인간 말초 림프구에서 γH2AX 및 53BP1의 이중 면역형광

이 원고의 목적은 블레오마이신에 의해 인간 말초 림프구에서 유도된 게놈 손상을 평가하기 위해 감마 H2AX와 53BP1 병소의 동시 정량화의 적합성을 평가하는 것이었습니다. 몇 가지 요인으로 인해 이중 가닥 파손이 발생할 수 있습니다. 따라서 세포에는 감마 H2AX와 53 결합 단백질 1을 모두 포함하는 여러 복구 메커니즘이 제공되어 이중 가닥 절단 근처에서 공동 국소화될 수 있습니다.

전혈 샘플을 수집 한 후 300 밀리리터의 완전 배지가 들어있는 튜브에 4.7 마이크로 리터의 샘플을 추가합니다. 그런 다음 블레오 마이신 황산염 최종 농도 밀리리터 당 5 마이크로 그램을 첨가하십시오. 각 샘플에 대해 음성 대조군을 설정합니다.

튜브를 섭씨 37도의 온도 조절기에 2시간 동안 넣습니다. 540G에서 5분 동안 원심분리기 샘플. 그런 다음 5 밀리리터의 저 삼투압 용액을 펠렛에 첨가하십시오.

그런 다음 용혈을 일으키기 위해 400 마이크로 리터의 사전 고정 용액을 첨가하십시오. 540G에서 5분 동안 샘플을 원심분리한 다음 실온에서 5밀리리터의 메탄올에 펠릿을 최소 30분 동안 재현탁하여 세포를 고정합니다. 540G에서 5분 동안 샘플을 원심분리한 다음 5밀리리터의 고정 용액에 펠릿을 재현탁합니다.

이 단계를 한 번 더 반복합니다. 540G에서 5분 동안 다시 원심분리한 다음 상청액을 흡인하여 펠릿을 재현탁하기에 충분한 용액을 남깁니다. 재현탁된 세포 펠릿을 슬라이드에 떨어뜨립니다.

블로킹 용액에 용해된 항-감마 H2AX 및 항-53BP1 1차 항체를 포함하는 두 가지 용액을 준비합니다. 그 후 슬라이드를 PBS 1X로 2회 세척한다. 그런 다음 슬라이드를 차단 용액에 30 분 동안 보관하십시오.

블로킹 용액에 용해된 1차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각을 각 슬라이드에 10 마이크로리터 첨가한다. 슬라이드를 파라 필름으로 덮으십시오. 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 배양합니다.

배양 후, PBS 1X에서 5분 동안 3회 세척을 수행한다. 차단 용액에 용해된 DyLight 488 및 Alexa Fluor 568 2차 항체를 포함하는 두 가지 용액을 준비합니다. 이어서, 블로킹 용액에 용해된 2차 항체를 함유하는 2개의 용액 각각을 10 마이크로리터씩 각 슬라이드에 첨가한다.

슬라이드를 파라 필름으로 덮고 실온에서 2 시간 동안 배양합니다. 이러한 제2 배양 후, PBS 1X에서 5분 동안 3회 세척을 수행한다. 핵을 반대로 얼룩지게 하기 위해 조립하기 전에 덮개 슬립에 DAPI가 포함된 2.5마이크로리터의 Antifade 용액을 추가합니다.

초점 동역학을 평가하기 위해 절차는 현재 설명된 것과 동일합니다. 마지막 단계는 초점의 관찰 및 정량화입니다. 감마 H2AX 및 53BP1 병소가 없는 인간 림프구는 A, B 및 C에 표시되며, 감마 H2AX 및 53BP1 병소의 양이 다른 인간 림프구가 표시됩니다.

낮은 수준의 초점 공동 국소화가 관찰됩니다. 예상대로, 감마 H2AX와 53BP1 병소의 매우 높은 빈도가 처리되지 않은 세포 사이에서 관찰됩니다. 또한, 두 마커의 초점의 수에서 큰 차이가 관찰된다.

시간 경과에 따른 감마 H2AX 및 53BP1 초점의 시간 경과는 동일한 기능에 기여하지만 다른 동작을 보였습니다. 감마 H2AX 및 53BP1 병소 분석은 노출 또는 병리학적 맥락에서 세포 반응을 평가할 수 있습니다. 그러나 감마 H2AX 및 53BP1 이중 면역 형광은 사건의 실제 빈도를 과소 평가할 수 있습니다.