Name: Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 학습하세요 Saccharomyces cerevisiae에서 단일 복제 유전자 자리의 염색질 정제 방법을. 교차결합 없이 단백질-DNA 상호작용을 연구하고 생리학적 기능을 분석할 수 있는 강력한 기술입니다.

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S.H. 실험실에서의 작업은 SFB1064(프로젝트 ID 213249687), 유럽 연구 위원회(ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) 및 Helmholtz Gesellschaft를 통해 DFG의 지원을 받았습니다.

효모 세포에서 locus-specific Chromatin 분리

<ol><li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryote+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome.</a> Cell. 98 (3), 285-294 (1999).</li>
<li>Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+enrichment+of+specific+chromatin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and enrichment of specific chromatin loci.</a> Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).</li>
<li>Korthout, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+chromatin+proteome+of+a+single+genomic+locus+by+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).</li>
<li>Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+landscape+at+Drosophila+melanogaster+telomere-associated+sequence+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Ide, S., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-targeting+proteomics+of+isolated+chromatin+segments+of+a+mammalian+ribosomal+RNA+gene+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter.</a> Nature Communications. 6, 6674(2015).</li>
<li>Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+histone+acetylation+regulate+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26amp%3B+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+protein-DNA+interactions+in+human+alphoid+chromatin+via+hybridization+capture+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+chromatin-associated+proteins+via+sequence-specific+capture+and+mass+spectrometric+protein+identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 7111(2017).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+chromatin+domains+from+single-copy+gene+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Analysis+of+DNA+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+and+structural+analysis+of+selected+chromosomal+domains+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).</li>
<li>Weiβ, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+locus+proteomics+of+early-+and+late-firing+DNA+replication+origins+identifies+a+role+of+Ask1%2FDASH+complex+in+replication+timing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control.</a> Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol">https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol</a> (2023).</li>
<li>Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+chromatin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Locus-specific chromatin isolation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

특정 표적 게놈 영역의 인자 및 염색질 지형을 식별하는 것은 염색질 연구에서 계속해서 주요 과제를 제기하고 있다18. 이 프로토콜은 효모 염색체에서 뚜렷한 염색질 도메인을 특이적으로 절제하고 정제하는 효율적인 시스템을 설명합니다. 우리가 아는 한, 이 단일 단계 정제의 순도와 수율은 유전자좌 특이적 염색질 정제 방법의 많은 한계를 극복하여 다른 관련 없는 게놈 영역에 비해 표적 유전자좌의 매우 높은 농축을 달성할 수 있습니다.
부위 특이적 R-재조합효소를 사용한 추가 절제 단계로 인해, 또 다른 장점은 게놈에서 재조합 부위의 정확한 위치에 따라 정제되는 게놈 영역을 정확하게 결정할 수 있다는 것입니다. 대조적으로, 다른 방법은 초음파 처리에 의한 DNA 전단에 의존하며, 이는 이질적인 분자 길이를 초래합니다. 이러한 이질성으로 인해 이러한 방법은 잘 정의된 표적 유전자좌의 정제 측면에서 덜 정확합니다. 
<p class="jove...

진핵생물 게놈을 염색질로 역동적으로 조직하면 DNA가 핵의 한계 내에 맞도록 압축되는 동시에 유전자 발현을 위한 충분한 역학과 조절 인자에 대한 접근성을 보장합니다. 부분적으로, 이 다재다능함은 히스톤 옥타머1 주위에 ~1.7배 감싼 DNA의 147 bp를 가진 핵심 입자를 포함하는 염색질의 기본 단위인 뉴클레오솜에 의해 매개됩니다. 뉴클레오솜은 N- 및 C-말단 히스톤 꼬리에 수많은 히스톤 변이체와 번역 후 변형(PTM)이 있는 구성과 관련하여 매우 역동적인 구조입니다. 또한 진핵 염색질은 전사 인자, DNA 및 RNA 처리 기계, 건축 단백질, 염색질 리모델링 및 변형에 관여하는 효소, 염색질과 관련된 RNA 분자와 같은 다양한 다른 필수 구성 요소와 상호 작용합니다. 전사, 복제 및 복구와 관련된 이러한 중요한 기계는 모두 이러한 과정의 천연 기질 역할을 하는 크로마틴에 대한 접근이 필요합니다. 결과적으로, 이러한 DNA 거래의 기초가 되는 분자 메커니즘을 이해하려면 이러한 기계가 수렴하고 생물학적 반응을 촉진하는 특정 게놈 영역에서 염색질 구조의 집합적 변화를 정확하게 정의해야 합니다.
유전학 및 단백질-단백질 상호 작용 연구를 통해 수많은 염색질 인자를 식별했음에도 불구하고 특정 게놈 부위에서 염색질 상호 작용에 대한 직접적이고 편향되지 않은 포괄적인 분석을 수행하는 것은 중요한 장애물로 남아 있습니다 2,3. 초기에는 게놈의 매우 풍부한 영역(즉, 반복적 유전자좌) 또는 다중 복제 플라스미드만 관련 단백질 4,5,6,7의 질량 분석 식별을 위해 충분한 양과 순도로 분리할 수 있었습니다. 크로마틴화된 DNA에 대한 포획 프로브의 직접 하이브리드화, CRISPR-dCas9 시스템을 사용한 근접 비오틴화 또는 염기서열 특이적 어댑터 단백질을 관심 유전자좌에 결합하는 것을 기반으로 하는 일련의 새로운 접근 방식은 효모 및 포유류 게놈 8,9,10에서 단일 복제 유전자좌의 단백질체를 풀기 시작했습니다. 그러나 이러한 모든 방법은 단백질-DNA 상호 작용을 안정화하기 위해 포름 알데히드 교차 결합과 후속 정제를 위해 염색질을 용해시키기 위해 초음파 처리가 필요합니다. 두 조작 모두 정제된 크로마틴의 후속 구조적 및 기능적 연구 가능성을 배제합니다.
이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 이전에 효모11,12에서 표적 염색체 도메인을 추출하기 위해 부위 특이적 재조합을 사용하는 방법론을 고안했습니다. 본질적으로, 관심의 게놈 영역은 Zygosaccharomyces rouxi의 부위 특이적 R-재조합효소에 대한 인식 부위(RS)로 둘러싸여 있으며, 동시에 동일한 영역 내에서 원핵생물 전사 억제제 LexA 단백질(LexA)에 대한 3개의 DNA 결합 부위 그룹을 통합합니다. 효모 세포에는 R-재조합효소의 동시 발현을 위한 발현 카세트와 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그에 융합된 LexA 단백질이 포함되어 있습니다. R-재조합효소의 유도 후, 효소는 원형 염색질 도메인의 형태로 염색체에서 표적 영역을 효율적으로 절제합니다. 이 도메인은 LexA DNA 결합 부위와 친화성 지지체에 결합하는 LexA-TAP 어댑터 단백질을 통해 정제할 수 있습니다. 이 방법은 효모 염색체 III13의 선택된 복제 기원을 포함하는 뚜렷한 염색질 도메인을 분리하는 데 최근에 사용되었습니다.
이 생체 외 접근법의 주요 장점 중 하나는 분리된 물질의 기능적 분석이 가능하다는 것입니다. 예를 들어, 이 방법으로 정제된 복제 기원 도메인은 in vitro 복제 분석을 통해 native in vivo 조립 염색질 템플릿으로부터 시험관에서 기원 발화의 효율성을 평가할 수 있습니다. 궁극적으로, 분리된 물질의 생화학적 및 기능적 특성화는 천연 염색질 주형과 함께 정제된 단백질을 사용하여 핵 공정의 재구성을 허용할 수 있습니다. 요약하면, 이 방법론은 특정 염색체 거래를 겪는 특정 게놈 영역의 집합적 구성 및 구조적 염색질 변화를 추적할 수 있기 때문에 염색질 연구에서 흥미로운 길을 열어줍니다.

<table><tbody><tr><td>효모 균주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control 변형: MATa; ura3&Delta; 0; leu2&Delta; 0; 그의3&델타; 1; met15&델타; 0; 바1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Section 1, 참고 문헌 13 및 14 참조</td></tr><tr><td>Recombination Strain: MATa; ura3&Delta; 0; leu2&Delta; 0; 그의3&델타; 1; met15&델타; 0; 바1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Section 1, 참조 13 및 14</td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K238 plasmid</td><td></td><td></td><td>Section 1 참조, 참조 13 참조 Storage: store at -20 &deg; C</td></tr><tr><td>K071 스파이크인 플라스미드 DNA</td><td></td><td></td><td>섹션 7.1, 참조 참조 13 참조저장: -20°C에 보관; C</td></tr><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Carl Roth</td><td>5025.1</td><td>Section 2 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>아세트산 암모늄 (NH4Ac)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7262</td><td>Section 6 및 7.1 보관: 실온에서</td></tr><tr><td>보관 암모늄 용액 (NH4OH) 25%</td><td>Merck Millipore</td><td>533003</td><td>섹션 6 보관: 실온에서 보관</td></tr> 황<tr><td>산암모늄</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-29085</td><td>섹션 2 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>Bacto 한천</td><td>BD(VWR)</td><td>90000-760</td><td>섹션 3 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>Bacto 펩톤</td><td>BD(VWR)</td><td>211820</td><td>섹션 3 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>07604</td><td>단면도 7.2 저장: 4에 저장하십시오 &deg; C</td></tr><tr><td>화학발광 기판 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>34580</td><td>섹션 7.2 보관: 4°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate dodecahydrate</td><td>Merck</td><td>1.06579.1000</td><td>Section 2 및 7.1 보관: 실온</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td>Section 4 보관: 4°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>머크</td><td>100983</td><td>섹션 7.1 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마 알드리치</td><td>ED</td><td>섹션 7.1 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>갈락토스(20%(w/v) 재고)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>G0625-1KG&nbsp; /&nbsp; 5KG</td><td>섹션 3 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>젤 로딩 염료 (6x)</td><td>BioLabs</td><td>B7024A</td><td>섹션 7.1 저장: -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>Glusose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Section 저장: 실온</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl</td> <td>Roth.0079.4</td><td>Section 2 저장: 실온 Glycogen</td></tr><tr><td>(5 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td>Section 7.1 Storage: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>염산 (HCl)</td> <td>PanReac AppliChem</td><td>182109.1211</td><td>섹션 2, 4 및 7.1 보관 : 실온에서 보관</td></tr><tr><td>마그네슘 아세테이트 (MgAc)</td> <td>Bernd Kraft</td><td>15274.2600 / C035</td><td>섹션 4 보관 : 실온에서 보관</td></tr><tr><td>염화 마그네슘 (MgCl2)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>섹션 6 보관 : 실온에서 보관</td></tr><tr><td>Nu PAGE LDS 샘플 버퍼 (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>2399549</td><td>섹션 7.2 보관: 실온에서</td></tr><tr><td>보관 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 (25:24:1 v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>섹션 7.1 보관: 4°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td> <td>Sigma</td><td>P9541</td><td>섹션 4 보관 :</td></tr><tr><td>방사성 라벨 &alpha; -32P dATP (3,000 Ci / mmol, 10 mCi / mL)</td><td>Hartmann Analytic</td><td>SRP-203</td><td>섹션 7.1 보관 : 4 °C에서 보관; C</td></tr><tr><td>RadPrime 라벨링 시스템</td><td>ThermoFisher</td><td>18428-011</td><td>섹션 7.1 보관: -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>라피노스 (20% (w/v) 재고)</td><td>SERVA</td><td>34140.03</td><td>섹션 3 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Merck</td><td>K53710504142</td><td>섹션 7.1 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>구연산나트륨(Na3C6H5O7)</td><td>시그마-알드리치</td><td>71402</td><td>섹션 7.1 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>섹션 7.1 저장: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>나트륨 n-도데실 설페이트 (SDS) (5% 재고 (w/v) )</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11183</td><td>섹션 7.1 저장: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>소듐 인산 단염기</td>성 <td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td>섹션 2 및 7.1 저장: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>나트륨&nbsp; 아지데</td><td>산타 크루즈&nbsp; Biotechnology</td><td>sc-208393</td><td>Section 2 Storage: store at -20 & deg; 생명공학 sc-208393 섹션 2br/ 저장: -20°C; 씨</td></tr><tr><td>&nbsp; Triethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90340</td><td>Section 2 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Chem Cruz</td><td>SC-3715B</td><td>Section 2 및 4 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Section 2 및 4 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bernd Kraft</td><td>18014332</td><td>섹션 4 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD(VWR)</td><td>212720</td><td>섹션 3 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>효모 짝짓기 인자 알파(1 &마이크로; g/mL 재고)</td><td>&nbsp; Biomol</td><td>Y2016.5</td><td>섹션 3 보관: -20°C에 보관; </td></tr><tr>LEUCINE <td>Sigma Aldrich</td><td>Y1376</td> 섹션 1이<td>없는 C 효모 합성 드롭아웃 매체 보충제</td><td>, 참조 14</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HpaI 제한 효소(5,000 U/mL)</td> 참조<td>NEB</td><td>R0105S</td><td>섹션 7.1 보관: -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일 (100개)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78446</td><td>섹션 4 저장: 저장 at4 &deg; C</td></tr><tr><td>Proteinase K (10 mg/mL)</td><td>SERVA</td><td>33756</td><td>단면도 7.1 저장: -20°C에 저장; C</td></tr><tr><td>RNase A (10 mg/mL)</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td>섹션 7.1 보관: -20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>TEV 프로테아제(10000 U/&마이크로; L)</td><td>NEB</td><td>P8112S</td><td>섹션 5 보관: -20°C에 보관하십시오. C</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BcMag 에폭시 활성화 자석 비드</td><td>Bioclone Inc.</td><td>FC-102</td><td>단면도 2 저장: 4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td></td><td></td><td>섹션 4</td></tr><tr><td>저결합 원심분리기 튜브 2.0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>섹션 4</td></tr><tr><td>Microspin&nbsp; G-25 컬럼</td><td>Cytiva</td><td>27-5325-01</td><td>섹션 7.1 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Merck</td><td>P7793</td><td>섹션 4</td></tr><tr><td>포지티브 나일론 멤브레인</td><td>Biozol</td><td>11MEMP0001</td><td>섹션 7.1 보관: 실온에서 보관</td></tr><tr><td>PVDF 전사막</td><td>Immobilon-Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>섹션 7.2 보관: 방에 보관 온도</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 젤 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; NP0336BOX</td><td>섹션 7.2 보관: 4 &deg에 보관; </td></tr><tr><td>루어 피팅이 있는 C 주사기(25mL)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4200-000V0</td><td>Section 3</td></tr><tr><td>Whatman 종이(3MM 등급 CHR 셀룰로오스 웨스턴 블로팅 종이 시트)</td><td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>섹션 7.1 보관: 실온</td></tr><tr><td>에서 보관항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-LexA, 토끼 다클론 IgG, DNA 결합 영역 항체</td><td>Merck Millipore</td><td>06-719</td><td>섹션 7.2 보관: -20°에서 보관; C</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG (H + L), 양 고추 냉이 과산화 효소 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>G21234</td><td>섹션 7.2 저장 : -20 &deg에 보관하십시오. </td></tr><tr><td>C Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) 항체는 TAP 태그가 지정된 단백질의 검출을 위해 토끼에서 생성됨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1291-500UL</td><td>단면도 7.2 저장: -20°C에 저장; C</td></tr><tr><td>토끼 IgG 항체 시</td><td>그마</td><td>I5006-100MG</td><td>단면도 2 저장: 4개의 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Primers (10 &마이크로; M)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT</td><td></td><td></td><td>Section 7.1</td></tr><tr><td>K071 스파이크인 플라스미드 DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT</td><td></td><td></td><td>Section 7.1</td></tr><tr><td>효모 게놈 DNA의 PCR 단편을 템플릿으로 사용 &nbsp; ARS316 증폭 (남부 블롯 용) : < / 강> fwd 5 '- AAATTCTGCCCTTGATTCGT&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT</td><td></td><td></td><td>섹션 7.1</td></tr><tr><td>PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT</td><td></td><td></td><td>섹션 7.1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커피 그라인더</td><td>Gastroback</td><td>42601</td><td>섹션 4</td></tr><tr><td>듀어 플라스크</td><td>NAL GENE</td><td>4150-2000</td><td>Section 3</td></tr><tr><td>DynaMag TM-2 마그네틱 랙</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Section 4, 5 및 6</td></tr><tr><td>하이브리드화 오븐</td><td>Hybaid Mini10</td><td>Ri418</td><td>Section 2</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Section 4 및 7.1</td></tr><tr><td>UV 가교제</td><td>분석기</td><td>95-0174-02</td><td>Section 7.1</td></tr></tbody></table>

single-copy gene locus chromatin purification in saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

진핵 염색질의 기본 조직 단위는 뉴클레오솜 코어 입자 (NCP)이며, 이는 히스톤 옥타머 주위에 ~ 1.7 배 감싼 DNA로 구성됩니다. 크로마틴은 NCP와 전사 인자, 염색질 리모델링 및 변형 효소를 포함한 수많은 다른 단백질 복합체의 실체로 정의됩니다. 이러한 단백질-DNA 상호 작용이 세포주기의 여러 단계에서 특정 게놈 위치 수준에서 어떻게 조정되는지는 아직 불분명합니다. 이는 주로 현재의 기술적 한계로 인해 이러한 동적 상호 작용의 정확한 측정값을 얻기가 어렵기 때문입니다. 여기서는 부위 특이적 재조합과 효율적인 단일 단계 친화성 정제 프로토콜을 결합하여 네이티브 염색질 상태에서 단일 복제 관심 유전자 자리를 분리하는 개선된 방법을 설명합니다. 이 방법은 게놈 크로마틴에 대한 표적 자리의 강력한 농축을 허용하므로 이 기술은 질량 분석법과 같은 편향되지 않고 체계적인 방식으로 단백질 상호 작용을 식별하고 정량화하기 위한 효과적인 전략이 됩니다. 이러한 조성 분석에 더하여, 이 방법에 의해 정제된 천연 염색질은 뉴클레오솜 위치 지정 및 히스톤 변형에 관한 생체 내 상황을 반영할 가능성이 높으며, 따라서 효모의 거의 모든 게놈 유전자좌에서 유래한 염색질의 추가 구조 및 생화학적 분석에 적합합니다.

~1.4kb ARS316 크로마틴 도메인의 정제는 구성적으로 발현된 LexA-TAP 어댑터 단백질에 의해 매개되었습니다. 음성 대조군으로 사용하기 위해 LexA-TAP을 발현하지만 통합 RS 및 LexA 결합 부위를 포함하지 않는 동종 균주를 사용하여 정제를 수행했습니다. 그림 3 은 ARS316 유전자좌를 표적으로 하는 대조군과 재조합 가능 균주 모두에 대해 수행된 표준 정제 실험의 DNA 분석 결과를 보여줍니다. 원형 DNA 분자를 선형화하기 위한 DNA 분리 및 제한 효소 분해 후, qPCR 분석을 수행하여 관련 없는 게놈 제어 위치 PDC1에 대한 ARS316 표적 자리의 정제 효율을 평가했습니다.
또한, 전체 염색질에 대한 ARS316 유전자좌의 농축을 정량화했습니다(그림 3A,B). 음성 대조군 균주는 조세포 추출물, 투입 및 플로우...

이 프로토콜은 신진 효모인 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 네이티브 염색질 맥락에서 관심 있는 단일 복제 유전자 자리를 정제하기 위해 부위 특이적 재조합을 기반으로 하는 유전자좌 특이적 염색질 분리 방법을 제시합니다.

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

진핵 핵은 동시에 발생하는 많은 생물학적 과정으로 매우 붐비고 있습니다. 우리 연구의 범위는 이러한 모든 과정이 게놈 불안정성과 인간 질병으로 이어질 수 있는 큰 사고 없이 게놈에서 어떻게 조정되는지 이해하는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하면 원래 상태에서 게놈의 특정 유전자좌를 정제할 수 있으므로 단백질 DNA 상호 작용 측정과 같은 분리된 물질의 구성 및 기능적 특성을 모두 수행할 수 있습니다.이 프로토콜은 표적 유전자좌의 엄청난 수준의 농축을 가능하게 하여 유전자좌 특이적 염색질 분리의 많은 현재 한계를 극복합니다. 재료가 가교되지 않았습니다. 또한 in vitro transcription 또는 in vitro replication과 같은 많은 다운스트림 기능 분석이 가능합니다.이 프로토콜을 통해 효모 염색체에서 뚜렷한 복제 기원을 절제 및 정제할 수 있어 단백질체 분석을 수행하고 염색질 인자와 상호 작용하는 새로운 기원을 식별할 수 있으므로 DNA 복제 연구 분야를 발전시킬 수 있습니다. 이 프로토콜은 정제된 기원 물질을 사용하여 염색질 상태, 히스톤 변형을 검사하고 내인성 염색체의 천연 뉴클레오솜 템플릿에 대한 구조 분석을 수행하여 염색질 연구를 발전시키는 시험관 내 복제 연구를 가능하게 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 논문은 염색체 외 원형 DNA(eccDNA)를 정제하기 위한 Circle-Seq라는 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법에는 컬럼 정제, 남아 있는 선형 염색체 DNA 제거, 롤링 서클 증폭 및 고처리량 염기서열분석이 포함됩니다. Circle-Seq는 진핵생물 eccDNA의 게놈 규모 스크리닝 및 게놈 불안정성 및 복제 수 변이 연구에 적용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

여기, 우리는 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에서 수정 된 히스톤의 염색 질 immunoprecipitation에 대 한 프로토콜을 설명합니다. Immunoprecipitated DNA가 풍부 하 고 지역화의 게놈을 통해 히스톤 포스트 번역 상 수정 양이 많은 PCR 이후에 사용 됩니다.

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

단일 crRNA 어레이와 결합된 CRISPR/Cas12a 시스템은 여러 로시에서 동시에 S. 세레비시아 게놈의 효율적인 멀티플렉스 편집을 가능하게 합니다. 이것은 이후에 효모 픽셀 예술을 만드는 데 사용되는 효모 균주를 생산하는 카로티노이드를 구성하여 입증됩니다.

CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 사카로미세세세레비시아와 이스트 픽셀 아트의 창조

다음은 Saccharomyces cerevisiae에서증가 된 복사 번호 억제기 화면을 통해 유전 적 상호 작용을 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 단명한 효모 돌연변이체에서 억제제를 식별, 복제 및 테스트할 수 있습니다. 우리는 autophagy null 돌연변이의 수명에 SIR2의 복사 수 증가의 효과를 테스트합니다.

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

이 연구는 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리를 사용하여 질의 돌연변이 균주와 관련된 기능 상실 표현형의 억제인자 클론(들)을 식별합니다. ell1 null 돌연변이체의 신규한 유전자 억제인자를 이 스크린을 사용하여 확인하였다.

Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

이 원고는 돌연변이를 thermostabilizing을 선별 인간의 세로토닌 수송을 정화, 높은 친 화성 항체를 생성하고, 항우울제 약물 S의 시탈 로프 람 바인딩 세로토닌 수송 - 항체 복합체를 결정화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 도전 막 수송 수용체와 채널들의 연구에 적용 할 수있다.

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

여기에서는 S100A12 (calgranulin C)를 발현 및 정제하는 방법을 제시합니다. 우리는 인간 병원균 H. pylori 에 대한 항균 활성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다.

S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

여기 우리는 큰 규모에 높은 감도 가진 평형에서 및 솔루션에서 바인딩 선호도 결정 하기 위한 새로운 방법을 제시. 이 녹음 방송 요인 DNA 바인딩의 정량 분석을 향상 시킵니다. 메서드를 사용 하면 제어 전달 시스템에 자동화 된 형광 이방성 측정을 기반으로 합니다.

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

학습하세요 Saccharomyces cerevisiae에서 단일 복제 유전자 자리의 염색질 정제 방법을. 교차결합 없이 단백질-DNA 상호작용을 연구하고 생리학적 기능을 분석할 수 있는 강력한 기술입니다.

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

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