Name: 자가포식 관련 4B 시스테인 펩티다아제 억제제에 대한 세포 기반 약물 스크리닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 배우세요 ATG4 시스테인 프로테아제 활성을 루시퍼레이스 기반 세포 분석법으로 모니터링하여 고처리량 스크리닝을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 암 및 신경퇴행성 질환 치료를 위한 소분자 저해제 발굴에 활용됩니다.

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이 연구는 MRC-UCL 대학 단위 보조금 Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK(보조금 참조 2018RIF_15) 및 MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054의 자금 지원을 받는 UCL Therapeutic Acceleration Support 계획에 대한 영국 의학 연구 위원회의 핵심 자금 지원을 받았습니다. ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC)를 암호화하는 플라스미드는 Dr. Robin Ketteler (베를린 의과대학 인간 의학과)로부터 수득하였다.

4B 시스테인 펩티다아제 자가포식 억제제에 대한 고처리량 스크리닝 분석

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 ATG4B 억제제의 식별을 위한 세포 기반 리포터 유전자 분석을 설명합니다. 1차 히트의 식별은 β-actin과 dNGLUC 사이에서 LC3B의 전체 길이 개방 판독 프레임을 발현하는 세포 처리에 따른 루시페라아제 활성을 기반으로 합니다. 이 분석법의 몇 가지 장점은 세포를 용해하지 않고 dNGLUC를 검출할 수 있기 때문에 민감하고 정량이 많으며 비침습적이라는 것입니다. 이 논문은 안정적인 세포주와 1차 스크리닝을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 
먼저, 본 프로토콜은 높은 transfection 효능과 높은 증식 능력을 나타내는 PANC1 세포주를 사용하였다. 이러한 스크리닝 방법은 다른 세포주를 사용하여 수행할 수 있지만, 형질도입 효능은 세포주마다 다를 수 있다. 둘째, 통로 번호가 5보다 높은 냉동 재고에서 안정적인 세포 집단으로 작업하는 것은 시간이 지남에 따라 보고자의 발현 수준이 감소할 수...

자가포식은 세포가 세포 내 항상성을 유지하고 리소좀 1,2,3을 통해 노화되거나 결함이 있거나 불필요한 세포 내용물을 분해하여 스트레스에 반응할 수 있도록 하는 보존된 대사 과정입니다. 일부 병태생리학적 조건에서 이 과정은 영양소 및 산소 결핍에 대한 중요한 세포 반응으로 작용하여 재활용된 영양소와 지질을 생성하여 세포가 대사 요구에 적응할 수 있도록 합니다 2,3,4. 자가포식은 또한 신경퇴행성 질환, 병원체 감염 및 다양한 유형의 암과 같은 여러 질병과 관련된 세포 스트레스 반응으로 확인되었습니다. 암에서 자가포식의 기능은 복잡하며 종양의 유형, 병기 및 상태에 따라 달라집니다. 손상된 세포의 자가포식 분해를 통해 종양 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 저산소증, 영양 결핍 및 세포독성 손상과 같은 스트레스 조건에서 세포 생존을 개선하여 진행성 종양의 생존을 촉진할 수 있습니다 2,4,5,6.
여러 연구에 따르면 자가포식 억제는 항암 전략으로 이점을 제공합니다. 따라서, 자가포식체 형성 또는 리소좀과의 융합과 같은 중요한 단계의 억제는 암 조절을 위한 효과적인 방법이 될 수 있다 2,4,5,6. ATG4B가 특정 병리학적 상태에 관여한다는 증거가 늘어나고 있으며, 잠재적인 항암 표적 2,3,4로 주목받고 있습니다. 예를 들어, 대장암 세포와 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 양성 유방암 세포는 인접한 정상 세포보다 ATG4B 발현 수준이 유의하게 높은 것으로 관찰되었습니다 2,4. 전립선암 세포에서 ATG4B의 억제는 화학요법 및 방사선요법에 대한 세포주 특이적 감수성을 초래했다7. 최근 췌관 선암(PDAC)이 ATG4B 억제에 특히 취약하다는 강력한 증거가 나타났습니다. 예를 들어, 유전자 조작 마우스 모델에서 ATG4B 기능의 간헐적 손실은 PDAC 종양 성장을 감소시키고 생존을 증가시키는 것으로 나타났습니다 3,4. 전반적으로, ATG4B는 일부 암 유형에서 매우 과발현되고, 종양의 진행과 관련이 있으며, 암 치료 내성과 관련이 있다 2,4,8.
포유류의 ATG4 시스테인 프로테아제에는 ATG4A-ATG4D의 4가지 가족 구성원이 있습니다. 이들 단백질은 단백질 9,10,11의 LC3/GABARAP (ATG8) 계열에 대해 일부 표적 선택성을 나타내며 이들의 프로테아제 활성과 연결되지 않은 추가 기능을 가질 수 있다12,13. 또한, ATG4는 새로운 유형의 번역 후 변형, 단백질11,12의 ATG8-ylation을 조절하는 기능을 합니다. ATG4B와 그 주요 기질 LC3B가 가장 널리 연구되고 있지만, 자가포식 및 비자가포식 과정의 조절에서 각 아과 구성원에 대한 복잡한 역할을 시사하는 그림이 나타나고 있습니다. 이는 인산화(phosphorylation), 아세틸화(acetylation), 글리코실화(glycosylation) 및 니트로실화(nitrosylation) 9,10,11,12,13을 통해 ATG4B 활성을 조절하는 번역 후 변형(post-translational modification)의 복잡한 네트워크에 의해 더욱 확증된다.
여러 가지 알려진 ATG4B 억제제가발표되었습니다 2,4,14,15. 이들은 연구 도구로 적합하지만 약력학적 프로파일, 선택성 또는 효능으로 인해 아직 전임상 후보 물질로 개발되지 못했습니다 4,16. 전반적으로, 더 강력하고 선택적인 화합물을 식별하는 것이 시급합니다. 종종 화합물은 단백질 기능의 우수한 생화학적 억제제이지만 세포 기반 분석에서는 효능이 좋지 않습니다. ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 여러 분석법이 있으며, 여기에는 생화학적 방법과 세포 기반 분석법이포함된다 4. 우리는 이전에 세포 8,17에서 ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 간단한 발광 기반 고처리량 분석을 개발했습니다. 이 분석법은 세포외 환경에서 안정적이고 활성이 높으며 ATG4B 단백질 분해 활성에 반응하여 세포에서 유도적으로 방출될 수 있는 가우시아 프린셉스(GLUC)의 루시페라아제 단백질을 사용합니다18,19.
이 리포터 구조에서 dNGLUC는 세포의 액틴 세포골격에 연결되어 있습니다. 프로테아제 특이적 링커는 β-actin anchor와 dNGLUC 사이에 도입될 수 있으며, 링커의 절단에 따라 분비물을 전환할 수 있습니다. LC3B 절단17,18,19를 모니터링할 수 있도록 β-actin과 dNGLUC 사이에 있는 LC3B의 전체 길이 개방 판독 프레임을 사용했습니다. dNGLUC의 분비 메커니즘은 잘 알려져 있지 않지만 ATG4B 활성을 모니터링하는 데 특이적이며 ATG5 녹아웃 세포에서 발생하기 때문에 전체 자가포식에 의존하지 않으며 고전적인 신호 펩타이드 4,18,19를 필요로 하지 않는 비전통적인 메커니즘에 의해 매개됩니다. 우리는 이 리포터를 사용하여 저분자 및 siRNA 라이브러리를 성공적으로 스크리닝했으며 Akt 단백질 키나아제8과 같은 ATG4B 활성의 새로운 조절자를 식별했습니다. 이 논문은 이 루시페라아제 리포터를 반자동, 고처리량 스크리닝 형식으로 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>50 &마이크로; L 일회용 팁 - 비여과, 순수, 중첩 8 스택 (패시브 스택)</td><td>Tecan</td><td>30038609</td><td>일회용 96 팁 랙</td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo</td><td>BioTek 벌크</td><td></td><td>디스펜서</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-205904</td><td>기판</td></tr><tr><td>콜럼버스 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>버전 2.9.1</td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Echo 인증 384-Well 폴리프로필렌 마이크로플레이트, 투명, 비멸균</td><td>Beckman Coulter</td><td>001-14555</td><td>384PP 플레이트</td></tr><tr><td>EnVision II</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>발광 플레이트 리더</td></tr><tr><td>익스프레스 픽 라이브러리 (96-웰)-L3600-Z369949-100&micro; L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 384 웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>솔리드 블랙 384웰 플레이트</td></tr><tr><td>Harmony 이미징 소프트웨어</td><td>Perkin Elmer</td><td>버전 5.1</td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL 물</td> <td>용액ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Labcyte Echo 550 시리즈, Echo Cherry Pick 소프트웨어</td><td>Labcyte/Beckman Coulter</td><td></td><td>나노스케일 음향 액체 디스펜서</td></tr>, <tr><td>Milli-Q 물</td><td></td><td></td><td>탈이온수</td></tr><tr><td>Opera Phoenix High-Content 스크리닝 시스템,</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>자동 현미경</td></tr>, <tr><td>파라포름알데히드 용액 4%, PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>Robin Ketteler 박사(베를린 의과대학 인간의학과)에서 획득</td></tr>폴리<tr><td>브레렌 감염 / 형질주입 시약</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>폴리브레네</td></tr><tr><td>퓨로마이신 디하이드로클로라이드, 98%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>J61278.ME</td><td>Puromycin</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 로봇</td><td>Tecan</td><td></td><td>액체 처리 로봇 플랫폼</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA 트랜스펙션 시약 Roche</td><td>Merck</td><td>6366244001</td><td>DNA 트랜스펙션 시약</td></tr></tbody></table>

자가포식 관련 4b 시스테인 펩티다아제 억제제에 대한 세포 기반 약물 스크리닝

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

높은 자가포식 플럭스가 종양 진행 및 암 치료 내성과 관련이 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 개별 자가포식 단백질을 분석하는 것은 이 경로를 표적으로 하는 치료 전략의 전제 조건입니다. 자가포식 프로테아제 ATG4B의 억제는 전체 생존율을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 ATG4B가 암 치료의 잠재적인 약물 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 우리 실험실은 세포에서 ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 선택적 루시페라아제 기반 분석을 개발했습니다. 이 분석을 위해 ATG4B, LC3B의 기질은 해양 요각류 Gaussia princeps(GLUC)의 비밀 루시페라아제로 C-말단에 태그됩니다. 이 리포터는 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)에 연결되어 있어, 세포가 없어졌을 때 세포의 세포질에 보관되어 있다. ATG4B 매개 절단은 비전통적 분비에 의해 GLUC의 방출을 초래하며, 세포 ATG4B 활성의 상관 관계로서 세포 배양에서 상층액을 수확하여 모니터링할 수 있습니다. 이 논문은 이 루시페라아제 기반 분석법을 자동화된 고처리량 스크리닝에 적용하는 방법을 제시합니다. 세포 ATG4B 활성의 모범적인 고처리량 분석을 위한 워크플로우 및 최적화에 대해 설명합니다.

이전 간행물8에서 이 분석을 사용하여 저분자 및 siRNA 라이브러리를 스크리닝하고 ATG4B의 새로운 조절자를 식별하는 데 성공했습니다. 여기에서는 이 루시페라아제 리포터의 프로토콜과 대표 결과를 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 설명합니다. 그림 8은 세포핵과 발광에 대한 원시 데이터 분석의 예를 보여줍니다. 발광 측정의 일반적인 결과는 그림 8A에 나와 있습니다. DMSO의 기저 발광 신호는 컬럼 1에서 볼 수 있으며, 컬럼 24에서 ATG4B 억제제 FMK9A의 10μM이 있는 경우 볼 수 있습니다. 동일한 플레이트의 핵 수 결과는 그림 8B에서 볼 수 있습니다. 각 화합물에 대한 원시 값을 중성 대조군 평균값으로 정규화하여 ATG4B 활성 및 세포 생존율의 백분율을 얻었습니다(그림 ...

여기에서는 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 루시페라아제 기반 리포터 분석을 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

자가포식 관련 4B 시스테인 펩티다아제 억제제에 대한 세포 기반 약물 스크리닝

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

제 연구실의 주요 연구 목표는 자가포식, 특히 ATG4 시스테인 프로테안의 조절을 이해하고 이 지식을 사용하여 특히 췌장암과 같은 질병에 대해 이 경로를 표적으로 하는 저분자 억제제를 개발하는 것입니다. 당사는 약물 표적과 약물 후보를 식별하기 위해 고함량, 고처리량 스크리닝 기술을 사용하며, ATG4 시스테인 프로테아제 계열은 다양한 형태의 암에 매우 적합한 약물 표적이라고 생각하기 때문에 집중합니다. 우리는 꽤 오랫동안 ATG4 가족 구성원을 연구해 왔습니다.우리는 이 단백질 계열과 세포의 기능 장애에 대한 중요한 발견을 했습니다. 우리는 또한 ATG4 계열 구성원의 조절에 대한 새로운 번역 후 메커니즘을 확인했으며 현재 암 및 신경 퇴행과 같은 질병에 대한 ATG4 계열의 저분자 억제제 및 활성화제를 개발하고 있습니다. 세포에서 ATG4 단백질 분해 효소 활성을 모니터링하기 위한 분석법은 많지 않습니다.그래서 우리는 이 활동을 모니터링하기 위해 루시페라아제 기반 분석을 개발한 최초의 회사 중 하나였습니다. 그리고 우리의 분석은 분비된 문구를 사용하기 때문에 매우 특이하므로 세포에 라이선스를 부여할 필요가 없으며 이 프로토콜을 고처리량 스크리닝 방법 및 실험실 자동화에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리는 꽤 오랫동안 ATG4 B 단백질 프로테아제에 집중해 왔습니다.ATG4 계열 구성원의 knockout 세포주를 생성했습니다. 우리는 ATG4의 새로운 번역 후 조절 메커니즘을 확인했으며, 궁극적으로 ATG4 B 프로테아제를 억제하고 활성화할 수 있는 몇 가지 새로운 저분자 화합물도 확인했습니다. 앞으로도 ATG4 제품군에 대한 작업을 계속하고 싶습니다.우리는 그것이 현재 알려지지 않은 많은 부분이며 여전히 밝혀지지 않은 부분이라고 생각합니다. 예를 들어, 이러한 단백질이 뉴런의 자가포식을 조절하는 방법은 현재 완전히 이해되지 않았습니다. 우리는 또한 우리가 확인한 이러한 저분자 화합물의 검증에 대한 작업에 집중하고 잠재적으로 신경 퇴행성 질환에 활성제를 사용하고 싶습니다.

cell-based-drug-screening-for-inhibitors-autophagy-related-4b

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

병원균의 확산을 대응하기 위해 숙주 세포는 박테리아를 구획하고 자식 작용을 유도하는 자신의 세포 골격을 재구성. 조직 배양 세포, 호스트와이 프로세스를 기본 병원체 결정의 사용 이질균 감염 식별 특징으로한다. 시겔 감염 제브라 피쉬 모델을 사용하여, 분자 발견 및 메커니즘의 역할은 생체에 조사된다.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다.<br...

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

여기 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 측정 하기 위한 간단 하 고 잘 검증 된 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 전체 셀룰러 LDH 수준에 비해 sedimentable 셀 분수에 젖 산 효소 (LDH)의 비율을 측정에 기반.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

본 연구에서, 우리는 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입-1(HSV-1)-감염된 단핵구 유래 수지상 세포에서 자가파전 유속을 방해하는 억제제 및 siRNA 기반 전략을 제시한다.

siRNA 전기 포진 포진 심플렉스 바이러스 유형 1-감염 단핵구 파생 수지상 세포에서 자가 포식을 조절

이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.

LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가

배우세요 ATG4 시스테인 프로테아제 활성을 루시퍼레이스 기반 세포 분석법으로 모니터링하여 고처리량 스크리닝을 수행하는 방법입니다. 이 기술은 암 및 신경퇴행성 질환 치료를 위한 소분자 저해제 발굴에 활용됩니다.

자가포식 관련 4B 시스테인 펩티다아제 억제제에 대한 세포 기반 약물 스크리닝

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