Name: 광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 광견병 IgG 및 IgM 항체 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 배우세요 광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 IgG 및 IgM 항체 검출 방법입니다. 이 기법은 감염 시 항체 반응 평가와 백신 접종 후 면역 반응 분석에 활용됩니다.

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이 프로젝트를 지원해 주신 뉴욕주 보건부 워즈워스 센터(Wadsworth Center)에 감사드립니다.

다음 프로토콜은 분석 개발을 위해 뉴욕주 보건부 워즈워스 센터(Wadsworth Center for assay development)에서 인체 샘플의 윤리적 사용을 승인했으며, 프로토콜 승인 번호 #03-019입니다.
1. 안전
<ol><li>개인 보호 장비(PPE), 최소한의 눈 보호 장비(안경 또는 안면 보호대), 수술용 마스크 및 비라텍스 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>직원이 광견병 예방 접종을 받고 지난 6개월 이내에 ≥0.5IU/mL의 역가가 입증되었는지 확인합니다.</li>
</ol>2. 항원 슬라이드 준비
알림: 모든 바이러스, CSF 및 혈청 조작은 범용 예방 조치를 사용하여 생물 안전 캐비닛(BSC)에서 수행합니다.
<ol><li>10% 소 태아 혈청(EGM)이 보충된 Eagle의 최소 필수 배지에 3.0 x 105 cells/mL 농도로 마우스 신경모세포종 또는 BHK-21 세포 20mL를 준비하고 사용할 때까지 차갑게 보관합니다.</li>
	<li>EGM에서 밀리리터당 1.0 x 106.5 50% 조직 배양 감염 선량(TCID50)의 작업 희석으로 희석하여 CVS-11 바이러스를 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 차갑게 보관합니다. 참고: TCID50 은 이전에 발표된 Reed and Muench 방법에 의해 결정됩니다5.</li>
	<li>습도 슬라이드 챔버와 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 코팅된 웰 현미경 슬라이드를 70% 에탄올로 세척하고 BSC에서 자연 건조합니다.</li>
	<li>슬라이드 챔버의 흡수성 종이 스트립에 증류수(dH2O)를 추가하여 절차 내내 습도가 일정하게 유지되도록 합니다.</li>
	<li>연필을 사용하여 사용할 각 슬라이드에 로트 번호, 날짜, 셀 유형 및 보관에 필요한 기타 식별 정보와 함께 레이블을 지정하고 슬라이드 챔버에 넣습니다. 알림: 대부분의 마커, 펜 또는 라벨은 향후 아세톤 고정 단계(2.9단계)를 견디지 못합니다.</li>
	<li>반복 피펫을 사용하여 현미경 슬라이드의 각 웰에 50μL의 바이러스 희석액을 적용합니다. 그런 다음 각 웰에 50μL의 세포 희석액을 적용하고 웰에 이미 있는 바이러스로 피펫 팁을 오염시키지 않도록 주의합니다.</li>
	<li>습도 슬라이드 챔버를 닫고 34-36°C의 습한 인큐베이터에 넣습니다. 24시간 후 세포 감염성을 평가합니다. 참고: 하나의 슬라이드에서만 2.8-2.12단계를 수행합니다.</li>
	<li>습도 챔버에서 슬라이드를 제거하고 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 코플린 항아리에서 슬라이드를 2분 동안 세척한 다음 슬라이드를 자연 건조시킵니다.</li>
	<li>슬라이드를 코플린 병에 넣고 가연성 물질에 대해 승인된 -1°C 냉동고에서 최소 20시간 동안 차가운 아세톤으로 슬라이드를 고정합니다. 흄 후드에서 모든 아세톤 주입 및 공기 건조 절차를 수행하십시오.</li>
	<li>아세톤이 번쩍이고 밀어 건조시키십시오. 제조업체의 지침에 따라 준비한 광견병 직접 형광 항체(DFA) 접합체를 슬라이드의 웰에 적용하고 34-36°C의 습한 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS의 코플린 병에 슬라이드를 각각 2분 동안 두 번 씻습니다. 슬라이드를 자연 건조시킵니다.</li>
	<li>0.05 M Tris, 0.15 M NaCl (pH 9.0) 및 20 % 글리세롤 마운터로 커버 슬립을 장착하고 200 배 배율의 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 읽고 감염성을 평가합니다. 세포가 약 50% 감염되지 않은 경우 원하는 감염도에 도달할 때까지 다음 날 2.7-2.12단계를 반복합니다. 알림: 세포 감염률은 슬라이드 웰에서 음성 세포와 광견병 양성 세포의 비율을 시각적으로 평가하여 근사치입니다. 음성 세포는 빨간색으로 나타나고 양성 세포는 녹색 형광 염색을 나타냅니다.</li>
	<li>인큐베이터와 습도 챔버에서 나머지 슬라이드를 제거합니다. 각 웰에서 상층액을 조심스럽게 흡인한 다음 슬라이드를 PBS가 있는 코플린 병에 1-2분 동안 넣습니다. 슬라이드를 약 30분 동안 자연 건조시킵니다. 슬라이드를 사용할 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>3. 샘플 준비
<ol><li>테스트를 위해 환자 혈청 또는 CSF 샘플 희석액을 준비합니다. PBS에 0.05% Evans blue로 희석된 적절한 작업 농도에 필요한 접합체를 준비합니다. NOTE: 적용하기 전에 형광단 무결성을 유지하기 위해 접합체를 어두운 곳에 보관하십시오.</li>
</ol>4. IFA 절차
<ol><li>각 분석에 필요한 준비된 항원 슬라이드를 필요한 수만큼 제거하고 슬라이드를 해동하고 완전히 건조시킵니다.</li>
	<li>슬라이드를 코플린 병에 넣고 가연성 물질에 대해 승인된 -20°C 냉동고에서 2시간에서 하룻밤 동안 차가운 아세톤으로 슬라이드를 고정합니다. 아세톤에서 슬라이드를 제거하고 자연 건조시킵니다.</li>
	<li>습도를 유지하기 위해 dH2O-적신 흡수 스트립이 있는 BSC 내부의 습도 챔버 상자에 슬라이드를 놓습니다. 각 시료 희석액, 대조군 시료 또는 PBS의 50μL를 미리 결정된 웰에 적용합니다. 참고: 각 슬라이드에는 적절한 수의 환자 샘플 웰, 양성 대조군, 음성 대조군 및 PBS 세포 대조군 웰이 포함되어야 합니다.</li>
	<li>밀폐된 습도 슬라이드 챔버를 37°C, 5% CO2 습한 인큐베이터에 놓습니다. 슬라이드를 30분 동안 배양한 다음 인큐베이터에서 습도 슬라이드 챔버를 제거하고 BSC에 넣습니다.</li>
	<li>아스피레이터 팁을 사용하여 각 웰에서 상층액을 조심스럽게 흡입하여 세포 단층을 방해하지 않도록 합니다. 멸균 스포이드 피펫을 사용하여 PBS 한 방울을 각 웰에 도포합니다.</li>
	<li>조심스럽게 흡인을 반복한 다음 각 슬라이드를 PBS로 채워진 코플린 병에 넣고 총 15분 동안 두 번 씻습니다.</li>
	<li>슬라이드를 습도 챔버 상자에 다시 넣고 50μL의 적절한 항인간 항체 접합체를 각 웰에 적용합니다. 4.4단계부터 4.6단계까지 반복합니다.</li>
	<li>슬라이드를 자연 건조시키고 장착 매체가 있는 커버슬립을 장착하고 형광 현미경으로 슬라이드를 읽습니다.</li>
</ol>5. 슬라이드 분석
<ol><li>높은 항광견병 항체 역가가 확인된 양성 대조군 샘플과 비교하여 염색 패턴 및 형광 강도를 기준으로 샘플을 등급화합니다.</li>
	<li>샘플의 등급을 음성, 1+, 2+, 3+, 4+의 척도로 매기고, 음성 결과는 형광 염색이 없음을 나타내고 4+는 양성 대조군 샘플1과 유사한 염색 패턴의 밝은 녹색 사과색 형광을 나타냅니다. 참고: 녹색 사과 색상은 FITC 표지 항체에만 적용됩니다. 색상은 형광단 선택에 따라 달라집니다.</li>
	<li>샘플이 1-2+ 등급을 표시하는 희석 계수로 표시되는 끝점 값을 샘플에 할당합니다. 초기 분석에서 종말점에 도달하지 못한 경우 더 높은 희석 계수에서 샘플을 테스트합니다.</li>
</ol>

환자의 면역 반응을 평가하기 위한 광견병 항체의 신속한 조기 발견

<ol><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Techniques+in+Rabies.+Volume+1%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1.</a> World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).</li>
<li>Moore, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+rabies+serology%3A+defining+context+of+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Challenges of rabies serology: defining context of interpretation.</a> Viruses. 13 (8), 1516(2021).</li>
<li>Zajac, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+rabies+enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29+targeting+IgM+and+IgG+in+human+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera.</a> Viruses. , 40-49 (2019).</li>
<li>Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+antibodies+and+boostability+after+rabies+intradermal+pre-exposure+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Travel+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis.</a> Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+cross-reactions+with+other+viral+encephalitides+in+the+indirect+fluorescent-antibody+test+for+diagnosis+of+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).</li>
<li>Fooks, A. R., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFooks%2C+AR+%22Rabies%3A+scientific+basis+of+the+disease+and+its+management%22">Rabies: scientific basis of the disease and its management</a>. , Academic Press. (2020).</li>
<li>Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Chlamydia+pneumoniae-specific+immunoglobulin+A+%28IgA%29+antibodies+by+the+microimmunofluorescence+%28MIF%29+method%3A+comparison+of+seven+fluorescein-labeled+anti-human+IgA+conjugates+in+an+in-house+MIF+test+using+one+commercial+MIF+and+one+enzyme+immunoassay+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).</li>
<li>Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+anti-rabies+glycoprotein+antibodies%3A+current+state+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).</li>
<li>Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+aspects+of+rabies%3A+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Immunological aspects of rabies: a literature review.</a> Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).</li>
<li>Moore, S. M., Hanlon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies-specific+antibodies%3A+measuring+surrogates+of+protection+against+a+fatal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).</li>
</ol>

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IFA 검사는 항원-항체 복합체를 이용하여 표지 부위에서 광견병 특이적 항체를 시각화할 수 있습니다. 신경모세포종 또는 BHK 세포를 멀티웰 PTFE 코팅 현미경 슬라이드에 파종하고 광견병 바이러스 실험실 균주 CVS-11을 접종합니다. 단층이 합류하고 세포가 약 50%의 원하는 감염도에 도달하면 슬라이드를 사용할 준비가 될 때까지 보관합니다6.
환자 혈청 또는 CSF를 감염된 세포 단층에 적용하고 광견병 특이적 항체가 바이러스 항원에 부착할 수 있도록 배양한다7. 세척 절차에 따라 형광 표지된 항인간 IgG 또는 IgM 항체를 적용하고 샘플 애플리케이션의 바이러스 결합 항체에 결합합니다. 표지된 항체는 형광 현미경으로 시각화할 수 있습니다.
이 분석을 수행할 준비를 할 때 환자 샘플, 대조군 및 접합체의 최상의 준비를 결정하는 것이 중요합니다. 초기 환자 샘플은 항체 존재 여부를 테스트하기 위해 낮은 희석 인자 또는 희석되지 않은 상태로 스크리닝되었습니다. 그런 다음 높은 수준의 항체를 입증한 쌍을 이루는 샘플 또는 이전에 스크리닝된 샘플을 종점까지 더 희석했습니다. IgG 검사를 위한 초기 환자 샘플 희석액은 시판되는 IFA 희석제에서 준비되었습니다. IgM 테스트 샘플은 처음에 시판되는 IgG 차단 시약으로 준비되었습니다. 그런 다음 두 테스트에 대한 후속 연속 희석액을 PBS에서 준비했습니다.
테스트에 사용된 대조군은 광견병 PrEP의 알려진 수혜자 또는 광견병 예방 접종 이력이 없는 개인으로부터 얻었습니다. 모든 대조군 샘플은 사용 전에 항체 존재 여부를 테스트했습니다. IgG 대조군은 FAVN에 의해 확인된 광견병 중화 항체 역가가 확립된 광견병 백신 접종자로부터 획득했습니다. IgM 양성 대조군 샘플은 백신 접종 완료 후 약 2주 후에 광견병 백신 접종자로부터 획득했습니다.
적절한 접합체의 사용은 IFA 시험 수행의 또 다른 중요한 측면입니다. 각 검사에 사용되는 접합체는 해당 분석에 대한 항체 동형 표적에 따라 다릅니다. 이 경우, 상업적으로 이용 가능한 FITC 표지된 항-인간 IgG 및 항-인간 IgM 항체를 이용하였다. 작동 항체 접합체 희석액은 제조업체의 권장 사항에 따라 테스트 전에 결정되었습니다.
IFA 테스트의 성공적인 실행을 보장하기 위한 절차에는 몇 가지 주요 단계가 있으며, 아마도 가장 중요한 것은 항원 슬라이드 준비일 것입니다. 약 50%의 감염률에 도달하면 사용 가능한 항체에 대한 풍부한 결합 부위를 제공하는 동시에 검체를 판독하고 등급을 매길 때 명확성을 제공합니다. 광견병 음성 세포는 표지된 항체를 더 잘 시각화하기 위해 대조적인 배경을 만듭니다. 비특이적 염색은 혈청과 같은 복잡한 시료 매트릭스를 사용하여 형광 염색을 수행할 때도 문제가 될 수 있습니다. IgG 불활성화 시약(예: Gullsorb)을 사용하면 IgM8의 존재를 평가할 때 IgG 항체 간섭으로 인한 비특이적 염색을 줄이는 데 도움이 됩니다. 재료를 적절하게 준비하고 특수 시약을 절차에 통합하면 고품질 결과를 유지하면서 문제가 있는 염색을 줄이는 데 도움이 됩니다.
광견병 항체 검출, 정량화 및 식별에 중점을 둔 다양한 검사 방법이 개발되었습니다. 이러한 각 테스트는 원하는 정보에 따라 다양한 방식으로 사용할 수 있는 결과를 제공합니다. 광견병 IFA 검사는 바이러스 특이적 항체 동형을 식별하기 위한 강력한 도구이며, RFFIT 및 FAVN 검사와 같은 다른 검사 방법에 비해 비교적 짧은 시간 내에 결과를 준비할 수 있습니다.
IFA 검사는 샘플에서 광견병 항체를 검출할 수 있지만, 항체의 표준화된 정량화를 제공하지는 않습니다. IFA 검사는 항체 검출이 끝나는 혈청 희석 인자를 제공합니다. 이에 비해 RFFIT 및 FAVN 검사는 샘플에서 항체의 중화 능력을 정량화하여 국제 단위(IU)의 역가를 생성하여 보다 상세하고 표준화된 결과를 제공합니다. FAVN 또는 RFFIT 검사 결과는 IgG 항체로 확인된 중화항체의 존재를 입증한다9. 중화 활성에서 IgM의 역할은 그 구조(10)로 인해 제한되는 것으로 이해된다. 따라서 이러한 검사는 IgM의 존재를 특이적으로 검출하지 않습니다.
테스트 유형과 결과는 특정 문제에 적용할 때 다소 문제가 될 수 있습니다. 광견병 바이러스 감염에 대한 항체 보호 수준의 개념은 더 이상 광견병 예방 접종에 대한 면역 반응을 평가하는 데 사용되지 않습니다. 이전에는 보호 반응이 ≥0.5IU로 정의되었습니다. 그러나 현재 간행물에서는 일반적으로 면역 접종 후 항체 반응을 허용 가능(≥0.5IU) 또는 허용 불가(<0.5IU)로 언급합니다. 앞서 언급한 바와 같이, IFA 검사는 IU에서 항체 역가를 제공하지 않으며 광견병에 대한 보호 수준을 도출하는 데 사용되어서는 안 됩니다. 광견병에 걸린 환자를 평가할 때 IFA 검사를 사용하는 것은 질병 전반에 걸친 면역 반응의 변화로 인해 항상 양성 항체 존재로 이어지지 않을 수 있습니다. 광견병 감염의 치사율은 거의 100%에 가깝기 때문에, 광견병 검사와 이 결과로부터 얼마나 많은 정보를 안전하게 도출할 수 있는지를 고려하는 것이 중요하다11. 이러한 이유로, 모든 광견병 항체 검사 방법을 평가하고 주어진 시나리오에서 가장 효과적인 방법을 결정하는 것이 항상 가장 좋습니다.

광견병 간접 형광 항체(IFA) 검사는 혈청 또는 뇌척수액에서 다양한 광견병 특이적 항체 동형을 검출하는 데 사용됩니다. 그것은 부검 전 광견병 환자를 모니터링하는 데 사용할 수 있는 다양한 검사 중 하나입니다. 광견병 감염에 대한 환자의 면역 반응을 평가하기 위해 항체를 조기에 발견하는 데 특히 유용합니다. 다른 검사, 증례 기록 및 환자의 백신 접종 상태와 함께 사용할 경우, IFA 검사는 광견병 바이러스 또는 백신에 대한 노출을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다1. IFA 검사는 IgM 및/또는 IgG를 측정하기 때문에 특정 항체의 값은 항원1에 노출된 시점의 대략적인 기간을 나타낼 수 있습니다. 이 테스트는 나열된 응용 프로그램이나 아직 탐색되지 않은 다른 응용 프로그램에서 유용할 수 있습니다.
몇 가지 광견병 혈청학적 분석이 있습니다. 신속 형광 초점 억제 검사(RFFIT), 형광 항체 바이러스 중화 검사(FAVN) 검사 또는 이들의 변형은 광견병 바이러스 중화 항체(RVNA)를 측정하는 주요 방법입니다1. 그러나 이러한 검사는 IgM 항체와 IgG 항체를 구별하지 않습니다. 광견병 면역 반응을 모니터링하는 데 항체 동형을 구별하는 것이 중요한 경우 광견병 IFA 및 광견병 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 검사가 사용되지만 RVNA를 측정하지는 않습니다. IFA 및 ELISA 검사는 샘플에서 광견병 특이 항체의 존재를 확인하는 데 사용할 수 있지만 실행 방법에는 몇 가지 차이점이 있습니다. IFA 검사는 세포 배양 살아있는 바이러스를 항원 기질로 사용하는 반면, 광견병 검출을 위한 일반적인 ELISA는 하나 이상의 바이러스 단백질을 사용합니다. 광견병 바이러스를 배양할 수 있는 실험실 환경에서, ELISA를 위한 개별 바이러스 단백질을 구매하거나 배양하는 대신 IFA 테스트를 더 쉽게 수행할 수 있습니다. 검사 목적과 광견병 혈청학적 분석 결과에서 얻은 정보는 어떤 것을 선택할지 결정할 때 고려해야 합니다2.
IgM이 가장 먼저 반응하며, 약 28일째에 클래스 전환이 관찰될 때까지 증가하며, 이 시점에서 IgG가 우세한 순환 항체가 됩니다3. 따라서 IgM은 광견병 바이러스에 노출되거나 백신 접종을 받은 후 제한된 시간 동안만 나타날 수 있습니다. 혈청과 뇌척수액(CSF)을 모두 검사하면 혈청에서만 항체가 나타나는 백신 접종을 통해 노출되었는지 아니면 뇌척수액1에서 항체가 나타날 수 있는 바이러스 감염으로 인한 것인지 알 수 있습니다.
광견병 항체는 노출 전 예방(PrEP) 후 몇 년 동안 지속되는 것으로 확인되었습니다4. IFA 테스트는 백신 접종 또는 노출 후 다양한 시점에서 이를 입증하는 유용한 도구가 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>25x55mm 유리 커버 슬립</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항인간 IgG 라벨 접합체</td><td>시그마-알드리치</td><td>F9512</td><td></td></tr><tr><td>항인간 IgM 라벨 접합체</td><td>SeraCare</td><td>5230-0286</td><td></td></tr><tr><td>흡입 피펫 팁</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHK-21 셀</td><td>ATCC</td><td>CCL-10</td><td></td></tr><tr><td>BION IFA 희석제</td><td>MBL BION</td><td>DIL-9993</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>FITC 필터가 있는 Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>EGM</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td>탑재</td></tr><tr><td>Gullsorb IgM 불활성화 시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-158</td><td>IgG 불활성화 시약</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7513</td><td>EGM</td></tr><tr><td>최소 필수 미디어 독수리 &ndash; 얼과 함께' s 염, L-글루타민, 비필수 아미노산, 소듐 바이카보네이</td>트 <td>없음 Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td>EGM</td></tr><tr><td>마우스 신경모세포종 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>멀티웰 PTFE 코팅 유리 슬라이드</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>모든</td><td></td><td>pH 7.6&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린</td><td>시그마</td><td>P-3032</td><td>EGM</td></tr><tr><td>광견병 직접 형광 항체 접합체</td><td>밀리포어 시그마</td><td>5100, 5500, 6500, RU5100 또는 RU5500</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S-5761</td><td>EGM</td></tr><tr><td>염화나트륨 결정</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5886</td><td>장착제</td></tr><tr><td>멸균 스포이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이트 염</td><td>시그마</td><td>S9137</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Trizma 사전 설정 결정 pH 9.0</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9693</td><td>마운트턴트</td></tr><tr><td>트립토스 인산염 육수 BD</td><td></td><td>260300</td><td>EGM</td></tr><tr><td>비타민 믹스</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6895</td><td>EGM</td></tr></tbody></table>

광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 광견병 igg 및 igm 항체 검출

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

광견병 간접 형광 항체(IFA) 검사는 혈청 또는 뇌척수액에서 다양한 광견병 특이적 항체 동형을 검출하기 위해 개발되었습니다. 이 검사는 빠른 결과를 제공하며 여러 가지 시나리오에서 광견병 항체를 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 광견병 IFA 검사는 광견병이 발병한 환자의 면역 반응을 평가하기 위한 항체를 빠르고 조기에 발견하는 데 특히 유용합니다. 광견병 사전 진단을 위한 다른 방법이 우선하지만, 이 검사는 항체 검출을 통해 최근의 광견병 바이러스 노출을 입증하는 데 활용될 수 있습니다. IFA 검사는 바이러스 중화 항체(VNA) 역가를 제공하지 않지만, 노출 전 예방(PrEP) 반응은 양성 또는 음성 항체 존재를 통해 평가할 수 있습니다. 이 테스트는 다양한 상황에서 활용될 수 있으며 다양한 대상에 대한 결과를 제공할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 PrEP를 투여받은 개인의 여러 쌍을 이루는 혈청 샘플을 사용하고 IFA 테스트를 사용하여 시간이 지남에 따라 광견병 항체의 존재를 입증했습니다.

모든 혈청 샘플은 PrEP 후 거의 동일한 시간대에 환자로부터 수집되었습니다. 샘플은 최종 광견병 백신 접종 후 2주, 광견병 백신 시리즈 후 6개월, 광견병 백신 시리즈 후 18개월의 시점에서 5명의 다른 환자로부터 테스트되었습니다. 각 혈청 샘플은 직렬로 희석하고 프로토콜 단계 5.2 및 5.3에 설명된 대로 IgM 및 IgG 존재 모두에 대해 등급을 매겼습니다. 할당된 항체 값은 샘플이 1-2+의 종말점 등급에 도달한 희석 계수를 나타냅니다.
PrEP 후 각 시점을 테스트한 결과는 다양한 수준의 항체 존재를 검출하는 분석의 능력을 보여줍니다. 초기 백신 접종 직후, 그림 1에서 볼 수 있듯이 환자 샘플에서 높은 수준의 IgM과 IgG가 모두 나타났습니다. 밝은 녹색 형광 세포 염색 영역은 양성 항체 존재를 나타냅니다. 적혈구는 어떤 항체도 결합할 수 없는 광견병 음성 세포입니다. 백신 접종 후 약 6개월이 지났을 때 환자 샘플에서 IgM과 IgG 모두 현저히 낮은 수치가 나타났지만 IgM은 거의 완전히 탈락했습니다. 백신 접종 후 18개월이 지난 최종 시점에서는 녹색 형광 세포 염색이 관찰되지 않은 그림 2에서 볼 수 있듯이 환자 샘플에서 IgM 항체가 검출되지 않았습니다. 그러나 IgG 수치는 지속되었으며 2주 시점의 초기 감소 후 6개월 시점에 검출된 수치와 유사하게 유지되었습니다. 백신 접종 후 2주, 접종 후 6개월, 접종 후 18개월의 검체에서 IgG 및 IgM 검출 결과를 각각 표 1, 표 2 및 표 3에 기재하였다. 그림 3은 실행 단계의 순서도를 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig01.jpg"> 그림 1: 광견병 IgM IFA 양성 염색. 1:8 희석의 환자 혈청은 PrEP 백신 시리즈가 완료된 직후 양성 염색 패턴을 보여주었습니다. 이미지의 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig02.jpg"> 그림 2: 광견병 IgM IFA 음성 염색. 1:2 희석의 환자 혈청은 PrEP 백신 시리즈 완료 후 약 18개월 동안 양성 염색이 나타나지 않았습니다. 이미지의 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig03.jpg"> 그림 3: 광견병 IFA 순서도. 프로세스 시각화를 돕기 위해 IFA 절차의 주요 단계의 실행 단계를 보여주는 흐름도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>환자 샘플</td>
			<td>이그엠</td>
			<td>IgG (이그지)</td>
		</tr><tr><td>PS1-1 시리즈</td>
			<td>1:32</td>
			<td>1:512</td>
		</tr><tr><td>PS2-1 시리즈</td>
			<td>1:8</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-1 시리즈</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:256</td>
		</tr><tr><td>PS4-1 시리즈</td>
			<td>1:64</td>
			<td>1:512</td>
		</tr><tr><td>PS5-1 시리즈</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:128</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 백신 접종 2주 후의 결과. PrEP 백신 시리즈 완료 후 약 2주 후에 수집된 혈청 샘플의 환자 샘플 결과.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>환자 샘플</td>
			<td>이그엠</td>
			<td>IgG (이그지)</td>
		</tr><tr><td>PS1-2 시리즈</td>
			<td>1:2</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS2-2 시리즈</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-2 시리즈</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS4-2 시리즈</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:256</td>
		</tr><tr><td>PS5-2 시리즈</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:32</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 백신 접종 후 6개월 후의 결과. PrEP 백신 시리즈 완료 후 약 6개월 후에 수집된 혈청 샘플의 환자 샘플 결과.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>환자 샘플</td>
			<td>이그엠</td>
			<td>IgG (이그지)</td>
		</tr><tr><td>PS1-3 시리즈</td>
			<td>감지되지 않음</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS2-3 시리즈</td>
			<td>감지되지 않음</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-3 시리즈</td>
			<td>감지되지 않음</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS4-3 시리즈</td>
			<td>감지되지 않음</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS5-3 시리즈</td>
			<td>감지되지 않음</td>
			<td>1:32</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 백신 접종 후 18개월 후의 결과. PrEP 백신 시리즈 완료 후 약 18개월 후에 수집된 혈청 샘플의 환자 샘플 결과.

이 원고의 목적은 광견병 특이적 IgG 및 IgM 항체 검출을 위한 광견병 간접 형광 항체 검사의 사용을 조사하는 것입니다.

광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 광견병 IgG 및 IgM 항체 검출

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...

IFA 검사는 광견병 감염 시 항체 반응을 평가하거나 백신의 면역 반응을 평가합니다. 샘플에서 항체 존재를 확인하고 어떤 항체 동형이 존재하는지 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 중화 항체 분석은 광견병 항체 검출의 황금 표준으로, 노출 전 또는 노출 후 예방을 받은 사람의 항체 역가를 평가합니다.IFA 검사는 중화항체 분석과 다른 결과를 산출할 수 있지만, 대안으로 사용될 때 여전히 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 일반적으로 광견병 중화항체를 측정하는 분석법은 면역 반응을 평가합니다. 그러나 이러한 검사는 며칠이 걸리므로 바이러스 및 살아있는 세포 배양이 필요합니다.IFA 검사는 며칠이 아닌 몇 시간 만에 결과를 얻을 수 있는 검사를 위한 항원 슬라이드의 고급 준비를 가능하게 합니다. 인간 광견병 사례에 IFA 테스트를 사용하면 개인의 면역 체계가 광견병 감염에 어떻게 반응하는지에 대한 더 많은 답을 얻을 수 있습니다. 사례마다 큰 차이가 있으며, 이 검사는 질병 중에 실시간으로 결과를 제공할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 감염된 쥐의 뇌 조직에서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색을 보여줍니다. 이 과정에는 탈파라핀화(deparaffinization) 및 알코올 처리(alcohol treatment)가 포함되며, 항원 접근성을 높이기 위한 단백질 분해 처리(proteolytic treatment)가 이어집니다. 면역조직화학 염색을 통해 붉은 침전물이 나타나 조직 단면에 광견병 항원이 존재함을 확인합니다.

광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색

직접 급속 면역 조직 화학 검사 (DRIT)는 광견병 진단을위한 직접 형광 항체 (DFA) 테스트에 대한 인식 대안 동물 보건 및 세계 보건 기구 (OIE / WHO)에 대한 세계 기구를 제공합니다. 이 시험은 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 두뇌 노출에 따라 대략 1 시간에서 수행 될 수있는 필드 기반 응용 프로그램을 허용합니다.

직접 신속한 면역 기능 화학 검사를 사용하여 향상된 광견병 감시

여기에서 우리는 광견병 백신에 있는 면역원성 당단백질 내용을 결정하기 위하여 간접적인 ELISA 샌드위치 면역 포착을 기술합니다. 이 시험은 당단백질 트리머를 인식하는 중화 단일클론 항체(mAb-D1)를 사용한다. 그것은 생산 하는 동안 백신 힘의 일관성을 따라 생체 내 NIH 테스트에 대 한 대안.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

우리는 뇌 생검 샘플링에서 최종 해석에 이르기까지 신속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트 (RIDT)를 사용하여 필드 조건하에서 동물 광견병의 사후 진단을위한 완전한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 분자 분석 및 바이러스 성 지노티핑을 위한 장치를 사용하여 추가 응용을 설명합니다.

추가 분자 응용을 가진 자원 제한 적인 설정을 위한 필드 사후 광견병 급속한 면역학로토그래피 진단 시험

여기서, 우리는 조혈 고정 조직을 위한 대체 진단 시험으로서 광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험 프로토콜을 제시한다.

포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험

이 프로토콜은 체외 전사를 사용하여 다양한 소 뇌 해부학 구조 내에서 광견병 바이러스 뉴클레오프로틴(N) 유전자 복사 수를 결정하기 위한 qRT-PCR 기반 접근법을 제시한다.

다양한 소 뇌 구조에서 광견병 바이러스의 양

인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

우리는 특정 카파(Vκ) 경쇄를 가진 인간 및 마우스 IgM 항체에 대한 항원을 포함하는 단백질 부분을 식별하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 IgM 계열 항체에 국한되지 않고 면역침전 중에 충분히 높은 친화력으로 항원을 표적으로 하는 모든 면역글로불린 동형에 적용됩니다.

카파 (Vκ)에 대한 항체 결합 특이성 빛 체인 함유 인간 (IgM의) 항체 : Polysialic 산 (PSA) 사례 연구로 NCAM에 첨부

여기에서는 인간과 생쥐의 혈청 IgG 및 IgM 자가항체를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 어레이를 통해 관심 항원 또는 항원결정기에 대한 항체를 고처리량 및 정량적으로 검출할 수 있습니다.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

작은 분자와 항체를 라벨에 대한 온 - 비드 방법은 직접 세포 미디어에서 항체의 소량의 라벨 수 있습니다. 이 방법은 아민 및 티올 화학과 호환 가능하며, 병렬로 다수의 시료를 수동 또는 자동 플랫폼을 사용하여 처리 할 수​​있다.

형광 염료와 항체 라벨은 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈를 사용하여

배우세요 광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 IgG 및 IgM 항체 검출 방법입니다. 이 기법은 감염 시 항체 반응 평가와 백신 접종 후 면역 반응 분석에 활용됩니다.

광견병 간접 형광 항체 검사를 이용한 광견병 IgG 및 IgM 항체 검출

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