도 프로파일이 변경됨에 따라(파란색 선), 드리프트 속도(주황색 선)는 온도가 증가함에 따라 증가하고 온도가 일정하게 유지됨에 따라 감소합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/65446fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>현미경 유형</td>
			<td>300 kV 페그 템</td>
			<td>200kV 콜드 FEG TEM</td>
		</tr><tr><td>스폿 크기/콘덴서 2 조리개</td>
			<td>3/100 마이크로미터</td>
			<td>1/100 마이크로미터</td>
		</tr><tr><td>복용량 비율</td>
			<td>519 e-/A2•s1</td>
			<td>499 e-/A2•s1</td>
		</tr><tr><td>FFT로 측정한 구조 손실 (누적 복용량)</td>
			<td>60,270 e-/ᅡ 2 </td>
			<td>58,230 e-/ᅡ2 </td>
		</tr></tbody></table>표 1: 다른 현미경에서 얻은 제올라이트 분해 결과의 요약 비교.
보충 파일 1: 용량 관리 탭이 열려 있는 MVS 소프트웨어 인터페이스의 스크린샷. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%201%20-%20User%20Interface.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 빔 유도 제올라이트 분해 실험의 MVS 소프트웨어 데이터베이스 파일. 이 보기/분석 소프트웨어는 무료로 다운로드할 수 있습니다. 보충 파일을 참조하십시오 file 9 다운로드 지침 및 컴퓨터 사양에 대한 설명입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental_File_2-Data_High_Dose_Zeolite_Degradation_TFS_compressed.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3: 빔 유도 제올라이트 분해의 동영상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%203%20-%20Zeolite%20Degradation%20TFS.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: CSV 파일 1(제올라이트 분해: 원시 데이터[기계적 보정만 해당]) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%204%20-%20Zeolite%20CSV%20Raw.csv" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 5: CSV 파일(제올라이트 열화: 드리프트 보정[기계적 + 디지털 보정]) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%205%20-%20Zeolite%20CSV%20Drift%20Corrected.csv" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 6: MVS 소프트웨어 데이터베이스 파일 나노촉매 제자리 가열 실험. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%206%20-%20AuFeOx%20800C%20Madeline%20Dressel%20Dukes.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 7: 용량 오버레이가 있는 800°C에서의 나노촉매 동영상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%207%20-%20AuFeOx%20Dose%20Map%20800.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 8: 배위 드리프트 값이 있는 온도 램프 동안의 나노촉매 동영상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%208%20-%20AuFeOx%20Temperature%20Ramp.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 9: 무료 분석 소프트웨어 다운로드 지침. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65446/Supplemental%20File%209%20-%20Download%20Instructions.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 머신 비전 소프트웨어를 활용하여 TEM 이미징 중에 동적 프로세스를 안정화하는 동시에 각 이미지에 대한 여러 메타데이터 스트림을 탐색 가능한 타임라인으로 인덱싱하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 플랫폼이 실험 과정에서 전자 선량의 자동 보정 및 매핑을 가능하게 하는 방법을 보여줍니다.

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

이 기술은 모든 기술 수준의 사용자가 고성능 TEM 연구에 액세스할 수 있도록 개발되었습니다. 또한 과학적 발전에는 여러 연구자의 공동 노력이 필요하므로 성공적인 연구를 위해서는 크고 복잡한 데이터 세트를 공유하고 분석하는 효율적인 플랫폼이 필수적입니다 Operando 및 현장 연구는 TEM을 실시간 나노 실험실로 변환하여 연구자가 재료의 성장 특성을 제어하는 동적 나노 스케일 프로세스를 탐색할 수 있도록 합니다. 현장 TEM 연구의 가장 큰 과제 중 하나는 샘플의 고유 거동에서 빔 조사 효과를 분리하는 것입니다.정확한 전자 선량 측정 및 추적이 필수적이지만 선량 관리 소프트웨어가 없으면 총 선량 또는 임계 선량이 아닌 전자 선량률만 측정할 수 있습니다. 복잡한 TEM 워크플로는 해당 이미지에 수동으로 정렬하고 인덱싱해야 하는 대규모 데이터 세트를 생성합니다. 시간이 많이 소요되는 이 공정에서는 이미징 조건 또는 샘플 환경 조정과 같은 주요 정보가 손실되어 분석 및 재현성이 복잡해질 수 있습니다. 우리는 실험 중에 생성된 이미지와 메타데이터를 수집하고 데이터가 풍부하고 검색 가능한 타임라인으로 인덱싱하는 머신 비전 워크플로를 개발했습니다.계산 및 이미지 분석 알고리즘은 이미지 간의 변수를 계산하고, 보정을 적용하고, 숨겨진 추세를 식별할 수 있습니다. 새로운 메타데이터를 계산, 동기화 및 각 이미지에 인덱싱함으로써 다중 모드 분석이 갑자기 새로운 가능성이 되었습니다. 예를 들어, 제올라이트 이미지에 정확하게 축적된 선량 및 선량률 정보를 통해 수천 개의 이미지에서 샘플 손상을 정량적으로 평가할 수 있습니다.우리는 결과에 접근하고 해석할 수 있도록 하고 실험 재현성을 개선함으로써 현장 TEM의 기능을 계속 추진할 것입니다. 이 소프트웨어는 역사적으로 어려웠던 특정 응용 분야를 대상으로 하는 워크플로 기반 모듈을 개발하여 현장 TEM 실험을 더 쉽고 더 풍부한 정보로 만드는 플랫폼입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

셀룰러 차원 전자 현미경을위한 병목 고도로 복잡한 3D 밀도 맵에서 피쳐 추출 (분할)된다. 우리는 따라서 효율적인 세그멘테이션 대한 시작점을 제공하고, 분할 방식 (수동, 반자동 또는 자동으로)가 상이한 데이터 유형에 가장 적합 관한 지침을 제공하는 기준의 세트를 개발했다.

복셀에서 지식 : 복잡한 전자 현미경 3D-데이터의 분할에 대한 실용 가이드

이 보고서는 두꺼운 생물학적 표본의 주사 투과 전자 단층 촬영을 수행하기 위한 샘플 준비 프로토콜과 특정 이미징 조건을 설명합니다.

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여기 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)를 사용 하 여 슬라이드에 붙일 레이블된 조직의 자동화 된 세그먼트에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생물 과학, 의료 공학, 건강 과학 등 생물 조직에서 형광 표식의 정량과 관련 된 모든 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

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극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

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200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

배우세요 머신 비전 기반 투과 전자 현미경 워크플로우와 데이터 관리 방법을. 실시간 전자선 선량 추적 및 자동화된 교정 알고리즘을 활용하여 복잡한 데이터셋 분석 효율성을 높이고 실험 재현성을 향상시킵니다.

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