Name: 광 자극 그리드를 사용한 광유전 단백질의 세포 분포 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 배우세요 광유전학 도구 bPAC-nanoluciferase를 이용한 살아있는 세포의 cAMP 신호 전달 공간적 조절 방법. 이 기술은 특정 세포 영역을 정밀하게 자극하여 주변 단백질에 미치는 영향을 최소화하며, 광학 자극 그리드 시스템을 통해 세포 내 분포를 체계적으로 매핑합니다.

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자금은 미국 국립보건원(NIH)의 R01 GM099775 및 D.L.A.에 대한 GM130612 보조금으로 제공되었습니다.

1. HC-1 세포 배양 및 이미징 준비
<ol>
	<li>10% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(100IU/L), 스트렙토마이신(100mg/L) 및 L-글루타민이 보충된 DMEM에서 HC-1 세포를 유지하고 10cm 접시에 담고 95% 가습 공기에서 37°C, 5% CO2에서 배양합니다.</li>
	<li>세포가 1:5 또는 1:10 희석액을 사용하여 ~90% 융합되면 2-4일마다 세포를 계대</li>배양합니다.
	<li>실험 2일 전에 유리 커버슬립에 형질 주입을 위한 종자 세포.
	<ol>
		<li>예열된 배지와 PBS가 있는 조직 배양 후드에서 멸균 상태로 작업하고, 거의 합류하는 세포 접시에서 배지를 흡인하고 5mL의 PBS로 부드럽게 세척합니다.</li>
		<li>PBS를 흡인하고 트립신 1mL를 추가합니다. 세포가 분리될 때까지 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.</li>
		<li>4mL의 배지에 세포를 재현탁하고 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>혈구계를 사용하여 세포 수를 세고 세포 밀도를 계산합니다.</li>
		<li>세포를 1.5 x 104 cells/mL의 밀도로 희석합니다.</li>
		<li>6웰 접시에 폴리-D-라이신 코팅이 된 25mm 유리 커버슬립에 세포 현탁액 2mL를 피펫팅합니다.</li>
		<li>70% 합류할 때까지 인큐베이터에서 약 24시간 동안 세포를 배양합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3μL의 트랜스펙션 시약과 페놀 레드가 없는 Opti-MEM 배지에 희석된 2μL의 P3000 시약당 0.25μg의 NLS-bPAC-nLuc DNA/0.75μg의 NLS-H208 DNA의 비율을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 transfection 키트를 사용하여 세포를 transfection합니다.</li>
	검출 <li>가능한 수준의 cAMP. 를 생성하는 데 필수적인 충분한 bPAC-nLuc 발현을 허용하기 위해 세포를 인큐베이터에 ~48시간 동안 배치합니다.
	참고: bPAC-nLuc 발현의 최소 요구 수준은 자극 시스템의 효능과 자극의 매개변수에 따라 달라집니다.</li>
	<li>이미징을 위해 커버슬립에 세포를 준비합니다.
	<ol>
		<li>하나의 웰에서 배지를 흡입하고 PBS 2mL로 두 번 세척합니다.</li>
		<li>한 쌍의 집게를 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 들어 올려 이미징 챔버에 놓습니다.</li>
		<li>페놀 레드가 없는 Opti-MEM 1mL를 이미징 챔버에 추가합니다. 세포는 HBSS 또는 기타 생리학적 형광 호환 용액에서도 이미징할 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 광 시뮬레이션 및 라이브 셀 이미징
<ol>
	<li>어두운 환경에서 NLS-bPAC-nLuc를 발현하는 세포의 세포 배양 및 조작을 수행합니다. <500nm 파장에 대한 노출을 피하려면 13W 황색 소형 형광 전구(Table of Materials)와 함께 적색 safelight 램프(Table of Materials)를 사용하십시오.</li>
	<li>6라인 멀티 LED 조명 엔진(재료 테이블), 방출 필터 휠(재료 테이블), XY 스테이지(테이블 테이블), ORCA-Fusion 디지털 CMOS 카메라(테이블 테이블) 및 100x/1.4 NA 오일 대물렌즈(∞/0.17/FN26.5)가 장착된 전동 2층 현미경(테이블 )에서 실험을 수행합니다. 디지털 현미경 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 이 설정은 ZT458rdc 이색성 필터(Table of Materials)와 함께 제공되는 독립적인 광 경로를 사용하여 세포를 자극하고 FRET 측정을 동시에 수행할 수 있습니다. 
	참고: 호환 가능한 센서와 함께 동시 광유전학적 자극 및 FRET/집중 이미징을 허용하는 경우 모든 수집 설정을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>UGA - 42 Geosystem을 켭니다. 현미경을 켜고 H208 FRET 센서로 획득할 수 있는 적절한 매개변수로 설정합니다. 획득 구성은 FRET 센서의 발현 수준에 따라 달라집니다. 일반적인 매개변수는 YFP/mScarletI에 대한 40ms 시뮬레이션 시간, 15% LED 전력 및 0.5Hz입니다.</li>
	<li>SysCon 소프트웨어와 현미경을 제어하는 이미징 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>Camera(카메라) 창에서 Calibration(보정) 탭을 선택하고 광유전 단백질과 호환되는 레이저 파장을 선택합니다. bPAC-nLuc를 자극하려면 445nm의 파장을 사용하십시오.</li>
	<li>매번 사용하기 전에 시스템을 보정하십시오. 이는 셋업의 작은 변화나 실온(RT)의 변화만으로도 자극의 정밀도가 변경될 수 있기 때문에 중요합니다.</li>
	<li>카메라 창에서 카메라 탭을 선택하고 <수집 시작>을 클릭하여 상상 소프트웨어에서 수집을 시작합니다.</li>
	<li>Image Viewer 창에서 이미징 소프트웨어에서 가져온 세포의 형광의 실시간 또는 이전 획득을 시각화하여 자극 개체의 위치를 안내합니다.</li>
	<li>클릭 및 발사 모드를 사용하여 실험을 시작하기 전에 개별 세포의 반응성을 빠르게 평가할 수 있습니다.</li>
	<li>시퀀스 관리자 창을 사용하여 <추가>를 선택하여 새 시퀀스를 만듭니다. 
	참고: 적절한 시스템 보정을 확인하려면 이미지 뷰어 창에서 다양한 모양과 크기를 그립니다. 이는 세포에 투사된 자극 패턴과 정확하게 일치해야 하며, 의도한 설계와 정확하게 정렬되어야 합니다.</li>
	<li>Image Viewer 창에서 왼쪽의 도구 모음에 있는 Round 아이콘을 선택하여 원형 자극 객체를 그립니다.</li>
	<li>여러 개의 작고 동일한 원을 만들고 균등하게 분포시켜 자극할 세포의 전체 세포질이 균일하게 분포할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>각각을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 원형 자극 객체의 균질성을 확인합니다. 창이 나타납니다. 이를 사용하여 반경, 위치 등을 검사하십시오.</li>
	<li>사용된 목표와 셀의 크기에 따라 반경을 1에서 5 사이로 설정합니다.</li>
	<li>원의 균일한 간격과 정렬을 지원하려면 보기 하위 창에서 <Snap to Grid> 버튼을 사용합니다. 또한 <그리드 설정> 버튼을 사용하여 그리드의 속성을 설정합니다.</li>
	<li>균일한 간격의 원형 자극 물체의 그리드 또는 매트릭스가 세포를 완전히 덮고 있는지, 그리고 세포의 크기(예: 6 x 6 또는 10 x 10)가 세포의 크기에 따라 결정되는지 확인합니다. 세포 이벤트를 트리거하지 않아야 하는 null 자극에 대한 제어로, 세포 외부에 위치한 일부 원을 포함합니다.</li>
	<li>이미지 뷰어 창에서 만든 각 개체가 타임라인 창에 나타납니다.
	<ol>
		<li>Object Timing 하위 창에서 각 자극 객체의 시간적 속성(시작 시간, 지속 시간, 지연)을 구성합니다.</li>
		<li>Lightsource 하위 창에서 각 개체의 파장과 강도를 구성합니다. 이 프로토콜의 경우 각 개체가 동일한 파장을 사용하고 지속 시간과 강도가 동일한지 확인합니다. 시작 시간은 개체마다 다르며, 다른 자극의 효과가 겹쳐지는 것을 피하기 위해 예상되는 결과에 따라 개체 사이의 지연이 달라질 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>타임라인 창에서 필요한 경우 각 자극 객체가 활성화되는 순서를 변경합니다. 특정 실험에 따라 규칙적인 패턴(예: 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로) 또는 무작위 패턴으로 자극을 구성합니다.</li>
	<li>시퀀스를 시스템에 업로드하고 시스템이 수행할 시퀀스 주기(실행) 수를 구성합니다.</li>
	<li>이미징 소프트웨어의 관심 영역(ROI)을 원하는 위치에 배치합니다.</li>
	<li>현미경으로 형광 이미지를 획득하기 시작하고 UGA-42 창에서 <재생>을 누릅니다.</li>
</ol>
3. 데이터 분석
<ol>
	<li>자극 시스템에서 제공하는 소프트웨어를 사용하면 나중에 사용할 수 있도록 시퀀스를 저장할 수 있지만 실제 실험 정보를 기록하지는 않습니다. 따라서 위치, 강도, 지속 시간, 실행 횟수 등과 같은 매개변수를 포함하여 실험 중에 사용된 자극 지점 및 시퀀스와 관련된 모든 세부 사항을 꼼꼼하게 문서화합니다. 약리학적 제제 또는 특정 용액과 같은 기타 관련 실험 조건을 문서화합니다.</li>
	<li>실험하는 동안 이미징 소프트웨어에 지정된 ROI를 배치하여 전체 세포 또는 세포 내 특정 위치에서 형광 강도 변화를 캡처합니다.</li>
	<li>자극 지점을 기준으로 ROI의 위치에 특히 주의하십시오. 자극된 영역 내부 또는 먼 곳에서 형광 강도의 변화를 측정합니다. 실험 후 ROI의 위치를 조정하여 ROI 강도 값뿐만 아니라 실험 중에 획득한 이미지를 저장할 수 있는 이미징 소프트웨어를 제공합니다.</li>
</ol>

A Light-Stimulation Grid Approach to Study Cellular Optogenetic Protein

<ol><li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li>
<li>Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+activation+of+cAMP+production+through+photostimulation+or+chemical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).</li>
<li>Stierl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+modulation+of+cellular+cAMP+by+a+small+bacterial+photoactivated+adenylyl+cyclase%2C+bPAC%2C+of+the+soil+bacterium+Beggiatoa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endomembrane-based+signaling+by+GPCRs+and+G-proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins.</a> Cells. 11 (3), 528(2022).</li>
<li>Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGroschner%2C+K+%22Store-operated+ca%282%29%2B+entry+%28SOCE%29+pathways%22">Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways</a>. , Springer, Vienna. (2017).</li>
<li>Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+hormone-sensitive+adenylate+cyclase+activity+with+resolved+components+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme.</a> The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).</li>
<li>Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+adrenergic+receptors+and+adenylate+cyclase%3A+products+of+separate+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes.</a> Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).</li>
<li>Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+cyclase-mediated+nuclear+cAMP+synthesis+is+sufficient+for+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).</li>
<li>Keravis, T., Lugnier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+nucleotide+phosphodiesterase+%28PDE%29+isozymes+as+targets+of+the+intracellular+signalling+network%3A+benefits+of+PDE+inhibitors+in+various+diseases+and+perspectives+for+future+therapeutic+developments%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments.</a> British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 연구의 목적은 광유전학적 단백질의 세포내 분포를 정확하게 모니터링하고 특정 세포질 구획 내에서 그 성능을 평가하는 것이었습니다. 우리는 또한 광유전학적 단백질을 발현하는 세포에 대한 포인트 스캐닝 시스템의 정확한 자극 기능을 보여주었습니다. 이를 달성하기 위해 우리는 발현 수준은 높지만 핵에 국한된 분포가 매우 제한된 핵 표적 bPAC-nLuc를 사용했습니다. 결과는 광유전학적 단백질의 세포 분포에 따라 ~1μm만 분리된 자극 지점이 cAMP 생산을 유발할 수 있거나 유발하지 않을 수 있음을 보여주었습니다. 핵에 대한 자극만이 cAMP 수준을 높일 수 있었습니다. 이 프로토콜에서 목표는 국부적인 cAMP 상승을 생성하는 것이 아니라 짧은 빛 자극이 주변 단백질을 자극하지 않고 세포의 매우 제한된 영역에서 광유전학적 단백질을 활성화할 수 있을 만큼 충분히 정확할 수 있음을 보여주는 것이었습니다. 그러나 이 접근법은 확산 분포 및/또는 국소적인 cAMP 상승 생성을 갖는 다른 광유전학적 단백질의 연구에 필요한 제어를 구성합니다. 이는 광유전학적 단백질의 발현 수준, 자극의 강도 및 빈도 등을 변화시켜 달성할 수 있습니다. 이러한 국부적인 신호를 정확하게 측정하려면 획득 매개변수와 센서 특성을 신중하게 고려하는 것이 중요합니다. 여기에는 적절한 ROI 위치 및 크기 선택, 획득 주파수 결정, 최적의 친화력, 강도, 동적 범위 및 해리 상수를 갖춘 FRET/강도 센서 선택이 포함됩니다.
최근에 발표된 논문에서 우리는 유사한 전략을 사용하여 핵 표적 bPAC-nLuc의 분포와 갑상선 유래세포주에서 cAMP 상승을 폐지하기 위한 변형된 포스포디에스테라제(PDE; ΔRI-PDE8)의 능력을 기능적으로 입증했습니다 9. 이 기사에서는 격자 대신 직선을 따라 세포 자극을 수행했으며, 조명 스폿은 체계적인 패턴이 아닌 세포 랜드마크(예: 핵 중심, 핵 가장자리 등)를 기준으로 배치되었습니다. 놀랍게도 핵 가장자리를 향한 자극조차도 검출 가능한 cAMP 반응을 유발하기에는 충분하지 않았습니다. 우리는 이것이 아마도 NLS-bPAC-nLuc9의 불충분한 질량을 자극했기 때문일 것이라고 추론했습니다. 그러나, 본 프로토콜에서, 핵 가장자리 부근으로 향하는 일부 자극은 검출 가능한 cAMP 증가를 유도했다. 이러한 불일치는 bPAC-nLuc의 발현 수준, 자극의 특성, 핵의 형태, 내인성 PDE, 완충 단백질의 존재 등을 포함한 다양한 요인에 기인할 수 있습니다.
다른 표적 또는 비표적 광유전학적 단백질은 더 확산된 분포를 나타낼 수 있지만, 이 체계적인 접근 방식은 실험을 신중하게 설정하고 데이터를 분석하여 의미 있는 결론을 도출하는 데 도움이 됩니다. 또한, 이 접근법은 특수한 세포 구조(예: 라멜리포디아, 수상돌기, 일차 섬모 등)를 표적으로 삼을 수 있게 하여 이러한 구조 및/또는 세포체의 원위 및 근위 영역에서 반응 간의 비교를 용이하게 합니다. 
이 전략은 단백질 키나아제 A(PKA) 또는 cAMP에 의해 직접 활성화되는 교환 단백질(EPAC1)과 같은 cAMP 경로의 다운스트림 요소의 활성화를 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 또한, bPAC-nLuc는 단백질 또는 기타 요인과의 국소적 상호 작용에 의해 영향을 받을 수 있는 내인성 AC와 동일한 조절제에 의해 영향을 받지 않기 때문에 동일한 수준의 발현이 주어지면 동일한 양의 cAMP를 일관되게 생성하는 것으로 가정할 수 있습니다. 일시적인 상승 후 cAMP 상승의 감소 또는 cAMP 수준의 감소를 조사함으로써 이 접근법을 통해 cAMP 분해, 확산 또는 내인성 또는 형질감염된 PDE의 기능 및 분포를 평가할 수 있습니다. 이 전략은 다양한 세포 위치에서 광유전학적 단백질의 거동을 평가하는 데 특히 유용하며, 세포질 내에 자극 지점을 임의로 배치하는 편향을 피하는 데 도움이 됩니다.
자극 지점의 크기와 에너지는 궁극적으로 사용된 설정의 특정 특성(광 경로, 대물렌즈, 스캐닝 시스템 등)에 따라 달라진다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 정확한 결과를 보장하려면 각 특정 시스템에서 각 실험을 수행할 때 광유전학적 단백질의 상대적 발현, 사용된 파장에 대한 세포의 민감도 및 기타 매개변수를 고려해야 합니다. 더 작은 세포 구조를 더 정밀하게 체계적으로 평가하기 위해 더 작은 자극 지점 및/또는 더 조밀한 그리드(즉, 더 작은 간격의 자극 지점)를 구현하는 데 있어 시스템을 구동할 수 있는 전체 범위를 연구하지 않았다는 점에 유의하는 것도 중요합니다. 또한 UGA-42 Geo 포인트 스캐닝 시스템만을 사용하여 이 전략을 테스트했습니다. 이 접근 방식은 균일한 간격의 국부적인 지점을 재현 가능하게 생성할 수 있는 경우 다양한 시스템을 사용하여 가능할 수 있습니다. 유사한 결과를 얻으려면 각 시스템을 최적화해야 합니다.
마지막으로, 자극 시스템에 의한 FRET 센서의 잠재적 자극을 신중하게 평가해야 합니다. 예를 들어, 청록색 형광 단백질(CFP)은 이 프로토콜에 사용되는 445nm 레이저에 의해 확실히 자극되거나 심지어 표백될 것입니다. 더 높은 레이저 효능(또는 더 높은 투과율 중성 밀도(ND) 필터)을 사용하면 형광 센서를 자극하고 실험에 잘못된 정보가 도입되거나 데이터 분석에 문제가 발생할 가능성이 높아집니다. FRET/강도 측정 센서의 정상적인 광표백도 신중하게 평가해야 합니다. 마지막으로, bPAC는 주변광에 민감하고 어두운 조건에서도 cAMP를 생성할 수 있기 때문에(bPAC의 암흑 활성은 단백질3의 33 ± 5 pmol/min/mg으로 측정됨) 빛 오염을 피하기 위해 bPAC-nLUC를 형질감염한 후 세포를 조심스럽게 조작해야 합니다(예: 인큐베이터에서, 실험 전 및/또는 실험 중 등). 선택적으로, 세포는 PDE 억제제 (예를 들어, 3-이소부틸-1-메틸크산틴; IBMX10)을 사용하여 bPAC-nLuc의 기본 활성을 결정하고 사용된 조명 조건이 적절하게 어둡지 확인합니다.

신경과학에 혁명을 일으킨 도구로 탄생한 광유전학은 이제 전 세계 많은 실험실과 생물학의 다양한 연구 분야에서 일상적으로 사용되는 성장하는 연구 분야이자 떠오르는 기술입니다. Beggiatoa sp.(박테리아 광활성 아데닐릴 시클라제, bPAC)의 빛에 민감한 아데닐릴 시클라아제(AC)를 나노루시퍼라제(nLuc)1,2,3에 융합하여 다재다능한 광유전 단백질인 bPAC-nLuc를 개발했습니다. 청색광으로 자극되면 bPAC은 두 번째 메신저 3',5'-고리형 아데노신 일인산염(cAMP)을 생성합니다. nLuc는 최근에 개발된 작은 루시페라아제로, 기질 중 하나가 있는 상태에서 생물 발광을 생성하고 cAMP 생산을 활성화할 수 있습니다4. 따라서 이 광유전 단백질은 짧은 광 펄스를 사용하여 일시적으로 활성화하거나 Furimazine 또는 기타 루시페라제 기질을 통해 꾸준히 활성화될 수 있으므로 다양한 cAMP 신호 패턴을 모방하고 세포 반응(전사 인자 활성화, 유전자 발현, 세포 증식, 이동 등)을 평가할 수 있습니다. 최근 2차 메신저 신호전달의 발전은 매우 제한된 세포질 영역(예: cAMP 반응 CREB(element-binding protein) 인산화를 위한 엔도솜 cAMP 생산 또는 핵으로의 NFAT(nuclear factor of activated T-cells) 전좌를 위한 Ca2+ 마이크로도메인)에서 발생하는 이벤트의 중요성을 강조했습니다5,6. 따라서 살아있는 세포에서 이러한 구획의 신호를 평가, 모방 및 차단하기 위한 일관되고 체계적인 전략을 개발하는 것이 중요합니다. bPAC-nLuc가 다른 세포 구획에서 특이적으로 활성화되는 능력을 보여주기 위해 간종 유래 세포주(HC-1)를 핵 표적 bPAC-nLuc 및 H208, Förster 공명 에너지 전달(FRET) cAMP 센서(NLS-bPAC-nLuc)와 함께 형질 주입했습니다. NLS-H208)을 참조하십시오. HTC 라인에서 파생된 HC-1 세포는 분석 가능한 AC 활성이 없어 기초 cAMP 수준이 매우 낮으므로 FRET 센서의 전체 동적 범위를 활용하면서 추정 cAMP 생성을 측정하는 데 이상적입니다7,8. 포인트 스캐닝 시스템(UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic)에 연결된 고체 레이저(445nm, LDI-7, 89 North)를 사용하여 개별 세포 내의 매우 작은 원형 영역 또는 반점(~1μm2)을 체계적으로 자극하는 프로토콜을 설명합니다. 포인트 스캐닝 시스템은 2층 현미경의 백포트 중 하나에 연결되어 독립적인 광 경로를 통해 세포를 자극하고 FRET 측정을 동시에 수행할 수 있었습니다. 우리는 Rapp OptoElectronic의 자극 시스템과 함께 제공되는 SysCon Geo 소프트웨어를 사용하여 세포의 세포질을 포괄적으로 스캔하는 이 프로토콜의 방법을 제시합니다. 이 접근 방식에는 그리드 패턴(그림 1)에서 세포를 자극하는 일련의 조명을 설정하여 cAMP 응답 맵을 생성하는 것이 포함됩니다.

<table><tbody><tr><td>13 W 앰버 컴팩트 형광 전구 - 로우 블루 라이트</td><td>포토닉 개발&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX)</td><td>시그마</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>6-라인 멀티 LED 루멘코 스펙트라 X</td><td>루멘코&nbsp;</td><td></td><td>6라인 멀티 LED 조명 엔진&nbsp;</td></tr><tr><td>코닝 - DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>MT10013CMEA</td><td></td></tr><tr><td>Corning - 일반 태아 소 세럼</td><td>Thermo Fischer</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경: 원형</td><td>Thermo Fischer</td><td>12545102P</td><td></td></tr><tr><td>GBX-2 진한 빨간색 safelight 필터 5.5"&nbsp;</td><td>Kodak</td><td>1416827</td><td>레드 세이프라이트 램프&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Hanks의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) 10x</td><td>Thermo Fischer</td><td>14185052</td><td>1x로 희석, pH</td></tr><tr><td>조정 LDI-7</td><td>89 North</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fischer</td><td>BW17605E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>L3000001</td><td>트랜스펙션 키트&nbsp;</td></tr><tr><td>올림푸스 IX83 전동&nbsp; 2층 서랍&nbsp; 현미경&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>전동 2층 현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM, 페놀 레드</td><td>없음 Thermo Fischer</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-fusion 디지털 CMOS 카메라&nbsp;</td><td>하마마츠</td><td>C14440-20UP</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액(1x)</td><td>Lonza</td><td>17516F</td><td></td></tr><tr><td>Prior emission 필터 휠 및 필터 세트</td><td>Prior Scientific, Inc.</td><td></td><td>방출 필터 휠&nbsp;</td></tr><tr><td>이전&nbsp; 프로스캔 XY 스테이지</td><td>Prior Scientific, Inc.</td><td></td><td>XY 스테이지&nbsp;</td></tr><tr><td>슬라이드북 6</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>디지털 현미경 소프트웨어</td></tr><tr><td>SysCon 소프트웨어</td><td>SysCon 소프트웨어</td><td></td><td>자극 시스템이 제공하는 소프트웨어&nbsp;</td></tr><tr><td>우가-42&nbsp; 지리&nbsp;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPlanSApo 100x</td><td>Olympus</td><td></td><td>100x/1.4 NA 오일 목표물 (&infin;/0.17/FN26.5)</td></tr><tr><td>ZT458rdc 이색성&nbsp;</td><td>Chroma Technology Corp</td><td></td><td>BS, 파장 (CWL):&nbsp; 498 nm의</td></tr></tbody></table>

광 자극 그리드를 사용한 광유전 단백질의 세포 분포 매핑

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid

우리의 목표는 광유전 단백질의 세포 분포를 정확하게 추적하고 특정 세포질 위치 내에서 그 기능을 평가하는 것이었습니다. 이를 위해 핵 표적 cAMP 센서와 실험실에서 개발한 광유전 단백질인 박테리아 광활성성 아데닐릴 시클라아제-나노루시퍼라제(bPAC-nLuc)와 세포를 동시 transfection했습니다. bPAC-nLuc는 445nm 광 또는 루시페라제 기판으로 자극될 때 아데노신 3',5'-고리형 일인산염(cAMP)을 생성합니다. 우리는 HC-1 세포의 세포질 전체에 걸쳐 작은 조명 반점(~1μm2)의 그리드/매트릭스 패턴을 생성할 수 있는 포인트 스캐닝 시스템에 연결된 고체 레이저 조명기를 사용했습니다. 이를 통해 핵 표적 bPAC-nLuc의 분포를 효과적으로 추적하고 포괄적인 cAMP 대응 맵을 생성할 수 있었습니다. 이 지도는 bPAC-nLuc의 세포 분포를 정확하게 나타내었으며, 광 자극에 대한 반응은 조명된 점의 단백질 양에 따라 달랐습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 세포 광유전 단백질을 조사하는 데 사용할 수 있는 기술 툴킷을 확장하는 데 기여합니다. 높은 정밀도로 분포와 반응을 매핑할 수 있는 능력은 광범위한 잠재력을 가지고 있으며 다양한 연구 분야를 발전시킬 수 있습니다.

그림 1에 제시된 결과는 세포핵을 향한 자극만이 측정 가능한 cAMP 상승을 유도할 수 있었음을 보여줍니다. 이는 NLS-bPAC-nLuc이 HC-1 세포의 핵 구획에서만 독점적으로 발현된다는 것을 확인시켜 줍니다. 이러한 그리드/매트릭스 패턴을 사용하여 광유전학 단백질을 정밀하게 자극함으로써 세포 내 분포를 매핑할 수 있습니다. 또한, 핵 중심부에서 더 높은 cAMP 상승이 나타나는 것은 핵 주변부에 배치된 스폿에 비해 중심부 스폿에 의해 시뮬레이션된 bPAC-nLuc의 질량이 더 높기 때문입니다(그림 1).
<img alt="YFP H208 현미경 결과, 445 nm 광자극, 일시적 신호 그래프, 광학 분광법." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65471/65471fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="그림 1"> 
그림 1: 그리드 자극 프로토콜 및 cAMP 응답 맵. NLS-H208(cAMP 센서) 및 NLS-bPAC-nLuc가 형질전환된 HC-1 세포에 대한 순차적 청색광 자극(445 nm; 펄스 간 간격 30 s; 펄스 트레인: 50 ms, 총 지속 시간 500 ms, 10 Hz, 레이저 출력 7%). 왼쪽 패널은 H208에서 유래한 황색 형광 단백질(YFP) 형광을 보여주며, 이는 sCMOS 카메라로 캡처한 실제 광펄스가 단일 이미지로 중첩되어 나타나 있다. 오른쪽의 트레이스는 각 자극 지점에서의 NLS-bPAC-nLuc 자극으로 인해 유발된 일시적인 cAMP 증가를 보여준다. 배경을 감산한 NLS-H208 형광은 핵 전체를 덮는 단일 ROI를 사용하여 측정되었으며, 정규화된 비율(R/R0)을 계산하였다. 외곽 영역(1행 및 7행, A열 및 G열)의 응답은 음수이므로 표시하지 않았다. 막대 = 3 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65471/65471fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 cAMP 센서와 광유전 단백질인 bPAC-nLuc를 transfection하여 세포 분포와 광 자극에 대한 반응을 정확하게 추적합니다. 포인트 스캐닝 시스템을 사용하여 cAMP 응답 맵을 만드는 혁신적인 접근 방식은 다양한 분야에서 광유전 단백질에 대한 연구를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

Our goal was to accurately track the cellular distribution of an optogenetic protein and evaluate its functionality within a specific cytoplasmic ...

mapping-cellular-distribution-an-optogenetic-protein-using-light

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

본 논문은 제한된 억제 뉴런의 인구에 GFP를 표현 형질 전환 생쥐에서 전체 셀 녹음과 photostimulation를 검색 레이저를 결합 방법을 소개합니다. 이 기술은 특정 억제 대뇌 피질의 뉴런의 지역 신경 회로의 광범위한 매핑 및 정량 분석​​ 할 수 있습니다.

레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

ChR2을 표현 성인에서 태어난 뉴런은 후각 신경 회로의 기능들에 대한 그들의 기여를 검토하기 위해 슬라이스 electrophysiological 준비로 조작할 수 있습니다.

뉴런의 사진 자극에 저렴한 LED 배열을 사용하여

후각 망울의 성인에서 태어난 뉴런은 optogenetically Channelrhodopsin2 - 표현 이식 미니어처와 함께 주동이의 철새 스트림과 만성 photostimulation에서 lentiviral 주사를 LED를 사용하여 조절할 수 있습니다.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.

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Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

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광 자극 그리드를 사용한 광유전 단백질의 세포 분포 매핑

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