Name: 인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 배우세요 블레오마신 처리된 인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1 포커를 동시 검출하여 DNA 이중 가닥 절단의 형성과 복구를 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 유전체 손상 정량화에 유용합니다.

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혈액 샘플을 채취 한 전혈 기증자와 모든 의료진에게 감사드립니다.

이 연구는 피사 대학교 윤리위원회의 승인을 받았으며 각 기증자로부터 정보에 입각하고 서명 된 동의를 얻었습니다.
1. γH2AX 및 53BP1 병소의 형성
<ol><li>시료 준비 및 돌연변이 유발 처리<ol><li>항응고제로 리튬 헤파린이 포함된 혈액 수집(예: Vacutainer) 튜브에서 건강한 성인 개인의 정맥 천자에 의한 전혈 샘플을 수집합니다.</li>
		<li>적절한 혈액 샘플 보존을 보장하려면 샘플링 후 24시간 이내에 절차를 시작하십시오.</li>
		<li>300μL의 샘플을 4.7mL의 완전 배지(0.5% 페니실린-스트렙토마이신, 0.75% 식물성 헤마글루티닌, 이전에 비활성화된 10% FBS, 88.75% RPMI 1640)가 들어 있는 튜브에 추가합니다.</li>
		<li>그런 다음 블레오마이신 설페이트를 최종 농도 5μg/mL에 추가합니다. 주의: 블레오마이신 설페이트는 돌연변이 유발 물질입니다. 피부 접촉 및 흡입을 피하십시오. 용액을 준비하고 후드 아래에 샘플을 추가하십시오.</li>
		<li>각 샘플에 대해 음성 대조군(돌연변이원 없음)을 설정합니다.</li>
		<li>튜브를 37°C의 온도 조절기에 2시간 동안 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>고정<ol><li>실온에서 5분 동안 540 x g 의 원심분리기 샘플.</li>
		<li>상층액을 흡인하고 소용돌이로 펠릿을 다시 현탁하십시오.</li>
		<li>5mL의 저삼투압 용액(500mL의 탈이온수에 용해된 2.87g의 KCl)과 400μL의 사전 고정 용액(5:3 아세트산: 메탄올)을 추가하여 적혈구의 용혈을 유발합니다.</li>
		<li>실온에서 5분 동안 540 x g 의 원심분리기 샘플.</li>
		<li>상청액을 흡인하고 펠렛을 실온에서 메탄올 5mL에 최소 30분 동안 재현탁하여 세포를 고정합니다.</li>
		<li>대안적으로, 사용할 때까지 세포를 -20°C에서 보관한다.</li>
	</ol></li>
	<li>슬라이드 준비<ol><li>실온에서 5분 동안 540 x g 의 원심분리기 샘플.</li>
		<li>상층액을 흡인하고 펠릿을 3:1 메탄올:아세트산 용액 5mL에 재현탁합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.</li>
		<li>마지막에, 용액을 실온에서 5분 동안 540 x g 에서 다시 원심분리한다.</li>
		<li>펠릿을 재현탁하기에 충분한 용액(0.5mL)을 남기고 상청액을 다시 흡인하고, 격렬하게 피펫팅하고, 재현탁된 세포 펠릿을 슬라이드에 떨어뜨리고, 자연 건조합니다. 슬라이드를 4°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>면역형광 참고: 면역형광법은 표적 자체에 결합하는 1차 항체와 표적에 국소화할 수 있는 1차 결합하는 형광 2차 항체를 사용하여 특정 세포 표적을 식별하는 면역학적 방법입니다11. 이 경우 마우스 단클론 항-53BP1(1:50)과 토끼 다클론 항-γH2AX(1:50)를 1차 항체로 사용하고 AlexaFluor568 항-마우스(1:400) 및 DyLight488 항-토끼(1:200)를 각각 2차 항체로 사용합니다.<ol><li>슬라이드를 커플플린 병에서 5분 동안 1x PBS 50mL로 두 번 세척합니다(연속 16개의 슬라이드).</li>
		<li>그런 다음 블로킹 용액(FBS 10mL, 10x PBS 10mL, 탈이온수 80mL, Triton-X 300μL)에 30분 동안 보관합니다.</li>
		<li>블로킹 용액에 용해된 1차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각의 10 μL를 각 슬라이드에 첨가한다. 슬라이드를 파라핀 테이프로 덮고 4°C에서 밤새 배양합니다.</li>
		<li>배양 후 1x PBS에서 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.</li>
		<li>블로킹 용액에 용해된 2차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각의 10 μL를 각 슬라이드에 첨가한다. 슬라이드를 파라핀 테이프로 덮고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>1x PBS에서 5분 동안 3회 세척을 수행합니다.</li>
		<li>핵을 반대 염색하기 위해 조립 전에 커버슬립에 DAPI가 포함된 페이드 방지 용액 2.5μL를 추가합니다. 참고: 초점 동역학을 평가하기 위해 절차는 1.1에서 1.4까지 설명된 것과 동일하며, 세포 수확 및 이중 면역형광은 블레오마이신 처리 후 0시간, 2시간 후, 그리고 돌연변이원을 제거한 후, 처리 후 4시간, 6시간 및 24시간.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 형광현미경을 통한 분석
참고: "형광 현미경"은 형광을 사용하여 이미지를 생성하는 모든 현미경을 의미합니다. 시편은 형광단에 흡수되는 특정 파장(또는 파장)의 빛으로 조명되어 더 긴 파장의 빛을 방출하게 한다12. AlexaFluor568 및 DyLight 488은 각각 약 568 및 488 nm의 빛을 흡수하고 603 및 520 nm의 빛을 방출합니다. 따라서 각각 TRITC 또는 FITC 필터를 사용하여 적색 또는 녹색 형광으로 볼 수 있습니다.
<ol><li>100x 몰입 대물렌즈에서 각 슬라이드의 초점의 존재 여부를 점수화합니다(그림 1).</li>
	<li>슬라이드당 200개의 핵을 채점하고 각 핵의 γH2AX/53BP1 병소 수를 계산합니다.</li>
	<li>점수가 매겨진 총 핵당 평균 병소 수로 결과를 표현합니다. 여기에는 γH2AX/53BP1 양성(적어도 하나의 형광 신호를 나타냄) 및 음성(형광 신호를 나타내지 않음) 핵이 모두 포함됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853(2020).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%2C+Thematic+Minireview%22%5BJournal%5D)">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li>
<li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li>
<li>Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection%3A+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li>
<li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy+of+%CE%B3H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).</li>
<li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability%3A+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+%CE%B3H2AX%2F53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+%28%CE%B3-H2AX%29+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB%2C+bleomycin+and+mitomycin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li>
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<li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li>
<li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li>
</ol>

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γH2AX 및 53BP1 병소의 면역형광 분석은 세포 시스템의 간기 핵에서 게놈 손상을 평가하는 데 적합한 방법입니다. 이 절차에는 실험 결과, 주로 고정 및 투과에 사용되는 제제, 항체 유형 및 희석 인자, 돌연변이 유발 물질의 농도에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 중요한 사항이 있습니다.
면역형광법은 주로 단백질인 항원을 식별할 것으로 예상하기 때문에 단백질 무결성의 유지는 기본입니다. 이 프로토콜에서 메탄올은 림프구를 고정하는 데 사용됩니다. 이 단계는 알코올이 물을 대체하고 가용성 단백질의 침전을 유발하여 작용하는 반면, 고정되지 않은 다른 세포 성분은 PBS13과 같은 식염수 완충 용액에서 세척하여 제거할 수 있기 때문에 특히 중요합니다. 
또 다른 주요 통로는 차단 용액을 통해 수행되는 투과화이며, 이 경우 투과화와 차단을 모두 허용합니다. 블로킹은 FBS를 용액에 첨가하여 수...

DNA 손상은 세포 산화 대사에 의해 생성된 ROS와 같은 내인성일 수 있는 작용제에 의해 연속적으로 유도되거나, 또는 외인성, 화학적 및 물리적둘 다1. 가장 해로운 병변 중 이중 가닥 절단(DSB)은 염색체 이상을 일으켜 발암 과정을 시작할 수 있기 때문에 게놈 불안정성에 기여하는 근본적인 역할을 합니다. 따라서, 세포는 DSBs를 복구하는 복잡하고 효율적인 메카니즘을 제공받는다2.
DSB가 발생하면 세포는 MRE11/RAD50/NBS1 복합체와 함께 ATM 또는 ATR 키나아제를 모집하여 세포 주기를 늦추거나 멈추게 하는 다른 단백질을 활성화하는 DNA 손상 반응(DDR)을 유발합니다3. 이러한 키나아제의 필수 표적은 히스톤 H2AX이며, 이는 DSB(즉, γH2AX)로부터 몇 메가베이스 내에서 Ser-139에 인산화되어 BRCA1 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)3. 나중에, 상동 재조합 (HR), 비-상동 말단 접합 (NHEJ), 또는 단일-가닥 어닐링 (SSA) 중 하나의 경로가 DSB를 복구하기 위해 트리거된다 4,5. 따라서 53BP1은 HR 또는 NHEJ 중 하나를 선택하는 데 관여하며 주로 HR6보다는 NHEJ의 활성화를 촉진합니다. 또한, H2AX 히스톤과 53BP1의 인산화 된 형태는 모두 DSB 부위에서 병소를 형성 할 수 있습니다. 이들 병소는 이중 가닥의 완전성이 회복될 때까지 지속되므로, 시간 간격 내에 γH2AX 또는 53BP1 병소의 출현/소실을 평가하는 것은 셀 시스템에서 DSB의 발생 및 복구를 평가하는 유용한 방법으로 간주된다 6,7. 그러나, 상기 기술된 분자 과정에 따르면, γH2AX 및 53BP1 초점은 DDR8,9 동안 DSB 근처에서 공동 국소화될 것으로 예상되기 때문에, 이중 면역형광에서 이들 마커의 존재를 동시에 검출하는 것이 유용할 수 있다.
따라서, 이 원고의 목적은 방사성 모방제 블레오마이신에 의해 인간 말초 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하기 위해 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 정량화의 적합성을 평가하는 것이었습니다. 동일한 방법론을 사용하여 이전에 설정된 실험 절차10에 따라 블레오마이신 유도 DSB의 복구 역학을 설명하려고 시도했습니다.

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor 568 염소 안티 마우스 IgG(&감마; 1)</td><td>Invitrogen</td><td>A21124</td><td>53BP1 2차 항체</td></tr><tr><td>Bleoprim</td><td>Sanofi</td><td></td><td>bleomycin sulfate (mutagen)</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin solution, 100X</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td>antibiotics for culture</td></tr><tr><td>medium PBS 10X</td><td>Termofisher</td><td>14200075</td><td>Phosphate-buffered Saline</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Euroclone</td><td>EC20180L</td><td>Fetal Bovine Serum 면역형광용</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated</td><td>Termofisher</td><td>#35552</td><td>&gamma; H2AX 2차 항체</td></tr><tr><td>마우스 anti-53BP1 단클론 항체</td><td>Merck</td><td>MAB 3802</td><td>53BP1 1차 항체</td></tr><tr><td>Labophot 2</td><td>Nikon</td><td></td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>P-histone H2AX (Ser139) 토끼 항체</td><td>세포 신호</td>#<td>2577</td><td>&gamma; H2AX 일차 항체</td></tr><tr><td>Phytohemoagglutinin</td><td>Termofisher</td><td>R30852801</td><td>배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr>DAPI <td>Cell Signaling</td>으로<td>금 퇴색 방지 시약 Prolong gold Antifade reagent for</td><td>counterstaining</td><td></td></tr> <tr><td>RPMI 1640</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Nonionic detergent for DAPI Cell Signaling#8961 Antifade solution with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI 투과화</td></tr></tbody></table>

인간 말초 림프구에서 γh2ax 및 53bp1의 이중 면역형광

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

이중 가닥 절단(DSB)은 세포핵에서 발생할 수 있는 가장 심각한 병변 중 하나이며, 복구하지 않으면 암을 포함한 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 세포에는 DSB를 복구하는 복잡한 메커니즘이 제공되며 이러한 경로는 Ser-139(즉, γH2AX) 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)에서 인산화된 형태의 히스톤 H2AX를 포함합니다. 두 단백질 모두 DSB 부위에서 병소를 형성할 수 있기 때문에 이러한 마커의 식별은 DSB와 복구 동역학을 모두 연구하는 데 적합한 방법으로 간주됩니다. γH2AX 및 53BP1 병소의 형성으로 이어지는 분자 과정에 따르면, 두 개의 DNA 손상 마커를 동시에 검출하여 DSB를 정량화할 수 있는 대체 접근법을 설정하기 위해 DSB 근처의 공동 국소화를 조사하는 것이 더 유용할 수 있습니다. 따라서, 이 프로토콜은 이중 면역형광에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 존재를 통해 방사성 모방제 블레오마이신에 의해 인간 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하는 것을 목표로 한다. 이 방법론을 사용하여 우리는 또한 블레오마이신 유도 DSB의 복구 역학을 연구하기 위한 예비 시도로 시간 경과에 따른 γH2AX 및 53BP1 병소 수의 변화를 설명했습니다.

말초 림프구의 형광 현미경 분석으로 얻은 데이터를 통해 우리는 세 가지 주요 측면을 평가할 수 있습니다: 돌연변이 유발 효과로 인해 γH2AX 및 53BP1 병소(따라서 DSB)의 수를 증가시키는 블레오마이신 치료의 효과, 두 병소가 DSB 부위에 공동 국한되는 정도, 블레오마이신 유도 DSB의 복구 동역학을 설명하기 위한 γH2AX 및 53BP1 병소의 시간 경과. 예상한 바와 같이, 처리되지 않은 세포와 처리된 세포 사이에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 매우 높은 빈도가 관찰되었으며, 따라서 블레오마이신이 말초 림프구에서 DSB의 형성을 유도한다는 것을 확인했습니다(그림 2).
두 마커의 초점 수에서 큰 차이가 관찰되었습니다. 특히, γH2AX 병소는 53BP1 병소보다 더 많았으며, 따라서 공동 국소화가 항상 발생하는 것은 아니며 여러 요인에 의존할 수 있음을 나타냅니다(그림 3<...

이 프로토콜은 블레오마이신 처리된 인간 말초 림프구의 간기 핵에서 γH2AX 및 53BP1 병소의 동시 검출을 통해 DNA 이중 가닥 절단의 형성 및 복구를 평가하는 방법을 제시합니다.

인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

이 원고의 목적은 블레오마이신에 의해 인간 말초 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하기 위해 감마 H2AX와 53BP1 병소의 동시 정량화의 적합성을 평가하는 것이었습니다. 몇 가지 요인으로 인해 이중 가닥 파손이 발생할 수 있습니다. 따라서 세포에는 감마 H2AX와 53 결합 단백질 1을 모두 포함하는 여러 복구 메커니즘이 제공되어 이중 가닥 절단 근처에서 공동 국소화될 수 있습니다.전혈 샘플을 수집 한 후 300 밀리리터의 완전 배지가 들어있는 튜브에 4.7 마이크로 리터의 샘플을 추가합니다. 그런 다음 블레오 마이신 황산염 최종 농도 밀리리터 당 5 마이크로 그램을 첨가하십시오. 각 샘플에 대해 음성 대조군을 설정합니다.튜브를 섭씨 37도의 온도 조절기에 2시간 동안 넣습니다. 540G에서 5분 동안 원심분리기 샘플. 그런 다음 5 밀리리터의 저 삼투압 용액을 펠렛에 첨가하십시오.그런 다음 용혈을 일으키기 위해 400 마이크로 리터의 사전 고정 용액을 첨가하십시오. 540G에서 5분 동안 샘플을 원심분리한 다음 실온에서 5밀리리터의 메탄올에 펠릿을 최소 30분 동안 재현탁하여 세포를 고정합니다. 540G에서 5분 동안 샘플을 원심분리한 다음 5밀리리터의 고정 용액에 펠릿을 재현탁합니다.이 단계를 한 번 더 반복합니다. 540G에서 5분 동안 다시 원심분리한 다음 상청액을 흡인하여 펠릿을 재현탁하기에 충분한 용액을 남깁니다. 재현탁된 세포 펠릿을 슬라이드에 떨어뜨립니다.블로킹 용액에 용해된 항-감마 H2AX 및 항-53BP1 1차 항체를 포함하는 두 가지 용액을 준비합니다. 그 후 슬라이드를 PBS 1X로 2회 세척한다. 그런 다음 슬라이드를 차단 용액에 30 분 동안 보관하십시오.블로킹 용액에 용해된 1차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각을 각 슬라이드에 10 마이크로리터 첨가한다. 슬라이드를 파라 필름으로 덮으십시오. 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 배양합니다.배양 후, PBS 1X에서 5분 동안 3회 세척을 수행한다. 차단 용액에 용해된 DyLight 488 및 Alexa Fluor 568 2차 항체를 포함하는 두 가지 용액을 준비합니다. 이어서, 블로킹 용액에 용해된 2차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각을 10 마이크로리터씩 각 슬라이드에 첨가한다.슬라이드를 파라 필름으로 덮고 실온에서 2 시간 동안 배양합니다. 이러한 제2 배양 후, PBS 1X에서 5분 동안 3회 세척을 수행한다. 핵을 반대로 얼룩지게 하기 위해 조립하기 전에 덮개 슬립에 DAPI가 포함된 2.5마이크로리터의 Antifade 용액을 추가합니다.초점 동역학을 평가하기 위해 절차는 현재 설명된 것과 동일합니다. 마지막 단계는 초점의 관찰 및 정량화입니다. 감마 H2AX 및 53BP1 병소가 없는 인간 림프구는 A, B 및 C에 표시되며, 감마 H2AX 및 53BP1 병소의 양이 다른 인간 림프구가 표시됩니다.낮은 수준의 초점 공동 국소화가 관찰됩니다. 예상대로, 감마 H2AX와 53BP1 병소의 매우 높은 빈도가 처리되지 않은 세포 사이에서 관찰됩니다. 또한, 두 마커의 초점의 수에서 큰 차이가 관찰된다.시간 경과에 따른 감마 H2AX 및 53BP1 초점의 시간 경과는 동일한 기능에 기여하지만 다른 동작을 보였습니다. 감마 H2AX 및 53BP1 병소 분석은 노출 또는 병리학적 맥락에서 세포 반응을 평가할 수 있습니다. 그러나 감마 H2AX 및 53BP1 이중 면역 형광은 사건의 실제 빈도를 과소 평가할 수 있습니다.

dual-immunofluorescence-h2ax-53bp1-human-peripheral

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

γH2AX foci을 바탕으로 DNA 이중 가닥 나누기의 Quantitation는 조직 radiosensitivity 방사선 수정 화합물의 효과 평가를 위해, 특히 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 조직 샘플에서 γH2AX foci의 quantitation위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

DNA 이중 가닥의 휴식 시간에 대한 응답으로 빼앗아 - 139에서 H2AX의 인산화 다음 양식 γH2AX foci,의 현미경 분석 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기서 우리는 핵 내에서 방사선 유발 γH2AX 형성의 공간적 분포를 평가하기 위해 적극적으로 속기 euchromatin의 epigenetic 마커로 라이신 4 모노 - methylated 히스톤 H3에 항체를 사용합니다.

이온화 방사선 다음 γH2AX의 공간적 분포 평가

이 비디오에서는 인간 단핵 세포의 DNA 이중 가닥 절단 부위에 국한된 특정 DNA 손상 반응 단백질을 검출하는 면역형광 현미경 검사 기술에 대해 설명합니다. 단백질은 특정 1차 항체에 의해 인식되며, 이 항체는 다시 현미경 시각화 중에 형광을 발하는 형광단 표지된 2차 항체에 결합하여 단백질을 세포핵 내에서 뚜렷한 형광 병소로 시각화할 수 있습니다.

DNA Double-Strand Break 분석을 위한 면역형광 현미경 검사

이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 확립되지 않았다. 이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 면역 형광 염색에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 포시 (RIF)를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다.

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

이 프로토콜은 말초 혈액 림프구에 대한 γ-H2AX 포시 분석의 슬라이드 준비 및 자동 채점을 제공합니다. 분석의 방법 및 민감도를 설명하기 위해, 격리된 림프구는 시험관내에서조사되었다. DNA DSB 검출의 이 자동화된 방법은 빠르고 높은 처리량 생물학 도시법 응용에 유용합니다.

인간 말초 혈액 림프구의 γ-H2AX 포시 분석에 대한 자동화된 현미경 채점 방법

여기에서는 DNA 손상 부위에서 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다.

DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

배우세요 블레오마신 처리된 인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1 포커를 동시 검출하여 DNA 이중 가닥 절단의 형성과 복구를 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 유전체 손상 정량화에 유용합니다.

인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광

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